外源基因的表面展示.ppt

马永平,重庆医科大学基础医学院分子生物学教研室,外源基因的表面展示,The Surface display of foreign gene,第十三章 专题讲座一,一、什么是表面展示技术? (Whats surface display technic?),表面展示技术(surface display technic)是一种将外源肽或蛋白质与噬菌体、细菌或杆状病毒表面特定蛋白质融合表达并展示在其表面的技术，主要用于构建蛋白质或多肽文库，并从中筛选出感兴趣的蛋白质、多肽或抗体等，它在抗体制备、蛋白质相互作用研究、活菌疫苗和生物催化剂研究方面有广泛的应用前景。,二、操作程序(procedure),随机核苷酸片段 淋巴细胞总mRNA cDNA 构建重组噬菌体感染大肠杆菌筛选(亲和吸附洗脱扩增 继续3-4轮),三、表面展示系统分类 (surface display system taxonomy),噬菌体表面展示系统 细菌表面展示系统 真核表面展示系统,（一）噬菌体表面展示系统 (phage surface display system),噬菌体表面展示（phage display）是将外源蛋白通过与噬菌体外壳蛋白融合表达在噬菌体颗粒表面的一种技术 特点：.在噬菌体表面可随机表达特定长度的外 源肽段 .可用亲和吸附技术筛选和富集含有与特 异靶分子结合的噬菌体克隆 .外源肽可以保持相对独立的空间结构和 生物活性,1. 丝状噬菌体系统,常见的丝状噬菌体有M13、fd、f1等。 M13是大肠杆菌的丝状噬菌体,基因组为6407bp的闭合环状+ssDNA,感染雄性大肠杆菌后,ssDNA转变成dsDNA(复制型),很容易从细胞中分离和基因工程改造及操作. 用于表面展示的基因主要有次要外壳蛋白基因pIII(3-5个/virion)和主要外壳蛋白基因pVIII (3000个/virion).,图1. M13 噬菌体表面展示系统图示,fg,1. PV展示系统,PV基因编码噬菌体的主要尾部蛋白,6个PV蛋白组成一个盘状亚单位,32个盘状结构组成管状尾部.PV的C端折叠区是病毒的非必需区,可供外源基因的插入和替换,有人已经成功地展示了有活性的 -半乳糖苷酶(465kD).,2. D蛋白展示系统,D蛋白是噬菌体的头部组装的必需蛋白质,但当噬菌体基因组小于野生型基因组的82%时,它可以在缺少D蛋白的情况下完成组装,因此,D蛋白基因的N端也可融合外源蛋白.,2. 颗粒状噬菌体展示系统,pv,D 蛋白,图2. 外源蛋白在噬菌体表面展示部位图示,例1.表面展示系统在疫苗研究,1.可以直接用多抗来鉴定抗原决定簇,并参考这些肽的结构信息设计新的疫苗. 2.利用合成的抗原决定簇库,钓出噬菌体表位,而无需考虑该抗原是否已知.只要它是疾病特异的,并带有诱导机体产生中和抗体的中和决定簇,就可以用于疫苗设计. 3.噬菌体可以作为疫苗载体.如有人已经用HBV单抗从15肽库中筛选出HBsAg的模拟表位,该噬菌体表位能被HBV患者的血清识别,并能在小鼠体内诱导出抗HBV抗体.提示特异特异的噬菌体表位可以作为疫苗和诊断性试剂.,（二） 细菌表面展示系统 (bacteria surface display system),细菌表面展示(Bacteria surface)是用基因重组方法将外源蛋白或多肽与细菌表面蛋白融合，以正确的构象和方向插入并停舶在细菌外膜，功能性地表达在细菌的表面的技术。 .革兰阴性菌表面展示系统 (1) 外源基因与E.coli的外膜蛋白A（OmpA）等跨膜蛋白融合 OmpA以折叠多次跨膜，有多个暴露在膜外的肽段可作为替换的位点。 （）外源基因与菌毛或鞭毛蛋白融合,如型菌毛的第-和第-位氨基酸残基位于菌毛表面等。,（二）细菌表面展示系统（续）,.革兰阳性菌表面展示系统 （）将外源基因与葡萄球菌融合. （）将外源基因与化脓性链球菌纤丝表面蛋白融合.,SPA:存在于细胞壁表面的单链多肽与肽聚糖共价连接。 M蛋白:存在于A型链球菌的细胞壁中,也是人体肾小球基地膜有共同抗原,具有抗吞噬和吞噬细胞内的杀菌作用。,性菌毛,鞭毛,普通菌毛,外膜蛋白,质粒,图3.细菌表面展示模式图,A：表达载体 B：融合基因表达产物scFV-ABP-XM锚定在细胞表面。 PSpA：SpA的启动子基因. 。ABP ：白蛋白结合位点。,VH,VL,ABP,X,M,S,bla,cat,OriS,OriE,pSEIgEABPXM 8.1kb,PSPA,scFv,ABP,X,M,CW,A,B,（三）真核表面展示系统 (eucaryotic surface display system),.酵母表面展示系统 .杆状病毒表面展示系统,特点:1.能够表达需要糖基化等翻译后加工才表现出活性的真核蛋白质. 2.具有真核蛋白充分折叠所需的折叠酶和分子伴娘及内质网等加工系统.,酵母,Aga1,S,S,S,S,Aga2,725aa,69aa,Foreign protein,凝集素,1.酵母展示系统 （yeast display system ）,主要利用酵母凝集素识别亚基的C端连接外源基因，见下图所示，外源蛋白可分离纯化。,图6.酵母结合生殖的动态图示,（1）特征：AcMNPV（Autograph california multiple nuclear polyherosis virus）为环状dsDNA, 129.8kb,感染昆虫脂肪体等细胞的细胞核,并形成多角体，图A。,细胞核,细胞膜,2.杆状病毒展示系统 (baculovirus display system),（2）外源基因插入位点：有Ocu（多角体）蛋白基因; P10蛋白基因; GP64（主要外膜糖蛋白）基因。图B。,ocu,GP64,病毒粒子,A,B,图6.杆状病毒表面展示图示,四、小结(summary),1.表面展示技术由smith等于1985年首先在噬菌体中建立，现已发展成噬菌体、细菌、酵母和杆状病毒四大系统。 2.表面展示技术已经在蛋白质结构分析,抗原表位分析