同型半胱氨酸相关机理研究综述.docx

同型半胱氨酸分子生物学机理、临床致病机理同型半胱氨酸（Hcy）来源于饮食摄取的蛋氨酸(甲硫氨酸)，是甲硫氨酸循环中S-腺苷同型半胱氨酸水解反应后的产物，同时，又是胱硫醚合成酶合成胱硫醚的底物1,2。血液中Hcy以三种形式存在，1%为还原状态的Hcy，70%-80%与蛋白结合，其余是Hcy二硫化物3,4。一、分子生物学机理 血浆Hcy的水平取决于遗传和环境两方面因素，其中遗传因素为编码Hcy代谢关键酶基因的突变，目前仅在叶酸及Hcy代谢过程方面，共发现了上万种SNPs，其中有一些会影响叶酸及Hcy的代谢8,9：1、亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）MTHFR基因位于染色体1P36.3。MTHFR C677T（rs1801133）位于MTHFR的外显子区，最早Kang等在芝加哥的研究发现，低活性、不耐热的MTHFR与血浆中Hcy水平升高相关，也与冠心病发病有明显联系5，之后Frosst等人6又分析证明了由于MTHFR基因在677位发生错义突变，碱基T置换了C，编码的丙氨酸由缬氨酸取代，使酶的耐热性和活性都大大降低（50-60%）8,9，从而影响Hcy再甲基化，导致血浆Hcy水平升高。基因型分析也证明MTHFR基因纯合突变者(+/+)和杂合突变者(+/)，其血浆Hcy水平高于非突变的正常人7。rs3737965位于MTHFR启动子区域，可能会影响下游基因转录的效率。其杂合型人体Hcy水平较低（无统计学意义），纯合型个体Hcy水平较高，且具有统一学差异（样本量小，容易造成假阳性），同时发现其杂合型与低水平Hcy有关8。2、胱硫醚合成酶（CBS）CBS位于人类21号染色体上（21q22.3），CBS主要存在于大脑的中枢神经系统和部分血管内皮细胞中3,10,11,12。目前已发现的CBS基因突变位点有64个，其中最常见的是位于278密码子的T833C和307密码子的G919A，两者均位于第8个外显子中，但也有研究表示，此位点突变率很低，仅为1%17,18。另外有研究发现，其844ins68、C699T、T1080C位点的突变与高同型半胱氨酸血症密切相关17,18。CBS基因突变可能影响了CBS亚单位与血红素和5-磷酸-吡哆醇的相互作用，从而使酶活性降低进一步导致高同型半胱氨酸血症3。CBS G9191A（rs121964962）位点的多态性使得第307位甘氨酸变为丝氨酸10,11,12，影响Hcy与酶的结合17,18，此位点突变可能会导致高同型半胱氨酸血症，并且与脑卒中密切相关15。CBS T833C位点的突变，位于外显子8，引起其第287位的异亮氨酸取代了苏氨酸，使酶与PLP（蛋白脂蛋白）不能结合，患者对维生素B6敏感19。突变者中风风险增高，且在中国人群中较为显著15。CBS844ins68位点的突变常见于西方人群，且对Hcy浓度的影响程度较受争议，多数观点认为无影响，亦有观点认为有影响17,18。C699T位于第5 外显子，C1080T位于第10外显子，这两个位点均属于同义突变，不引起氨基酸的改变，但是该位点常与转录上游区某些可影响酶蛋白表达的变异位点连锁。有研究表明这两种突变对Hcy水平升高无关，并有研究指出他们可能均为良性突变，可降低Hcy浓度24,25。rs234 713位于CBS的内含子区，该多态性导致G到A的改变，但与Hcy的代谢的关系，并未得到深入研究，有研究发现，其杂合突变显著降低Hcy水平8,9。