植物组织培养培养基及操作技术.ppt

第三章 培养基及一般培养技术（4学时）,3.1 培养基的种类和成份（1学时） 3.2 培养基的制备（母液的配制和保存；MS培养基的配制）（融入实验课）；一般操作技术（灭菌、接种、培养、移栽驯化）（2学时） 3.3 组培常见问题与对策（污染、褐化、玻璃化）（1学时）,第一节 培养基的成分和种类,一、培养基的成分,1、无机营养元素(inorganic element),1)大量元素：指浓度大于0.5mmolL的元素。 N、P、K、Mg、S和Ca等。,2)微量元素：指小于0.5mmolL的元素。 Fe，B，Mn，Cu，Mo，Cl等。,在细胞里主要是以各种辅酶的形式参与多种代谢活动。 种类：VBl(盐酸硫胺素)、 VB6(盐酸吡哆醇)、 Vpp(烟酸)、 Vc（抗坏血酸）、 VH(生物素)、 VB11(叶酸)、 VB12（钴胺素)等。 使用浓度：一般用量为0.11.0mgL。,2、维生素(vitamin),又叫环己六醇，在糖类的相互转化中起重要作用。 使用浓度：一般为lOOmgL， 作用：适当使用肌醇，能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成。对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用，对细胞壁的形成也有作用。,3、肌醇,培养基及其配制,作用：是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用。 种类：最常用的是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等。 使用浓度：为10200mgL。,4、氨基酸 (amino acid）,培养基及其配制,5、有机附加物 （天然复合物）,10%20%,150-200mlL,150200gL,0.01%-0.05%,浓度：,培养基及其配制,6、植物生长调节物质(hormone),赤霉素（gibberellic acid）,细胞分裂素类 ( cytokinin ),生长素类(auxin),培养基及其配制,*作用：主要被用于诱导愈伤组织形成；促进细胞脱分化；促进细胞伸长；促进生根。 在促进生长方面，根对生长素最敏感。在极低的浓度下，(10-510-8mgL)就可促进生长，其次是茎和芽。,（1）生长素类,培养基及其配制,吲哚乙酸：IAA（indo acetic acid） 萘乙酸：NAA（naphthalene acetic acid） 吲哚丁酸：IBA（indolebutyric acid） 2,4-二氯苯氧乙酸：2,4D (2,4-dichlorophenoxybutyric acid),生长素种类：,培养基及其配制,生长素作用强弱顺序：,培养基及其配制,种类： 6BA(6苄基腺嘌呤) Kt (kinetin 激动素) Zt (zeatin 玉米素),（2）细胞分裂素类,细胞分裂素作用： 促进细胞分裂与扩大。 诱导芽分化，促进侧芽萌发，使茎增粗，抑制茎伸长。 抑制根的分化。,培养基及其配制,细胞分裂素作用强弱顺序,培养基及其配制,GA3（赤霉酸）： 作用：促进幼芽伸长生长，促进不定胚发育成小植株。 赤霉素和生长素协同作用，对形成层的分化有影响：当生长素赤霉素比值高时有利于木质部分化，比值低时有利于韧皮部分化。,（3）赤霉素,培养基及其配制,7、培养材料的支持物 -琼脂(agar),固体培养时最好的固化剂。 用量：610gL。 琼脂是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何营养。琼脂能溶解在热水中，成为溶胶，冷却至40 即凝固为固体状凝胶。 琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工方式有关外，还与高压灭菌时的温度、时间、pH值等因素有关，长时间的高温会使凝固能力下降，过酸过碱加之高温会使琼脂发生水解，丧失凝固能力。时间过久，琼脂变褐，也会逐渐丧失凝固能力。,培养基及其配制,固体培养基的特点（与液体培养基相比）:,优点:操作简便，通气问题易解决，便于观察研究。 缺点:培养物与培养基的接触(即吸收)面积小，各种养分在琼脂中扩散较慢，影响养分充分利用，同时培养物排出的代谢废物，聚集在吸收表面，对组织产生毒害作用。,固体培养,液体培养,培养基及其配制,8、抗生物质(antibiotic),种类：卡那霉素、头孢霉素、青霉素、链霉素、庆大霉素等。 