短发夹RNA沉默hTERT 基因抑制裸鼠皮下人脑胶质瘤生长的实验研究.doc

短发夹RNA沉默hTERT基因抑制裸鼠皮下人脑胶质瘤生长的实验研究作者：孙卫东于如同马衍刚【摘要】目的研究靶向人端粒酶逆转录酶（hTERT）的短发夹RNA（shRNA）对裸鼠人脑胶质瘤中hTERT基因表达的抑制作用，以及影响肿瘤增殖并诱导细胞凋亡的作用,为脑胶质瘤的基因治疗探讨新的依据。方法体外培养人脑胶质瘤U251细胞株，建立人脑胶质瘤裸鼠皮下接种模型。将成功造模的36只裸鼠随机分为3组（每组12只）。hTERTshRNA组肿瘤体内原位注射hTERT质粒shRNA（pshRNA）20g+脂质体60l+PBS；PBS组肿瘤体内原位注射PBS150l；空质粒组肿瘤体内原位注射空质粒20g+脂质体60l+PBS。观察肿瘤生长情况。苏木精-伊红染色观察肿瘤组织的病理改变，Westernblot检测hTERT蛋白的表达，钙依赖性磷脂结合蛋白V+碘化丙啶双染流式细胞仪测凋亡率。结果成功建立稳定的裸鼠U251细胞皮下移植瘤模型。治疗5周后hTERTshRNA组肿瘤体积较PBS组和空质粒组明显缩小，抑瘤率为58.2%；病理学检查hTERTshRNA组肿瘤生长受到抑制，肿瘤细胞散在稀疏，可见大量肿瘤细胞坏死及凋亡；Westernblot示hTERTshRNA组hTERT蛋白表达受抑制；流式细胞仪检测hTERTshRNA组肿瘤细胞凋亡率明显高于PBS组和空质粒组（P<；0.01）。结论hTERTshRNA可在裸鼠移植瘤体内有效发挥作用，抑制人端粒酶逆转录酶蛋白在体内表达，从而能有效抑制裸鼠胶质瘤增殖生长,促进肿瘤细胞凋亡。【关键词】徐州医学院附属医院神经外科，江苏徐州221002Abstract：ObjectiveToexploretheinhibitoryeffectofsilencinghumantelomerasereversetranscriptase(hTERT)genesshorthairpinRNAs(shRNAs)onthegrowthofhumangliomainnudemicebyRNAinterferencetechniquetoaffordanexperimentalbasisforconcernedgenetherapyofglioma.MethodsHumangliomaU251cells,culturedinvitro,wereusedtoestablishmodelsofhumangliomabysubcutaneousinjectionintonudemice.The36mousemodelsformedweredividedinto3groupsforvariedpurposes(n=12each):thehTERTshRNAtherapygroupwasgiveninsituinjectionofhTERTshRNADplamid(pshRNA)20g+lipid60l+PBS；thePBSgroup,giventhatofPBS150l；theblankplasmidgroup,giventhatofblankplasmid20g+lipid60l+PBS.H-Estainedspecimensofthexenografttumorwerepreparedforpathohistologicalstudyaftertheplasmidtherapy,WesternblotmethodwasusedtodetermoinetheproteinlevelofhTERT,flowcytometrywasforassessingtheapoptosisoftumorcells.ResultsSatisfactorysubcutaneousxenograftgliomamodelofnudemicecouldbeconstructedwithin15days,withanaveragesizeof132mm3.ComparedwiththatintheblankplasmidandPBSgroups,thetumorgrowthinthetherapygroupwasevidentlydepresseddownto58.2%.Throughlightmicroscopy,itwasfoundinthehTERTshRNAgroupthatthetumorgrowthwasinhibitedobviously,therewererelativelyfewtumorcells,buttherewerenumbersofnecroticandapoptotictumorcellseverywhere.WesternblotshowedtheexpressionofhTERTproteinwasrestrained.FlowcytometryshowedtheapoptosisratioofthetumorwashigherinhTERTshRNAgroupthaninthecontrolgroups.Thedifferencesintheseindexeswereverysignificantbetweenthetherapygroupandthecontrolgroups（P<；0.01）.ConclusionhTERTshRNAcaninhibitthetranscriptionandtranslationlevelofhTERTinthexenograftedgliomainnudemice,inhibitingeffectivelythetumorgrowthandacceleratingtheapoptosisoftumorcells.Keywords：RNAinterference(RNAi)；humantelomerasereversetranscriptase(hTERT)；brainneoplasms；glioma；genetherapy脑胶质瘤是颅内常见恶性肿瘤，占颅内肿瘤的35.26%60.96%，目前尚无根治方法。随着分子生物学的迅速发展，从基因水平揭示肿瘤发生、发展机制，寻找有效的基因治疗策略已成为脑胶质瘤研究的热点。目前，脑胶质瘤的基因治疗主要采用自杀基因、抑癌基因、细胞因子免疫基因、反义基因等方法。近年来RNA干扰（RNAi）现象的发现1及应用给脑胶质瘤的基因治疗策略带来强烈影响，选择合适的靶基因是RNAi治疗的关键。鉴于端粒酶在恶性脑胶质瘤中高表达，而端粒酶的激活有永生化细胞和维持端粒长度并阻止恶性细胞死亡的特性，人端粒酶逆转录酶（hTERT）的表达是端粒酶活性表达中的限速步骤2。本研究拟在建立裸鼠人脑胶质瘤皮下动物模型的基础上，以hTERT基因为靶基因，通过RNAi技术抑制其在人脑胶质瘤细胞系U251上的表达，从而抑制U251细胞的增殖，促进其凋亡，抑制肿瘤生长，为脑胶质瘤基因治疗的临床应用提供实验依据。1材料和方法1.1药品与试剂根据hTERT的cDNA序列，构建表达hTERTmRNA特异的短发夹RNA（shRNA）真核表达质粒shRNA（pshRNA,本实验室已前期完成此工作，另文发表）。用QIAGENPlasmidMaxiKit大提质粒（依其操作手册工作）。对获得的质粒hTERTpshRNA用DNA分析仪测光密度值（D值）并定量，再做酶切鉴定及测序。RPMI-1640培养基、SiPORTXP-1脂质体为Gibco公司产品，胎牛血清为杭州四季青公司产品，AnnexinV-FITC试剂盒购自上海晶美公司，hTERT抗体购自SantaCrus公司。1.2细胞培养U251细胞根据GibcoBRL公司的细胞培养手册在无菌层流超净工作台上完成细胞培养和传代后，将U251细胞接种于细胞培养瓶中，培养基为RPMI-1640，加10%胎牛血清，并加入青霉素、链霉素各100mg/L。培养条件：37、5%CO2培养箱，饱和湿度。倒置显微镜下观察，细胞处于80%90%融合阶段时进行传代培养，一般23天传代1次。0.05%胰酶消化，0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)洗除胰酶，取其中1l在光镜下用计数玻片计数，调整比率制成所需细胞悬液，以备种植。1.3实验动物分组及裸鼠人脑胶质瘤移植瘤模型的制备46周龄雄性裸小鼠（BALB/cnude）40只，体重1822g，购于复旦大学医学院实验动物中心，饲养于SPF级无菌饲养室。收集U251细胞，计数细胞数约5106/只（鼠），加入0.3ml无血清无抗生素RPMI-1640培养液中制成细胞悬液，经微量注射器注入裸鼠左侧背部皮下，每2天观察肿瘤生成情况并用游标卡尺测量肿瘤体积。肿瘤体积的计算方法参照公式：体积(mm3)ab2/2，其中a代表肿瘤长径，而b则代表与a最大径垂直的宽度值（短径）。共成功建立皮下肿瘤模型36只，其余4只由于技术和细胞状态原因或其他原因导致肿瘤未生成而从实验中剔除。36只肿瘤模型随机分成3组，每组12只：PBS对照组（简称PBS组，下同），肿瘤体内原位注射PBS150l；脂质体包载的空质粒组（简称空质粒组，下同），肿瘤体内原位注射空质粒20g+脂质体60l+PBS；hTERTshRNA组，肿瘤体内原位注射hTERTpshRNA20g+脂质体60l+PBS。以上各组给药液体总量均为150l。1.4给药治疗方法种植U251细胞后，待肿瘤增殖至100150mm3大小，采用肿瘤体内原位给药方法：将皮下肿瘤分为4个象限，药物分为4份注射，给药部位波及瘤体周边反应带处。每72h给药1次，共5次。1.5动物移植肿瘤取材和肿瘤标本切片裸鼠在治疗后第5周末断颈处死，取出肿瘤，测量肿瘤体积，计算抑瘤率，抑瘤率（%）=（1-实验组平均瘤体积/PBS对照组平均瘤体积）100%。将新鲜肿瘤标本留作凋亡检测，余放至液氮保存。标本固定后，经石蜡包埋切片，采用常规苏木精-伊红染色，在光镜下观察肿瘤细胞形态、坏死、凋亡等改变。1.6hTERT蛋白的Westernblot检测从液氮取出肿瘤标本，切成小块后充分碾碎，均匀浸泡于适量的SDS-loading缓冲液中，置于4冷室，裂解30min。