rs2851391位于CBS的内含子区，该多态性导致C到T的改变，纯合突变显著升高Hcy水平3、甜菜碱同型半胱氨酸甲基转移酶（BHMT）rs3733890位于BHMT的外显子区，此突变会导致谷氨酰胺变为精氨酸，此位点突变可能不会影响其蛋白的二级结构，对折叠及后续蛋白功能影响不大，对酶的活性不能产生明显影响8，94、胱硫醚裂解酶（CSE）or CHTCSE的编码基因位于1号染色体p31.1，CSE主要存在心脏、肝脏、肾脏及血管平滑肌细胞中，血管内皮细胞中也存在少量CSE10,11,12。在其第12外显子处存在常见的错义突变为G1364T（rs1021737），该多态使CSE基因编码的第403位氨基酸由丝氨酸变为异亮氨酸10,11,12,16。同时加拿大的一项研究发现，此位点的突变使人群血浆总同型半胱氨酸升高，且纯合突变者Hcy浓度明显高于其他基因型患者16。CSE基因的另一个SNP rs482843位于CSE基因的启动子区，是RNA聚合酶特异性识别和结合的DNA序列，控制基因表达的起始时间和程度，它本身不控制基因活动，通过与转录因子结合控制基因的活动。研究表明基因的启动子突变，将导致基因表达的调节障碍，因此它的结构变化直接关系到转录效率，从而导致后续的翻译效率受损。关于CSE基因的SNPrs482843突变与疾病的关联目前少有研究，突变主要是碱基突变，426位的等位基因A突变为G10,11,12。5、次甲基四氢叶酸脱氢酶(MTHFD)MTHFD在四氢叶酸一碳单位交换的三个连续反应中起催化作用，MTHFD基因缺陷可能会影响酶活性，妨碍叶酸代谢，使Hcy再甲基化途径受阻，导致Hcy积累。人类MTHFD基因编码了一种单一的蛋白，具有三种酶的活性（5,10亚甲基四氢叶酸脱氢酶，5,10次甲基四氢叶酸环式水解酶，10甲酸四氢叶酸合成酶），这三种酶在叶酸代谢中起着重要的作用，MTHFD基因也被认为是神经管畸形的候选基因。MTHFD基因定位于14q24，编码935个氨基酸。已知人类MTHFD基因突变有G878A和G1958A。G878A型突变在研究实验中很少被检出。G1958A（rs2236225）突变可导致653位编码的精氨酸变换为谷氨酸，。由于改密码子编码的氨基酸位于酶活性区域，因此推测该位点突变可能通过改变蛋白质的二级结构，使MTHFD酶活性升高，从而使叶酸转化为四氢叶酸增加。在荷兰、土耳其等西方人群的研究显示，此位点在人群中的突变率为50%左右，杂合型比例较高；而中国人群的突变率明显低于西方人群，25%左右。研究未显示，突变者的Hcy水平受到影响26,27,286、磷脂酰乙醇胺-N-甲基转移酶(PEMT)PEMT的酶活性主要在肝脏内完成，PEMT能够在腺苷甲硫氨酸提供甲基的情况下催化磷脂酰乙醇胺合成磷脂酰胆碱，生成的磷脂酰胆碱主要用于维持体内胆碱平衡，同时腺苷甲硫氨酸生成腺苷同型半胱氨酸，进而生成Hcy29,30,31。在PEMT基因敲除小鼠中，血浆Hcy浓度下降50%。当PEMT基因过度表达时，Hcy水平增加40%，可以认为PEMT基因在甲基代谢调控方面具有一定作用30，31。但在另一项对PEMT基因敲除动物模型的研究发现,PEMT基因缺失的纯合子小鼠肝脏不能表达任何PEMT活性,即使通过饮食补充胆碱,也不能获得正常体内需要的胆碱代谢产物,最终发展至脂肪肝32,33。PEMT G774C位点位于编码该基因的启动子区域，该位点多态性引起人体对膳食甲基供体胆碱的需要量增加，可增高胆碱缺乏引起的器官功能障碍，如脂肪肝、肝损伤、肌肉损伤的发生风险。研究显示，GC及CC突变型具有较高的胆碱水平和较低的Hcy水平，而胆碱可以通过氧化成甜菜碱，参与体内的甲基化反应，因此推测其突变为有利突变，可能是该突变抑制了PEMT的活性30,31。