浓度：520mg/L。 作用：可防止菌类污染。,培养基及其配制,9、活性炭(active carbon),目的：是利用其吸附能力，减少一些有毒物质的影响；利于生根。 使用浓度：15gL。 它的颗粒大小决定着吸附能力：粒度越小，吸附能力越大；温度低吸附力强，温度高吸附力减弱，甚至不吸附。,培养基及其配制,10、水（water),作用：是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒。 注意：用蒸馏水，最好是重蒸馏水；以保持培养基成分的精确性。大规模生产时可用自来水。,培养基及其配制,二、培养基的PH值 (pH value),1、多数植物要求pH5.6-5.8 2、用0.1-1N的NaOH和0.1-1N的HCI调节. 3、注意： 经高压灭菌后，培养基pH会下降0.2-0.8,故调整pH值时,应高于0.5； pH的大小会影响琼脂的凝固能力，当pH6.0时，培养基将会变硬，pH 5.0时，琼脂凝固不好。,培养基及其配制,培养基及其配制,不同植物对培养基最适pH值的要求不同(见表),培养基(culture medium) ：是植物组织培养的重要基质。在离体培养条件下，不同种植物的组织对营养有不同的要求，甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同。因此，没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官，在建立一项新的培养系统时，首先必须找到一合适的培养基，培养才有可能成功。,三、培养基的种类、配方及特点,培养基及其配制,1、根据态相不同：固体培养基、液体培养基,2、根据培养物培养过程：初代培养基、继代培养基,3、根据作用不同：诱导培养基、增殖培养基、 生根培养基,4、根据营养水平：基本培养基、完全培养基、 改良培养基。,（一）培养基的种类,培养基及其配制,若只含有大量元素与微量元素和碳水化合物的培养基，称为基本培养基。 在基本培养基的基础上，添加各种各样的生长调节物质和其他有机附加物的培养基叫完全培养基。,初代培养基： 指用来第一次接种外植体的培养基。 继代培养基： 指用来接种初代培养之后培养物的培养基 。,培养基及其配制,1、MS培养基：它是1962年由Murashige和Skoog为培养烟草细胞而设计的。是目前应用最广泛的培养基。 特点：是无机盐离子浓度较高，有高含量的N、K，硝酸盐量大，营养丰富。,（三）常用的培养基及特点,培养基及其配制,（二）MS培养基配方,2、White培养基：1943年由White为培养番茄根尖而设计的。 特点：无机盐浓度较低，适于生根培养。,3、N6培养基：1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的。 特点：成分较简单，KNO3和（NH4）2SO4含量高，不含钼。在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花粉和花药培养。,培养基及其配制,(4)B5培养基:是1968年由Galmborg等为培养大豆根细胞而设计的。 特点：是含有较低的铵盐，较高的硝酸盐和盐酸硫胺素。,(5)KM8P培养基:它是1974年为原生质体培养而设计的。 特点：是有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素。,培养基及其配制,2、White培养基 1943年由White为培养番茄根尖而设计 1963年作了改良，提高MgSO4的浓度和增加硼元素 无机盐浓度较低 使用广泛 在生根培养、胚胎培养中有良好的效果,3、B5培养基 1968年由Gamborg等为培养大豆根细胞而设计 含有较低的铵盐 较高的硝酸盐和盐酸硫胺素,B5培养基的组成和配方,4、N6培养基 1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养设计 KH2PO4和（NH4）SO4含量高，不含钼,N6培养基组成及配方,第二节 培养基的配制,一、 培养基的配制,（一）、母液(stock solution)的配制和保存 所谓母液是欲配制液的浓缩液。 意义: 保证各物质成分的准确性 配制时的快速移取 便于低温保藏。 一般母液配成比所需浓度高10-100倍。 母液配制时可分别配成大量元素、微量元素、铁盐、有机物和激素类等。