IL12+重组卡介苗对新生期小鼠脾脏T细胞功能亚群发育的影响.doc

IL12+重组卡介苗对新生期小鼠脾脏T细胞功能亚群发育的影响作者：何云,刘恩梅*,杨锡强,李欣,刘玮【摘要】目的:研究IL12+重组BCG新生期接种对小鼠脾脏T细胞功能亚群发育的影响。方法:新生清洁级BALB/c小鼠24只,分对照组、BCG组和IL12+重组BCG组。新生期接种,4周后取脾细胞用流式细胞术检测CD3+CD8+IFN+、CD3+CD8-IFN+、CD3+CD8+IL+、CD3+CD8-IL+、CD4+Foxp3+T细胞的比例,其分别代表Tc1、Th1、Tc2、Th2和调节性T细胞亚群。结果:BCG组、IL12+重组BCG组Th1、Tc1细胞比例明显高于对照组（P<；0.05或P<；0.01）,BCG组与IL12+重组BCG组比较没有统计学意义；Tc2、Th2和调节性T细胞比例各组间比较没有统计学意义；二接种组Th1/Th2、Tc1/Tc2和总IFN/IL4比值明显高于对照组（P<；0.05或P<；0.01）；CD4+Foxp3+T细胞比例各组间比较没有统计学意义(P>；0.05)。结论:新生期BCG和IL12+重组BCG接种组接种均能促进Th1、Tc1细胞亚群的发育,提高Th1/Th2、Tc1/Tc2比值,但不能影响CD4+FoxP3+Treg细胞的比例。【关键词】卡介苗白细胞介素12T细胞亚群调节性T细胞AbstractAIM:ToexploretheeffectsofrecombinantBalillusCalmetteGuerinsecretingIL12onthedevelopmentofspleenTcellsubsetsofneonatalBALB/cmice.METHODS:TwentyfourneonatalBALB/cmicesweredivided3groups:Control,BCG,rBCGgroups,whichinoculatedwithBCGandrBCGintraperiotoneallywithin2-3daysafterbirth.Fourweekslater,spleencellsofmicewereisolatedandthepercentageofCD3+CD8+IFN+/CD3+CD8IFN+/CD3+CD8+IL+/CD3+CD8-IL+/CD4+Foxp3+Tcells,whichrepresentTc1/Th1/Tc2/Th2/Tregcellsrespectivelyweredetectedbyflowcytometryatsinglecellslevel,andTh1/Th2,Tc1/Tc2ratiowerecalculated.RESULTS:ThepercentagesofTh1,Tc1cellofBCGvaccinatedmice,rBCGvaccinatedmiceweresignificanthigherthancontrolmice(P<；0.01),andtherewasnodifferencebetweenthetwovaccinatedgroups.TheratioofTh1/Th2,Tc1/Tc2andtotalIFN/ILoftwovaccinatedgroupswerehigherthancontrolgroup.ThepercentagesofTregcellswerenodifferenceamongthethreegroups(P>；0.05).CONCLUSION:NeonatalBCGandrBCGvaccinationcansignificantlyincreaseTc1andTh1cellsandTh1/Th2,Tc1/Tc2ratioinspleencells.NeonatalBCGandrBCGvaccinationmayhaveansameeffectsondevelopmentofTcellsubsetsinneonatalBALB/cmice.ThepercentageofCD4+Foxp3+Tcellsamongthreegroupswerenosignificantdifference.Keywordsbacilluscalmetteguerin；interleukin12；Tcellssubsets；regulatoryTcell卡介苗（bacilluscalmetteguerin,BCG）可通过诱导Th1/Tr免疫应答而保护哮喘,我们前期研究发现呼吸道合胞病毒（respiratorysyncytialvirus,RSV）能逆转新生期BCG接种的抗哮喘作用,其机制尚不清楚1,2。IL12是Th1分化发育的关键细胞因子。皮下注射重组IL12能减少哮喘患者嗜酸性粒细胞水平,但降低气道高反应性的作用不明显,也不能改善随后的哮喘症状,并有严重的副作用3。