PEMT G175A位点的多态性也较常出现，该位点的变异导致氨基酸置换，从而引起部分编码PEMT活性缺失32,33。PEMT活性下降，磷脂甲基化减少，Hcy含量也可能随之下降29二、临床致病机理Hcy可能通过各种机制致病1、 内皮细胞损伤及功能异常Hcy对血管内皮有直接的细胞毒素作用，Hcy血症可削弱血管内皮细胞NO的生物活性，导致内皮损害29。Hcy与内皮来源的NO反应生成S-亚硝基-Hcy，后者具有强烈的扩张血管和抗血小板功能，而在高同型半胱氨酸血症时，由NO介导的内皮依赖性血管舒张功能明显受损3。Hcy可通过氧化应激导致内皮功能障碍，细胞实验(1986年)表明，Hcy对培养的内皮细胞所产生的毒性作用可被过氧化氢酶所抑制。高同型半胱氨酸血症的大鼠体内血小板聚集性和组织因子活性增强的同时，其血液中脂质过氧化的产物水平也升高。这些都提示氧化机制是Hcy致病的关键。Hcy可能通过产生的一系列活性氧中间产物(超氧化物阴离子自由基，过氧化氢，羟基等)抑制了NO的合成并促进其降解，从而导致血管功能异常2,3。在动物和人类颅外血管的试验中发现，氧化和氮化应激反应对减少NO的生物利用能力和内皮功能紊乱起到显著的作用。在有CBS缺乏的老鼠试验中显示，超氧化物的增加是脑部小动脉内皮功能紊乱的主要中介34。还有实验表明Hcy降低细胞内谷胱甘肽过氧化物酶的浓度，削弱了其阻止NO氧化失活的作用，增强了脂质过氧化物与过氧化氢的细胞损伤效应2,3。Hcy还可以改变内皮细胞基因表达，抑制内皮细胞DNA合成，促进内皮细胞凋亡。Hcy可刺激内皮细胞表达和分泌单核细胞趋化因子-1（MCP-1）和白细胞介素-8（L-8）。Hcy还能上调血管内皮损伤后动脉组织原癌基因c-fos及c-jun mRNA的表达，且呈浓度依赖性，c-fos、c-jun mRNA的表达随Hcy浓度的增高而增高，血管内皮球囊损伤的早期，血管壁组织原癌基因c-fos及c-jun mRNA的表达即明显上调。Hcy诱导的活性氧系列能通过还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶上调Ref-1基因的表达和易位。从而Ref-1增加了在人体单核细胞和巨噬细胞内NF-KB的活性和MCP-1的分泌，这些都会加速动脉粥样硬化的发生29。2、 刺激血管平滑肌细胞增生Hcy可激活蛋白激酶c，促进丝裂霉素激酶活化，并抑制蛋白激酶A，促进相关基因在血管平滑肌细胞（CSMCS）中的表达，使其增生并促进胶原合成。Hcy还可以促进细胞外Ca2内流和线粒体c释放，从而促进VSMCS增殖。Hcy能增加单核细胞白细胞介素6（IL-6）的释放，并能诱导细胞内核转录因子kB（NF-kB）的激活。同时c-fos、c-jun mRNA的表达随Hcy浓度的增高而增高，原癌基因c-fos及c-jun的表达产物活化后形成活性蛋白-1（A-1）,是细胞核内重要的转录因子，可激活细胞核DNA转录和核蛋白的合成，参与调控细胞增殖分化和转化等重要生物学行为；原癌基因c-fos及c-jun的转录产物还可介导多种细胞因子，尤其是生长因子的表达。这些就会启动损伤血管局部平滑肌细胞活化的自分泌、旁分泌机制，损伤动脉局部将有持续的血管平滑肌细胞过度增殖和分化，从而引起血管内皮损伤后新生内膜的过度增生而造成血管再狭窄29。3、 破坏机体凝血和纤溶的平衡Hcy破坏机体凝血和纤溶之间的平衡，导致血液流变血的异常，使黏稠的血液易于聚集，使血栓形成，使机体处于血栓前状态。