,培养基及其配制,单配法：将培养基配方中的各种成分分别配成一定浓度的母液。一般用mg/ml 或mg/L表示。 混配法：将几类营养成分按配方中的用量扩大一定倍数称量，分别溶解后再混合成母液。 配制生长素类：可先用少量0.1N的NaOH或95%酒精助溶。浓度为：1-5mgml。 配制细胞分裂素类：一般先用少量0.5-1N盐酸加热溶解。浓度为：1-5mgml。,培养基及其配制,母液的配制方法：,培养基母液的配制,培养基及其配制,配制方法： 1）、将母液按顺序摆放 2）、取适量的蒸馏水(所需培养基量的2/3)入容器 3）、按需要量依次取母液及生长调节物质 4）、加入蔗糖(30g/L)溶解 5）、加琼脂(6-10g/L)，煮沸，2-3min 5）、定容 6)、调PH值(pH=5.8) 7)、分装培养瓶，封口 8)、高压灭菌,培养基及其配制,第三节 组培技术（灭菌、接种、培养、移栽驯化）,消毒:是指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再发生危害作用。,灭菌:是指用物理或化学的方法，杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体，即把所有生命的物质全部杀死。,培养基及其配制,一、培养基的灭菌,常用的灭菌方法,物理方法,化学方法,干热灭菌(烘烧和灼烧),湿热灭菌(常压或高压蒸煮),射线处理(紫外线、超声波、微波),过滤除菌,大量无菌水冲洗,升汞(氯化汞),甲醛(福尔马林),过氧化氢,高锰酸钾,来苏儿,漂白粉,次氯酸钠,酒精,培养基及其配制,培养基的灭菌湿热灭菌法,培养基在制备后的24h内完成灭菌。 高压灭菌的原理： 在密闭的蒸锅内，其中的蒸气不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在108kPa的压力下，锅内温度达121。在此蒸气温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。,培养基及其配制,将锅内空气完全排除后，关闭放气阀。当压力表上升达108kPa时，锅内温度达121（在此蒸气温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢），维持15-30min。,培养基及其配制,灭菌方法：,灭菌锅有很多种，实验室中常用手提式高压蒸汽灭菌锅，使用时要注意一下几点： 1、锅中应放足量的水，以免造成空烧或干烧； 2、装锅时不要过度倾斜，可保持内部有一定的空 间，利于蒸汽流动； 3、增压前高压锅内的空气必须排净，否则易影响 灭菌效果；,4、灭菌过程中，应尽量保持压力恒定，严格遵守灭菌时间； 5、排气降压时应缓慢进行； 6、只有待高压锅内压力表指针恢复到零后，才能开启压力锅； 7、高压锅工作时，应有专人看守。,高压灭菌的原理,在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在0.1MPa的压力下，锅内温度达121。在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。,注意事项,完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底。高压灭菌放气有几种不同的做法，但目的都是要排净空气，使锅内均匀升温，保证灭菌彻底。常用方法是：关闭放气阀，通电后，待压力上升到0.05MPa时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。关阀再通电后，压力表上升达到0.1MPa时,开始计时，维持压力0.10.15MPa 20分钟。,在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低，二是湿热的穿透力比干热大；三是湿热的蒸汽有潜热存在，每1克水在100时，由气态变为液态时可放出226kJ（千焦）的热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。 在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所以，当水蒸汽中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。 如果压力未降到0时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染，需逐渐减压。