我们将IL12与BCG重组后能避免直接使用重组IL12的副作用,又能增强BCG的Th1/Tr应答,并分别以CD3+CD8+IFN+、CD3+CD8-IFN+、CD3+CD8+IL4+、CD3+CD8-IL+、CD4+Foxp3+T细胞代表Tc1、Th1、Tc2、Th2及T调节性细胞水平,在单细胞水平观察IL12+重组BCG在新生期接种对小鼠脾脏细胞亚群发育的影响。1材料和方法11材料清洁级BALB/c小鼠购自重庆医科大学实验动物中心,饲养于专用消毒饲养盒内,恒定室温。过滤空气,饲料、水皆经消毒处理,更换饲料等操作在超净台内进行。新生23d小鼠共24只,分为对照组、BCG组和IL12+重组BCG接种组,每组8只。BCG组给以BCG(上海生物制品研究所,批号2005030211,购于重庆市渝中区疾控中心)1105CFU/只腹腔、皮下联合注射；IL12+重组BCG以rBCG1105CFU/只腹腔、皮下联合注射；生后满4周无菌取脾脏进行流式细胞仪检测。1.2方法121IL12+重组BCG的构建及鉴定先构建表达IL12的穿梭质粒,并将其转化入BCG(本部分实验由重庆医科大学微生物教研室完成)。122胞内细胞因子（IFN、IL）的流式检测无菌取脾,在300目不锈钢网上少量PBS冲洗下轻轻研磨制成单细胞悬液,RBC裂解液裂解红细胞,PBS洗2次,细胞悬浮与RPMI1640（含100mL/LFBS）,调整细胞密度为2109/L,台盼兰染色计数活细胞数在95%以上。取1mL脾细胞（2109/L加入7.5L1mg/L佛波酯(PMA)工作液、6L50mg/L离子霉素(Ionomycin)工作液、1000U/LBDGolgiStopTM蛋白转运抑制剂（内含Monensin2.0mol/L终浓度）,混匀,3750mL/LCO2培养箱培养6h,PBS洗2次,加入0.75gRatantimouseCD3:PECy5、1.5gRatantimouseCD8FITC(荧光抗体均为BDParmigen公司产品,下同),室温避光孵育15min,分成3管,每管100L已染色的脾细胞,加入500LFixperm中的固定液室温避光孵育15min,再加入100LFixperm中溶血破膜液,1200r/min,洗2次,加100L大鼠血清封闭30min,同时分别加入RatIgG1controlPE、RatantimouseIFNPE、RatantimouseIL4PE0.5g室温避光孵育15min；PBS洗2次,0.5mLPBS重悬细胞上机检测(流式细胞仪型号BectonDickinson,USA)。123胞内转录因子FoxP3的流式检测取1106细胞,分别加入RatantimouseCD4PECy5(BDParmigen),混匀避光孵育20min,用细胞染色缓冲液洗1次,加1mL1Foxp3Fix/Perm缓冲液(Biolegend)混匀,室温避光孵育20min,离心弃上清,1Foxp3Perm缓冲液(Biolegend)洗2次,用1Foxp3Perm缓冲液重悬细胞,室温避光孵育15min,离心弃上清,用1foxp3Perm缓冲液重悬,分成2管,分别加入5L(1g)AlexaFluor488RatantimouseFOXP3、AlexaFluor488RatantimouseIgG（作为对照抗体）(Biolegend)室温避光孵育30min,用细胞染色缓冲液洗2次,用0.5mL细胞染色缓冲液重悬细胞上机分析。124统计学分析所有数据采用SPSS13.0统计软件分析,各组检测结果均以xs表示,先进行方差齐性检验,方差齐者各组样本均数间的比较采用LSDt检验,P<；0.05为差异有统计学意义。2结果21脾细胞胞内IFN的检测BCG组、重组BCG组Th1、Tc1及总IFN明显高于对照组（P<；0.05或P<；0.01,表1）,差异具有统计学意义；但二组间比较没有区别,差异无统计学意义(P>；0.05),表明BCG和重组BCG于新生期接种皆能诱导Th1、Tc1亚群发育。表1各组胞内IFN检测分析（略）Tab1AnalysisofintracellularIFNamongallgroupsaP<；0.05,bP<；0.01vscontrolgroup.2.2脾细胞胞内IL4的检测各组Th2、Tc2及总IL4水平之间差异无统计学意义（P>；0.05,表2）。表2各组胞内IL4检测分析（略）Tab2AnalysisofintracellularIL4amongallgroups2.3Th1/Th2、Tc1/Tc2及IFN/IL比值BCG组、rBCG组Th1/Th2、Tc1/Tc2及总IFN/IL比值明显高于对照组（表3）。