超声仪破碎后，离心。取上清50l加上样缓冲液10l，95煮样8min。等量蛋白上样于8%SDS-PAGE胶进行垂直电泳。以湿转法电转移至醋酸纤维素膜（NC膜）上，后NC膜经3%牛血清白蛋白室温封闭3h,加入适当稀释的一抗，4过夜。用buffer洗膜3遍，加入相应二抗，37反应2h,洗膜，以氮四唑蓝（NBT）/5-溴-4-氟-3-吲哚磷酸（BCIP）显色，水洗终止反应。结果以图像处理仪分析处理，计算D值。1.7细胞凋亡检测取新鲜肿瘤组织，用剪刀将组织剪成34mm大小的碎块。用Hank液洗涤，加0.25%胰酶孵育肿瘤组织。后加入全培养基于组织中，吹打，用不锈钢的筛网过滤细胞悬液。去离子水按14稀释结合缓冲液，用250l结合缓冲液重新悬浮细胞，调节其浓度为1109个/L。取100l的细胞悬液于5ml流式管中，加入5lAnnexinV-FITC和10l20mg/L碘化丙啶溶液。混匀后于室温避光孵育15min。在反应管中加400lPBS，流式细胞仪分析正常细胞、凋亡细胞、机械损伤细胞和死亡细胞百分率。1.8统计学处理实验数据采用MicrosoftExcel及SPSS11.0统计软件分析，计量数据以xs表示，采用完全随机设计方差分析法进行统计学分析。检验水准：=0.05。2结果2.1hTERTshRNA对裸鼠U251移植瘤增殖的影响裸鼠背部皮下注射U251细胞后第810天出现可触及且肉眼可见的肿瘤组织。种植U251细胞约15天后，裸鼠移植瘤增殖至（132.516.4）mm3。瘤体内原位给药后，hTERTshRNA组肿瘤增殖明显比同期PBS组或空质粒组肿瘤增殖幅度小，空质粒组与PBS组比较差异无显著性（P>；0.05）。第5周末hTERTshRNA组肿瘤体积明显小于其他各组，抑瘤率达58.2%。到疗程结束时，荷瘤鼠无一死亡，肿瘤无其他部位转移。见表1。表1治疗后第5周末不同因素处理后裸鼠肿瘤体积大小及抑瘤率比较2.2病理学检查结果苏木精-伊红染色可见PBS组和空质粒组肿瘤细胞生长良好，肿瘤细胞形状不规则，分布密集，可见病理性核分裂，少见坏死灶，血供较丰富；hTERTshRNA组肿瘤内出现较多片状坏死区，肿瘤细胞稀疏散在（图14）。图1PBS组移植瘤病理切片2.3HIF-1和hTERT蛋白检测结果取药物治疗后肿瘤组织作hTERTWesternblot检测，PBS组作为对照组，以-actin作为内对照，与空质粒组和PBS组比较，hTERTshRNA组对移植瘤细胞hTERT蛋白抑制作用较强（P<；0.01），空质粒组与PBS组相比无抑制作用（P>；0.05）。见表2。表2各组移植瘤细胞hTERT蛋白表达2.4移植瘤细胞凋亡检测结果各组均可见AnnexinV-FITC单染的凋亡细胞，与PBS组和空质粒组比较，hTERTshRNA组肿瘤细胞凋亡率均明显增高（P<；0.01），而PBS组和空质粒组比较凋亡率差异无显著性（P>；0.05）。表3各组移植瘤细胞凋亡的检测结果3讨论脑胶质瘤是多基因、多因素参与的神经系统疾病,其危害性高且不易早期发现，传统治疗方法效果均不理想，基因治疗提供了一条新的思路。寻找这些多因素在脑胶质瘤发生及发展过程中的“共同通道”，并以此为靶点进行有效治疗是当今基因治疗的发展方向。本实验利用RNAi的特性使用hTERTshRNA质粒来达到抑制脑胶质瘤生长的目的。RNAi是细胞本身固有的对抗外源基因及其侵害的一种自我保护程序，是双链RNA分子在mRNA水平关闭相应序列及基因的表达使其沉默的过程。该过程首先由Rnase样的Dicer酶将双链RNA（dsRNA）加工成小干扰RNA(siRNA)，接着siRNA识别RNA诱导的沉默复合物并与之结合，降解底物mRNA。这些降解的产物又可以与siRNA的反义链结合，引起新一轮相对应的mRNA降解3。RNAi具有高特异性、高效性、高稳定性和高穿透性等。此外，RNAi尚有激发包括干扰素在内的多种非特异性抗肿瘤反应以及可以传递给子一代等特点4。但是，直接向细胞内导入siRNA存在基因沉默维持时间短、体内运载难和转染效果不稳定等问题，因此限制了该技术的应用。而利用载体介导的RNA技术将有望克服上述困难5。鉴于此，本研究通过先在体外构建能表达shRNA的载体，再将载体转移到肿瘤细胞内并在其内转录后生成siRNA。载体能够在肿瘤细胞中长期稳定表达，siRNA亦能够长时间发挥阻断基因的作用。在前期体外实验中，我们证实RNA干扰能抑制体外培养的U251细胞hTERTmRNA及其蛋白的表达，从而抑制端粒酶活性，进而抑制肿瘤细胞增殖并诱导凋亡。本实验分别根据hTERT的cDNA序列构建表达hTERTmRNA特异的shRNA真核表达质粒pshRNA，建立裸鼠皮下人U251脑胶质瘤模型，将pshRNA通过脂质体包裹的方法转染入荷瘤裸鼠瘤体内，观察RNA干扰hTERT基因抑制肿瘤生长的效果。结果证实：给予shRNA质粒后，肿瘤的生长受到明显抑制，治疗结束时hTERTshRNA组肿瘤体积较PBS组和空质粒组明显减小，抑瘤率为58.2%，说明R