,过滤灭(除)菌（不耐热的物质 ）,一些生长调节剂(赤霉素、玉米素)、某些维生素是不耐热的，常用过滤灭菌-细菌过滤器方法。 防细菌滤膜网孔的直径为0.45m以下，可阻止细菌细胞和真菌的孢子通过。,培养基及其配制,空间及物体表面灭菌,培养基及其配制,熏蒸剂:甲醛和高锰酸钾，1周后通风1天。,(1)紫外线灭菌,(2)熏蒸灭菌,10-20分钟,灭菌后的培养基经冷却和凝固后即可使用，检验灭菌效果。 检验方法： 将培养基置于培养室中3天，若没有污染现象，说明灭菌可靠，可以使用。 保存在低温条件下。常温下保存时要进行防尘和避光处理。 保存时间不可过长。,培养基的保存,二、外植体的选择和灭菌,1、 外植体的选择 2、 外植体的灭菌方法 3、 污染原因和预防措施,1、外植体的选择 植物组织培养的主要过程大致包括：培养基的制备、外植体的选择、器具的消毒、无菌操作和环境条件的调控。 1）、选择优良的种质 无论是离体培养繁殖种苗，或者是进行生物技术研究，选取性状优良的种质，或特殊的基因型。对材料的选择要有明确的目的，具有一定的代表性，提高成功机率，增加其实用价值。,2）、选择健壮的植株 组织培养用的材料，最好从生长健壮的无病虫的植株上，选取发育正常的器官或组织。因为这些器官或组织代谢旺盛，再生能力强，比较容易培养成功。 3）、选择最适的时期 组织培养选择材料时，要注意植物的生长季节、植物的生长发育阶段。如快速繁殖时应在植株生长的最适时期取材，这样不仅成活率高，而且生长速度快，增殖率高。,4）、选取适宜的大小 培养无菌材料时，取材的大小根据不同植物材料而异。材料太大易污染，也不需要；材料太小，多形成愈伤组织，甚至难于成活。一般选取培养材料的大小，在0.5cm-1.0cm。如果是胚胎培养或脱毒培养的材料，则应更小。,三、外植体的灭菌方法,1、常用灭菌药剂的使用和效果 2、外植体的灭菌方法,1、常用灭菌药剂的使用和效果,2、外植体的灭菌方法 外植体在接种前先要灭菌，在灭菌前，又先要进行预处理。植物材料一般采取的预处理方法是：先对植物组织进行修整，去掉不需要的部分，将准备使用的植物材料在流水中冲洗干净。经过预处理的植物材料，其表面仍有很多细菌和真菌，因此还需进一步灭菌。,常规的表面灭菌处理方法 把材料放进70%的酒精中约30s。 用0.1%的升汞（HgCl2）浸泡5 10min 。 或用10%的次氯酸钠溶液浸泡10 15min。 无菌蒸馏水冲洗35次。 灭菌时进行搅动，使植物材料与灭菌剂有良好 的接触。 在灭菌剂里滴入数滴0.1%的Tween20（吐温） 或Tween80湿润剂，则灭菌效果更好。,四、污染原因和预防措施 1、污染的原因 污染是指在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。 污染的原因：从病原菌方面来分析主要有细菌及真菌两大类；从污染的途径而言，主要是由于外植体带菌、培养基及器皿灭菌不彻底、操作人员未遵守操作规程等引起的。,细菌污染的特点：在外植体附近的培养基中出现浑浊和云雾状痕迹。一般在接种后12天即可发现。 原因：材料带菌； 培养基灭菌不彻底； 操作人员未遵守操作规程。 因此接种人员的手应经常用70%酒精擦洗，镊子、剪刀、接种针在使用前必须在火焰上烧红。,真菌污染的特点：培养瓶内往往会出现白、黑或绿等不同颜色菌丝块。在接种后310天才能发现。 原因：周围环境不清洁； 超净工作台的过滤装置失效； 培养瓶等器皿的口径过大。 为了减少损失，提高工作效率，必须在每个操作环节注意防止污染的发生。,2、污染的预防措施,发现污染的材料应及时处理，否则将导致培养室环境污染。 对一些特别宝贵的材料，可以取出再次进行更为严格的灭菌，然后接入新鲜的培养基中重新培养。 要处理的污染培养瓶最好在打开瓶盖前，先集中进行高压灭菌，再清除污染物，然后洗净备用。,1）防止材料带菌的措施 （1）用茎尖作外植体时，可在室内或无菌条件下对 枝条先进行预培养。 枝条 水洗净 插入无糖的营养液或自来水 抽枝 以这种新抽的嫩枝条作为外植体 接种。这样便可大大减少材料的污染。 在无菌条件下对采自田间的枝条进行暗培养，待 抽出的黄化枝条时采枝，经灭菌后接种也可明 显减少污染。,（2）选择合适的时间去田间采取外植体 避免阴雨天去田间采取外植体。 在晴天采取外植体时，下午采取的外植体要比早晨采的污染少，因材料经过日晒后可杀死部分细菌或真菌。,但目前对材料内部污染还没有令人满意的灭菌方法。在菌类长入组织内部时，不但要除去上年生的鳞片，甚至要除去韧皮组织，只接种内部的分生组织，以收到一定的防污染效果。,2）外植体的灭菌 （1）多次灭菌法： 首先除去主脉（因主脉与支脉交界处常有真菌休眠孢子存在）； 其次，将切好的外植体放入1.3%的次氯酸盐溶液中，灭菌30min； 第三，在无菌蒸馏水中冲洗3-5次； 第四，将材料封闭在无菌的培养皿中过夜，保持一定温度； 第五，次日将叶片用2.6%次氯酸钠灭菌30min，然后用蒸馏水洗3-5次。,（2）多种药液交替浸泡法,对容易污染而难灭菌的材料： 首先取茎尖、芽或器官外植体，用自来水及肥皂充分洗净，表面不可附着污垢、灰尘，用剪刀修剪掉外植体上无用的部分，剥去芽上鳞片； 第2，将材料放入70%酒精中灭菌数秒钟； 第3，在1：500Roccal B（一种商品灭菌剂名）稀释液中浸5min； 第4，放入5%10%次氯酸钠溶液中并滴入“吐温80”数滴，灭菌1530min，或浸入0.1%0.2%升汞溶液中并加入“吐温80”数滴，灭菌510min； 第5，用无菌水冲洗5次。也可从次氯酸钠溶液中取出后，再放入无菌的0.1M盐酸中浸片刻，再用无菌水冲洗数次。,3）玻璃器皿的灭菌 湿热灭菌法即将玻璃器皿包扎后置入蒸汽灭菌锅中进行高温高压灭菌，灭菌时间可延长达25min30min。 干热灭菌法即将玻璃器皿置入电热烘箱中进行灭菌。 煮沸灭菌即将玻璃器皿放入水中煮沸进行灭菌。,4）金属器械的灭菌,火焰灭菌法：即把金属器械放在95%的酒精中浸一下，然后放在火焰上燃烧灭菌。这一步骤应当在无菌操作过程中反复进行。 干热灭菌法：即将擦洗干净或烘干的金属器械用纸包好，盛在金属盒内，放在烘箱中灭菌。,湿热灭菌法：工作服、口罩、帽子等布质品均用湿热灭菌法，即将洗净晾干的的布质品，放入高压锅中，121C的温度，灭菌20 min30min。,5）布质制品的灭菌,6）无菌操作室的灭菌,无菌操作室的地面、墙壁和工作台的灭菌可用2%的新洁尔灭或70%的酒精擦洗，然后用紫外灯照射约20-30min。使用前用70%的酒精喷雾，使空间灰尘落下。一年中要定期一、二次用甲醛和高锰酸钾熏蒸。,7）操作人员在接种时一定要严格按照无菌操作的程序进行,在接种前要剪除指甲，并用肥皂或洗衣粉溶液洗手，最好在新洁尔灭溶液中浸泡10min，后用75%的酒精擦手，并用75%的酒精擦拭接种瓶表面进行消毒，以防把微生物带进超净工作台。 工作人员在接种时，最好不要感冒咳嗽和说话。操作人员操作动作要熟练、动作快、规范，这样可以缩短操作时间，减少污染。如脱毒培养的茎尖很小，操作时间长了就会使茎尖失水变干，或不慎感染杂菌。,小 结,1、外植体的选择 ：优良种质、健壮植株 、最适的时期、适宜的大小。 2、外植体的灭菌方法：9种常用灭菌药剂的使用及其效果 、外植体的灭菌方法。 3、污染原因和预防措施：污染的原因、污染的预防措施（防止材料带菌、外植体的灭菌、器皿与金属器械的灭菌、布质制品的灭菌、无菌操作室的灭菌、操作人员在接种时一定要严格按照无菌操作的程序进行）。,四、 外植体的接种和培养 1、 外植体的接种 2、 培养条件,1、外植体的接种,外植体的接种是把经过表面灭菌后的植物材料在无菌环境中切割或分离出器官、组织、细胞并转入到无菌培养基上的全部操作过程。 操作过程中引起的污染，主要由空气中的杂菌和工作人员本身引起的。因此除接种室空气消毒外，应特别注意防止工作人员本身引起的污染。 整个接种过程均须无菌操作：,酒精擦拭手,外植体消毒,浸泡5min,器械消毒,酒精灯灼烧,接种的具体操作,旋转灼烧,取外植体,接种,盖好瓶塞,1操作人员需穿着经消毒的白色工作服，戴口罩、帽子、鞋套。进入接种室前，双手必须进行消毒，用肥皂和水洗涤能达到良好的效果, 进行操作前再用75%的酒精擦洗双手。 2操作期间经常用75%的酒精擦拭双手和台面。特别注意防止“双重传递”的污染，例如器械被手污染后又污染培养基等。,3在打开培养瓶、三角瓶或试管时，最大的污染危险是管口边沿沾染的微生物落入管内，解决这个问题，可在打开前用火焰烧瓶口。如果培养液接触了瓶口，则瓶口要烧到足够的热度，以杀死存在的细菌。为避免灰尘污染瓶口，可用纸包扎瓶口和塞子，以遮盖瓶子颈部和试管口，相对地减少污染机会。,4工具用后及时消毒，避免交叉污染。 5工作人员的呼吸也是污染的主要途径。通常在平静呼吸时细菌是很少的，但是谈话或咳嗽时细菌便增多，因此操作过程应禁止不必要的谈话并戴上口罩。,6由于空气中有灰尘，因此在操作时，仍要注意避免灰尘的落入。