Hcy通过抑制凝血酶调节蛋白在内皮细胞表面的表达及活性，进一步抑制蛋白C的激活，从而影响了对a、a和凝血酶的灭活，；Hcy还抑制AT-与内皮细胞的结合，并减弱内皮细胞表面硫酸肝素蛋白多糖对AT-的活化作用，从而抑制了AT-的抗凝活性。Hcy通过抑制二磷酸腺苷(ADP)酶的活性，增强了ADP对血小板的诱聚作用。Hcy抑制纤溶酶原激活物(t-PA)与血管内皮结合，减少纤溶酶的形成，从而干扰了内皮的纤溶活性。Hcy通过巯基内酯引起血栓素（TXB）和前列腺素（PGB2）的形成来影响血小板聚集和凝血因子的活性，激活凝血因子，等，从而促进血栓形成2,3,29。4、 影响脂质代谢脂质代谢方面，Hcy像其他硫氢化合物一样，能加强低密度脂蛋白(LDL)的自身氧化，导致内皮功能的进一步受损2。研究发现，Hcy的脱水产物硫化内酯具有高度活性，可引起动物体内甘油三酯，LDL和胆固醇合成增加，Hcy能加强低密度脂蛋白的自身氧化，并促进LDL聚集，易被泡沫细胞吞噬。而且氧化后的低密度脂蛋白能影响NO的合成和凝血酶调节蛋白的活性，导致内皮功能进一步受损。Hcy自身氧化放出的大量超氧化自由基可造成内膜受损，促进葡糖氨基糖苷（GSG）的硫化，激活弹性蛋白酶，诱发凝血，增加钙质沉积。Hcy所产生的氧化氢可以对LDL进行氧化修饰，LDL修饰以后形成的氧化LDL可以直接损伤血管内皮细胞，使内皮功能下降，还可以增加泡沫细胞的形成，促进动脉硬化的形成。5、参与免疫反应在动脉粥样硬化发生过程中，单核细胞、T细胞的趋化、聚集和黏附是动脉粥样硬化病变发生发展的关键步骤，在此过程中各种趋化因子和黏附分子等炎症因子的参与不可或缺，而Hcy能诱导血管局部的炎症细胞释放多种炎症因子，使血管局部功能损伤，进而发展成为动脉粥样硬化病变。Hcy能使人单核细胞，主动脉内皮细胞和平滑肌细胞的单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）表达增加，趋化活性增加，并且使前两者的MCP-1分泌也增多。Hcy上调MCP-1 mRNA的表达，同时，还刺激单核细胞表面MCP-1受体（CCR2）的mRNA及蛋白的表达。Hcy还能刺激人单核细胞系Mac6（MM6）及PBMC13产生自介素-6（IL-6），也可刺激大鼠血管平滑肌细胞产生IL-6。在长期素食造成的血浆高同型半胱氨酸情况下，也可见到可溶性血管细胞黏附因子-1（sVCAM-1）水平显著升高。Hcy选择性地引起体外中性粒细胞及人脐静脉内皮细胞的改变，导致两者间的黏附增强。Hcy促进中性粒细胞释放细胞内H2O2，并促进中性细胞迁移29,30。6、影响H2S的生成早期H2S曾被认为是一种无色具有臭鸡蛋味的毒性气体，然而在20世纪90年代，H2S被认为是继NO和CO后具有保护心血管系统作用的第三种气体信号分子。H2S在人体内起着重要的生物学作用，他在血管和神经体液平衡上的重要作用主要表现在：代谢调节、自由基、心脏保护、血管舒张、血管氧敏感、内皮保护、血管炎症、通气控制和神经调节等方面。体内生成硫化氢的过程主要通过酶催化过程和非酶催化过程，酶催化过程主要依赖CBS/CES。同型半胱氨酸可以通过甲基化途径生成S-腺苷甲硫氨酸，也可通过转硫化途径生成H2S。基因突变，导致CSE基因的启动子结构发生突变，影响CSE的活性，从而使代谢的H2S含量降低10,11。参考文献1.李健.同型半胱氨酸及临床意义.国外医学内科学分册.1999,26(3).2. 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