表3各组Th1/Th2、Tc1/Tc2及IFN/IL比值变化（略）Tab3ChangesoftheratioofTh1/Th2、Tc1/Tc2、totalIFN/ILamongallgroupsaP<；0.05,bP<；0.01vscontrolgroup.24CD4+FoxP3+T细胞在小鼠脾细胞中的表达对照组、BCG组及rBCG组脾细胞中CD4+FoxP3+T细胞数分别为（8.32.4）%、（9.23.2）%和（9.73.4）%,各组间比较无统计学差异（P>；0.05）。3讨论BCG通过能诱导Th1免疫应答而防止哮喘的发生4,5,但对人类哮喘的预防作用存在争议6。我们前期研究发现,新生期皮下接种BCG后不仅能促进Th1免疫功能成熟的作用,而且能通过诱导Tr1发挥抗哮喘作用1；早期接种BCG能抑制致敏原诱发的嗜酸性粒细胞炎症、支气管周围炎症和气道高反应性；但作为诱发或加重小儿哮喘最常见的危险因素之一RSV能逆转新生期BCG接种的抗哮喘作用2,其机制尚不清楚。如何增强BCG诱导Th1/Tr作用,使其能有效抵抗RSV干扰、预防哮喘发生,值得进一步的研究。IL12主要由DC和巨噬细胞产生,能够促进Th1分化发育,诱导CD4+/CD8+T细胞、NK细胞、NKT细胞等产生IFN,是衔接天然免疫和特异性免疫的关键细胞因子。皮下注射重组IL12能减少哮喘患者嗜酸性粒细胞水平,但降低气道高反应性的作用不明显,也不能改善随后的哮喘症状,并有严重的副作用3。但IL12重组乳酸菌却能明显的逆转哮喘小鼠Th1/Th2失衡,降低气道高反应性,减轻气道炎症7,8。提示将IL12与某些细菌载体重组,使其在免疫应答的局部产生免疫调节作用且可避免其副作用。由此,我们将IL12与BCG重组以避免直接使用重组IL12的副作用又能增强BCG的Th1/Tr应答。本研究中我们在单细胞水平分析了rBCG新生期接种对小鼠脾脏T细胞亚群的影响,结果表明小鼠新生期接种BCG和rBCG均能引起明显的Th1、Tc1细胞比例增加,表现为CD3+CD8-IFN+、CD3+CD8+IFN+T细胞比例的增加,说明新生期接种BCG和rBCG均能促进小鼠Th1、Tc1细胞亚群的发育。调节性T细胞包括CD4+CD25+调节性T细胞、以分泌高水平IL10为特征的Tr1和以分泌高水平TGF为特征的Th3细胞,其中FoxP3是CD4+CD25+调节性T细胞发育和功能中关键转录因子,CD4+FoxP3+细胞可以代表绝大多数具有调节/抑制功能的T淋巴细胞9。与我们以前的结果相似10,本研究结果表明新生期接种BCG和rBCG并不能诱导脾脏产生更多的CD4+FoxP3+的调节性T细胞亚群。由于没有对CD4+FoxP3+T细胞的功能进行深入的研究,并不排出新生期接种BCG后其功能有所变化。但BCG和rBCG组各个指标没有明显差异,重组后的rBCG并没有达到预期效果。我们考虑与以下因素有关:一是与IL12重组质粒在体内分泌IL12不足,不足以影响机体整体免疫应答,二是目前检测手段还不能区别二组差异。还需进一步研究rBCG在体内的功能。综上所述,新生期接种rBCG能促进小鼠脾脏Th1、Tc1细胞亚群的发育,提示在婴幼儿早期阶段接种rBCG能促进个体免疫系统的成熟,向Th1、Tc1方向发育,为在婴幼儿早期阶段应用rBCG来预防变态反应性疾病的发生提供一定的理论基础。【参考文献】1李睿,刘恩梅,杨锡强,等.卡介苗新生期接种和呼吸道合胞病毒感染对小鼠实验性哮喘的联合作用J.中华儿科杂志,2006,44(6):420-424.2LiR,YangX,WangL,etal.RespiratorysyncytialvirusinfectionreversedantiasthmaeffectofneonatalBacillusCalmetteGuerinvaccinationinBALB/cmiceJ.PediatrRes,2006,59(2):210-215.3BryanSA,OConnorBJ,MattiS,etal.Effectsofrecombinanthumaninterleukin12oneosinophils,airwayhyperresponsiveness,andthelateasthmaticresponseJ.Lancet,2000,356(9248):2149-2153.4SmitJJ,FolkertsG,NijkampFP.Mycobacteria,genesandthehygienehypothesisJ.CurrOpinAllergyClinImmunol,2004,4(1):57-62.5BarlanI,BahcecilerNN,AkdisM,etal.BacillusCalmetteGuerin,Mycobacteriumbovis,asanimmunomodulatorinatopicdiseasesJ.ImmunolAllergyClinNorthAm,2006,26(2):365-377.6OmarMT,AhmedSH,SarkisNN.Astudyoftheassociati