尽量把盖子盖好，当打开瓶子或试管时，应拿成斜角，以免灰尘落入瓶中。刀、剪、镊等用具，一般在使用前浸泡在95%酒精中，用时在火焰上消毒，待冷却后使用。每次使用前均需进行用具消毒。,外植体的培养条件 接种后的外植体应送到培养室去培养。组织培养的优点之一就是在人工控制的环境条件下，使培养物生长发育，研究植物的生命活动。培养室的培养条件要根据植物对环境条件的不同需求进行调控。其中最主要的是光照、温度、湿度、氧气和培养基的pH值等。,1、光照 对离体培养物的生长发育，光照条件有重要的作用。通常对愈伤组织的诱导，在黑暗条件下有利，在有光条件下培养的愈伤组织质地和颜色也有不同。但分化器官需要光照，并随着芽苗的生长需要加强光照。加强光照，可以使小苗生长健壮，促进“异养”向“自养”转化，提高移植的成活率。普通培养室要求每日光照12h-16h，光照强度1000lx-5000lx。如果培养材料要求在黑暗中生长，可用铝箔或者适合的黑色材料包裹在容器的周围，或置于暗室中培养。,2温度 离体培养中对温度的调控要比光照显得更为突出。不同的植物有不同的最适生长温度，大多数植物最适温度在23C-32C之间。培养室一般所用的温度是25C2C。低于15C或高于35C，对生长都是不利的。,3湿度 组织培养中的湿度影响主要有两个方面，一是培养容器内的湿度，它的湿度条件常可保证100%。二是培养室的湿度，它的湿度变化随季节和天气而有很大变动。湿度过高过低都是不利的，过低会造成培养基失水而干枯，或渗透压升高，影响培养物的生长和分化；湿度过高会造成杂菌滋长，导致大量污染。因此，要求室内保持70%-80%的相对湿度。,4氧气 植物组织培养中，外植体的呼吸需要氧气。在液体培养中，振荡培养是解决通气的良好办法。,低CTK/IAA,外植体,愈伤组织,芽,根,脱分化,再分化,低CTK/IAA,根,完 整 植 株,生长调节物质控制器官分化的模式,芽,高CTK/IAA,低CTK/IAA,不定芽形成-多细胞参与,胚状体形成过程-单细胞参与,体细胞胚的发育过程,五、试管苗的驯化与移栽 试管苗的特点 1.试管苗的生态环境 组织培养中培育出来的苗通常称试管苗或组培苗。由于试管苗长期生长在试管或三角瓶等培养器皿中，与外界环境隔离，形成了一个独特的生态系统。 与外界环境条件相比具有以下4大差异，即高温、高湿、弱光和无菌。,（1）高温且恒温 在植物试管苗整个生长过程中，通常均采用恒温培养，即使某一阶段稍有变动，温差也是极小的；并且在培养过程中，通常温度控制在252，有的植物需将温度控制得更高；而外界环境条件，温度处于不断变化之中，温度的调节完全是由自然界太阳辐射的日辐射量决定的，温差很大，而且一般不会达到252。,（2）高湿 植物组织培养中试管或培养瓶内的水分移动有2条途径，一是试管苗吸收的水分，从叶面气孔蒸腾；二是培养基向外蒸发，而后水汽凝结又进入培养基。这种循环就是培养瓶内的水分循环，其循环的结果造成培养瓶内空气的相对湿度接近于100，远远大于培养瓶外的空气湿度，所以试管苗的蒸腾量极小。可见培养瓶内的水分状态直接影响着试管苗的生长和各种生理活性。,（3）弱光 组织培养中的光强与太阳光相比一般很弱，故幼苗一般生长也较弱，经受不了太阳光的直接照射。,（4）无菌 不仅培养基无菌，而且试管苗也无菌。在移栽过程中试管苗要经历由无菌向有菌的转换。这一点若不注意，也会引起试管苗移栽过程中的死亡。另外，试管苗还处在一种特殊的气体环境中。 以上这些特点都决定了试管苗移栽前后的环境条件有极大的差异，只有有效地使试管苗适应这种差异，才能使之移栽成活，这就需要试管苗有一定的驯化时期。,2. 试管苗的特点 试管苗与常规苗相比具有如下特点： 1、试管苗生长细弱，茎、叶表面角质层不发达； 2、试管苗茎、叶虽呈绿色，但叶绿体的光合作用功能较差； 3、试管苗的叶片气孔数目少，活性差 4、试管苗根的吸收功能弱。,二、试管苗的驯化 驯化的目的:在于提高试管苗对外界环境条件的适应性，提高其光合作用的能力，促使试管苗健壮，最终达到提高试管苗的移栽成活率。,驯化的原则：应从温度、湿度、光照及有菌等环境要素进行，驯化开始数天内，应和培养时的环境条件相似；驯化后期，则要与预计的栽培条件相似，从而达到逐步适应的目的。,驯化的方法： 驯化一般在试管苗移栽前进行，首先进行移栽前的驯化锻炼（即练苗），其具体方法：将长有完整试管苗的试管或三角瓶由培养室转移到半遮荫的自然光下进行锻炼，在自然光下恢复植物体内叶绿体的光合作用能力和健壮度，并打开瓶盖注入少量自来水使幼苗逐渐降低温度，转向有菌，这样幼苗周围的环境就会逐步与自然环境相似。驯化一般进行12周。,三、试管苗的移栽 试管苗的移栽往往和驯化同步。移栽的方法有：常规移栽法、直接移栽法和嫁接移栽法。,1常规移栽法 常规移栽法是指将试管苗在生长素浓度高的培养基上诱导生根，当获得大量的不定根后，打开培养瓶注入少量自来水，在半遮光下驯化35d，然后取出洗去培养基，移栽到无菌的混合土（如沙子：蛭石=1：1）中，保持一定的温度和水分，当长出23片新叶时就可将其移栽到田间或盆钵的方法。,2直接移栽法 直接移栽法是指直接将试管苗移栽到盆钵的方法。 3嫁接移栽法 嫁接移栽法是指选取生长良好的同一植物的实生苗或幼苗作砧木，用试管苗作接穗进行嫁接的方法。据王清连等人对棉花的试管苗进行嫁接移栽试验表明，试管苗的嫁接移栽法与常规移栽法相比优点见下表：,表2-4 嫁接移栽法移栽棉花试管苗的效果,四、影响试管苗移栽成活率的因素 影响试管苗移栽成活率的因素有许多种，包括内因与外因。不同的植物和不同的试管苗种类对移栽的具体要求是不同的。但是总的来说，提高试管苗移栽成活率的途径有以下几种。,试管苗的驯化,蓝莓,1试管苗的生理状况（选择壮苗） 试管苗的生理状况是影响移栽成活率的内在因素。同一种植物的试管苗，其壮苗比弱苗移栽后成活率高。,嫁接移栽法移栽棉花试管苗的效果,2植物生长调节物质 一般来说生长素因为能促进生根，故也能提高试管苗移栽的成活率。但是，不同的植物有其适宜的生长素种类。如在月季的试验中发现，以NAA诱导生根和提高移栽成活率效果最好；而IAA并不理想，当IAA的浓度超过1mg/L时，反而急剧降低移栽成活率。细胞分裂素一般会抑制根的生长，不利于移栽。如在月季的试验中表明，无论是BA或2-ip对生根和移栽都有抑制效应，即使在很低的浓度下也可发现。,3无机盐浓度 试验结果表明，降低无机盐的浓度对植物生根效果较好，有利于移栽成功。,4活性炭 在生根培养基中加入少许活性炭，对某些月季的嫩茎生根有良好作用，尤其是采用酸、碱和有机溶剂洗过的活性炭，效果更佳。,5环境因子 环境条件也影响试管苗移栽的效果，关键是控制好移栽前10d的光、温、湿。做好适当遮阴工作，避免太阳光直射造成试管苗迅速失水而死亡。温度一般保持在2530为好。开始几天最好用烧杯罩住移栽苗，使其周围的相对湿度保持在85%以上。,6从无菌向有菌逐渐过渡 试管苗出管后，要将其上面的培养基洗净，以免杂菌滋长。对于移栽后成活比较困难的植物，第一次移栽时最好选用灭菌过的基质，以提高其移栽成活率。,第三节 外植体的褐变及其预防措施,葡萄嫩茎接种48h,马铃薯茎尖接种40d,褐变：是指外植体在培养过程中自身组织从表面向培养基释放出褐色物质，以致培养基逐渐变成褐色，外植体也进一步变褐而死亡的现象。,一、褐变的概念,褐变的发生与外植体组织中所含的酚类化合物 多少和多酚氧化酶活性有直接关系。酚类很不稳 定，溢出过程中与多酚氧化酶接触，在多酚氧化酶 的催化下迅速氧化成褐色的醌类物质和水，醌类又 会在酪氨酸酶等的作用下，与外植体组织中的蛋白 质发生聚合，进一步引起其他酶系统失活，从而导 致组织代谢紊乱，生长停滞不前，最终衰老死亡。,二、褐变的原因,植物材料不同，褐变的程度有所不同。,三、影响褐变的因素,枣,蝴蝶兰,苹果,环境、培养基、转接周期不同，褐变的程度不同。,1、植物材料 （1）基因型 不同种植物，同种植物不同类型、不同品种在组织培养中褐变发生的频率、严重程度都存在很大差别。木本植物（木质素）、单宁含量或色素含量高的植物容易发生褐变。这是因为酚类的糖苷化合物是木质素、单宁和色素的合成前体，酚类化合物含量高，木质素、单宁或色素形成就多，而酚类化合物含量高将导致褐变的发生，因此，木本植物一般比草本植物容易发生褐变。,苹 果,苜 蓿,（2）材料年龄 幼龄材料一般都比成龄材料褐变轻的趋势。幼龄材料褐变较轻与其酚类化合物含量少有关。Chever 分析欧洲栗的酚类含量变化的结果表明，幼龄材料酚类化合物含量少，而成龄材料比较多。平吉成从山定子刚长成的实生苗上切取茎尖进行培养，接种后褐变很轻，随着苗龄增长，褐变逐渐加重，取自成龄树上的茎尖褐变就更严重。,梨一年生枝、二年生枝接种3d,（3）取材部位 Yu和Meredith在葡萄上发现从侧生蔓切取茎尖进行培养，比从延长蔓切取的茎尖更容易成活，进一步分析酚类含量发现前者比后者少。而苹果则顶芽作外植体褐变程度轻，比侧芽容易成活。石竹和菊花也是顶端茎尖比侧芽茎尖更容易成活。,（4）取材时期 多酚氧化酶活性和酚类含量基本是对应的，春季较弱，随着生长季节的到来，酶活性逐渐增强，因而有人认为取材时期比取材部位更加重要。Chever报道，欧洲栗在3月15日-30日醌类物质形成少，而在5月-6月醌类物质明显提高。,蒋迪军和牛建新报道，金冠苹果茎尖小于0.5mm时褐变严重,当茎尖长度在5mm-15mm时褐变较轻,成活率可达85%。在多个苹果品种上试验结果表明，用5mm-10mm长的茎尖进行培养效果最好，茎尖如果太小很容易发生褐变。另外，取外植体时还要考虑其粗度，细的可切短些，粗的可切得长些。,（5）外植体大小,主要是光照与温度。温度过高或光照过强，均可使多酚氧化酶的活性提高，从而加速外植体的褐变。,2、培养条件,（1）培养基状态 由于培养基中琼脂的用量和pH值的高低不同，培养基可配成固体培养基、半固体培养基或液体培养基。许多试验证明，液体培养基可以有效克服外植体褐变，液体培养基再加上滤纸桥，效果就更好。在液体培养基中，外植体溢出的有毒物质可以很快扩散，因而对外植体造成的伤害较轻。,3、培养基,（2）无机盐 在初代培养时，培养基中无机盐浓度过高，酚类物质将会大量外溢，导致外植体褐变。原因是无机盐中的有些离子，如Mn2+、Cu2+是参与酚类合成与氧化酶类的组成成分或辅因子，因此盐浓度过高会增加这些酶的活性，酶又进一步促进酚类合成与氧化。,（3）植物生长调节物质 初代培养处在黑暗条件下，生长调节物质的存在是影响褐变的主要原因，此时去除生长调节物质可减轻褐变。细胞分裂素6-BA或KT不仅能促进酚类化合物的合成，而且还能刺激多酚氧化酶的活性，这一现象在甘蔗的组织培养中明显。而生长素类如2，4-D和IAA可延缓酚类化合物的合成，减轻褐变现象发生。,（4）抗氧化剂 培养基中加入抗氧化剂可改变外植体周围氧化还原电势，从而抑制酚类氧化，减轻褐变。,（5）吸附剂 活性炭和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）作为吸附剂可以去除酚类氧化造成的毒害效应，这在东北红豆杉、猪笼草、鹤望兰、杜鹃花、苹果、桃和倒挂金钟等植物上都有过报道。在倒挂金钟茎尖培养中只加入0.01%PVP便对褐变有抑制作用。,（6）pH值 培养基的pH值较低时，可降低多酚氧化酶活性和底物利用率，从而抑制褐变。而pH值升高则明显加重褐变。,4、材料转瓶周期 对于易褐变的材料，接种后转瓶时间长，伤口周围积累醌类物质增多，褐变加重，以致全部死亡。而缩短转瓶周期可减轻褐变。在山月桂树的茎尖培养中，接种后12h24h，便转入液体培养基中，这之后的一周内，每天转一次瓶，褐变得到完全控制。在无刺黑莓上也有类似经验 。,褐变的预防措施,1选择适宜的外植体 外植体应选择分生能力较强的材料。如采用实生苗茎尖、枝条顶芽、幼胚等材料培养褐变程度比较轻。 2采用适宜的培养基和光温条件 培养基的无机盐成分、蔗糖浓度、激素水平、温度适宜及在黑暗条件下培养，或在取外植体之前对母株进行遮光处理20d40d，可以显著减轻材料的褐变。,3在培养基中加活性炭、抗氧化剂和其他抑制剂 在培养基中加入0.1%0.5%的活性炭对吸附酚类氧化物的效果很明显。在许多热带树木的组织培养中均曾观察到活性炭防止外植体褐变的明显效果。如在培养基中加抗坏血酸、血清蛋白、有机酸、蛋白质、氨基酸等抗氧化剂和其他抑制剂，或用它们进行材料的预处理或预培养，可有效地预防醌类物质的形成。 4缩短转瓶周期 这是组培中控制褐变常用且有效的方法。,第四节、玻璃化现象及其预防措施,玻璃化现象 是指组培苗出现叶、嫩梢呈水晶透明或半透明，植株矮小肿胀，失绿，叶片皱缩成纵向卷曲，脆弱易碎；叶表皮缺少角质层蜡质，没有功能性气孔，不具有栅栏组织，仅有海绵组织；体内含水量高，但干物质、叶绿素、蛋白质、纤维素和木质素含量低的现象。,二、玻璃化苗的危害性 由于其组织畸形，吸收养料与光合器官功能不全，分化能力大大降低，因而很难继续用作继代培养和扩大繁殖的材料；加上生根困难，很难移栽成活。,三、玻璃化的原因 玻璃化的起因是细胞生长过程中的环境变化。试管苗为了适应变化了的环境而呈玻璃状。 产生玻璃化苗的因素主要有激素浓度、琼脂用量、温度、离子水平、光照时间、通风条件等。,1、激素浓度 激素浓度增加尤其是细胞分裂素浓度提高（或细胞分裂素与生长素比例高），易导致玻璃化苗的产生。,2、琼脂浓度 培养基中琼脂浓度低时玻璃化苗比例增加，水浸状严重，苗向上长。随着琼脂浓度的增加，玻璃化苗比例减少，但由于硬化的培养基影响了养分的吸收，试管苗生长减慢，分蘖亦减少。因此，琼脂的浓度一定要适当。,3、温度 适宜的温度可以使试管苗生长良好，当温度低时，容