硕士学位论文-96孔实时荧光定量PCR检测系统的开发.pdf

浙江工业大学硕士学位论文96孔实时荧光定量PCR检测系统的开发作者姓名：王伟平指导教师：汤一平吴志和浙江工业大学信息工程学院2011年3月DissertationtedtoZhejiangUniVersi够ofTechnoIogyfortheDegree0fMaster96pointsreal-timePCRdetectionsystemdeVelopmentCandidate：WangWeipingAdVisor：TangYipingWuZhiheCoUegeofInationEngineeringZhejiangUniVers姆ofTechnologyMar2011浙江工业大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的研究成果。除文中已经加以标注引用的内容外，本论文不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得浙江工业大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。作者签名：勿吁和笨、日期：沙ff年厂月功日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权浙江工业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于1、保密口，在年解密后适用本授权书。2、不保密口。(请在以上相应方框内打“寸)作者签名：导师签名：日期：厶“年月刁日日期沙，年厂月埘日平乙详10玷一新汕浙江工业大学硕士学位论文96孔实时荧光定量PCR检测系统的开发摘要实时荧光定量PCR(PolymeraseChainReaction)检测系统是当前临床核酸检测、分子诊断以及生命科学研究的关键设备，目前广泛应用于生物学及医学研究的各个领域。实时荧光定量PcR检测系统的研究和开发，对提高和改善我国在目前国际先进生物学及医学研究仪器设备，特别是改善分子遗传学研究所必须的仪器设备产品的研究和开发的相对落后状态，新产品参与国际竞争方面具有很大的现实意义。本文介绍了实时荧光定量PcR检测系统实现的基本原理，杭州博日科技有限公司开发的具有国际先进水平的LineGene9600实时荧光PCR检测系统的荧光检测系统构成及热循环控制系统、数据分析软件、DNA核酸定量分析软件等技术的原理及相关内容，对其实现快速升降温、温度精确控制与保持的硬件系统地设计原理方法及数据处理软件等分析介绍。该项目通过采用新型结构底部扫描专利技术对PCR热循环系统中多路试剂的检测，PC机与检测仪的多种通讯方式，核酸定量分子诊断分析软件的开发原理、结构，实现了核酸的组成成分的自动分析处理。同时也对目前行业所采用的主流产品特点及开发的较全面地分析总结，对实时荧光定量PCR仪器的优缺点及将来的发展作了较全面分析及探讨。本文对现有主流实时荧光定量PcR检测系统和LineGene9600实时荧光PCR检测系统项目开发中采用的关键技术和新开发配套的软件系统进行了研究探索，成功地开发完成了该产品项目，并打入了国际市场销售，得到了公司总部的科技进步奖励。虽然目前荧光定量PcR检测系统产品己达到相当先进水平的阶段，但随着各种新科技，新技术的不断涌现，我们也要不断去发展完善、研究和开发更先进的核酸分子分析设备参与市场竞争。关键宇：聚合酶链反应，快速升降温，信号检测，Ct值，标准曲线，实时PCR仪浙江工业大学硕士学位论文96PoINTSREALTIMEFLUoRESCENCEQUANTITATIVEPCRDETECTIoNSYSTEMDEVELoPMENTABSTRACTRealtim旧fluorescencequantitativePCRdetectionsyst锄islecTentclinicalnucleicacidtesting，moleculardiagnostics锄dlifescienceresearchofl(eyequipm跚t，nowwidelyusedinbiological觚dmedicalresearchinvariol塔fieldsRealtimefluorescencequantitativePCRdetectionsyst锄rese铷chanddevelopm印t，toenhaIlce粕dimproveourco切口t眄inlec肼entiIltemationaladv釉cedbiological蛆dmedicalresearChequipment，inpanicular也eInstitIlteofmoleculargeneticst0impr0VetheequipmentnecessaD，forproductrcsearch锄ddeVel叩mentrelativebackwa“bess，panicipateininternationalcomp砌onofnewproductshas星，eatpracticalsigllificanceThisarticledescribesmerealtimefluorescencequantitativePCRdetectionsyst锄toachievethebasicpI证ciplesofHangzhouBioerTecllIlolo鼢，Co，LtdonthedevelopmentoftheiI】舰瓶ationaladvancedleveIofLineGene9600realtimePCRdetections_ystem，c伽叩losition跹d也e姗alcyclingcontrolsystems，dataanalysisso触are，DNAnucleicacidQualltitatiVeanalysis伽Vare叭ch觞the研ncipleoftechnolo科andrclate(IcontentItSf瓠heating锄dcooling，tempemtIlrecontrol粕dprecisionhardwaresyst锄desi鲷edt0maintailltlleprincipleof觚dd盘咖LprocessiIlgsoRwareof证ln0ductionScan也ebottomofthene、s蚋Icnlrethrou曲theuseofpatentedtecllIlologyforPCRth咖alcycIingsyst锄multi-agentdetection，PCmachineswithav撕etyofiLetectormeansofc01n枷r嘶cation，nucleicacidanalysisofquanti诅tivem01ecul盯diagnosticsoRwaredeVel叩mentprinciples，蛐rLlc眦，implementcompon伽峪ofnucleicacids她tomatic强alysis锄d口rocessingAlsousediIlmecurrentmainS臼磁IIIlproductsilldust眄characteristicsanddevelopmentofamorecomprehensiveanalysissummary，real-timeqlIantita血rePCRins缸lm即峪gave血eadv锄姐gesanddis捌【v锄恤gesa【IdfiItllredevelopmentofamorecomprehensiVe明alysis锄ddiscussi叩IIlthisarticle，westudiedmeexistiIlgmainstre锄realtimefluorescencequantitativePCRdetectionsystem册dLineGene9600projectdevelopmentofkeytcchnologies锄dtlleuseofnewlydlwelopedsoRwarcsystem，鲫ccess如llycompl鼬edmeproductdeVelopmemprojects，andiIltotheilltenlationalmarketWegotthecomp锄yssci钮tific锄dtechnologicalpr0星弦ssaw卸dsAlthoughfluorescencequ硼1titativePCRdetectionsyst锄productShavereachedvery剐押ancedstagesoftlleleVel，bmwithaVariet)rofnewtechnologi髓，newtechnologiescontiIluet0锄erge，wemustcontiIluetodevelopimproved，morealdVancedresearchanddevelopmentofrIucleicacidaIlalysisequipmentinthemarkctcoInpetitionKeyWords：polymer嬲echainreaction，r叩idheating觚dcooling，si掣mldetcction，ctVah坞，st锄dardcurve，q咖ti诅tiVePCR浙江工业大学硕士学位论文目录摘要i第l章缳论l11背景112国内外发展现状3121PcR检测系统的历史发展状况3122当前国际最新PcR检测系统的发展方向413实时荧光定量的开发意义。5第2章实时荧光定量PcR检测系统的结构621实时荧光定量P隙技术原理。6211实时荧光定量I，cR技术介绍6212分析原理722实时荧光定量P像系统结构构成1023主要结构构成12231LineGene9600荧光定量PCR系统外观12232LineGene9600荧光定量PcR系统组要结构1224LineGene9600荧光定量P隙系统采用的关键技术与解决方案14241底部检测技术14242温度传感器及温度控制器的选择。16第3章控制与检测电路分析设计1931控制与检测电路原理1932电源设计2033x，Y轴电动驱动电路设计。2l34光电倍增管汇集板设计2235主驱动板的设计2336外部接口设计24第4章数据分析软件设计2641荧光定量PcR检测系统软件的功能概述26411软件启动界面2642主要功能介绍：检测程序的设置27421检测程序的组成一27422设置检测程序步骤27423用户名称的输入28424试验名称的输入28425热盖的设置29426加液量的设置29427分析模式的设置29428循环恒温分析模式的设置29429熔解曲线分析模式的设置32iii浙江工业大学硕士学位论文4210结束运行模式的设置334211样本信息的输入354212检测试管显示区设置。354213组别设置364214浓度输入。374215染料添加374216样本信息编辑374217样本信息栏目的选择394218自定义样本信息栏目404219梯度温度计算。4l4220通道增益设置4l4221自动增益校准功能424222添加自定义染料424223模块扫描方式434224系统提示与报警。434225调入用户自定义参数444-226保存为用户自定义参数4543检测程序文件的运行45431试剂样本的准备45432检测文件的运行46433检测结果文件的保存4744运行过程中的系统显示及操作474。41增加、减少循环48442终止程序运行48443热盖非正常开启处理48444荧光选择、分组选择48445梯度温度的显示49446荧光曲线显示调整49447荧光曲线显示方式50448运行中温度一时间的显示5l449仪器上的t作状态显示灯。5l4410备份文件的应用52第5章96孔荧光定量P隙检测系统项目总结5351LineGene9600荧光定量P勰检测系统现状5352LineGene9600荧光定量PcR检测系统目前的不足54521实时荧光定量技术有待完善54522产品结构原理有待完善5453荧光定量P保检测系统产品展望55参考文献56j【谢58攻读学位期间参加的科研项目和成果。59浙江工业大学硕士学位论文第l章绪论11背景实时荧光定量PCR检测系统又被称为实时荧光定量核酸扩增检测系统(英文全称为Rea卜timeQuantitativePCRDetectionSystem)，简略地被称为qPCR，qPcR包含了实时荧光定量PcR仪，配套的运行控制及分析处理软件系统两部分构造。目前被广泛应用在了分子生物学及医疗应用等领域中。美国PerkinE1mer(珀金埃尔默)公司的科学家DrMullis所发明生物分子学中的聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction，简称PCR)是二十世纪八十年代中期开始发展的分子生物学的体外核酸扩增技术，这种技术又被称为无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。PCR技术在理论和应用上是具有超越时代意义的革命性发明，Dr11is由此获得了1993年化学诺贝尔奖。能在一个普通小试管中将所要研究的基因或某一小片DNA片段在短短几小时之内扩增到十万、数百万倍，使人们肉眼能直接观察和作出判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供人们分析研究和检测鉴定。过去要花几天几星期才能做到的事情，用PCR短短几小时便可完成晗1。PCR可以非常简便快速地采取体外扩增的方式从微量生物材料中获取大量特定的遗传物质，它可以检测基因突变和基因组的不稳定性，已经广泛应用于遗传分析曲1，所以被迅速应用到生命科学、医学研究、遗传工程、SARS等疾病诊断以及法医和考古学等领域，广泛应用在早期肿瘤发现及预后处理n3。PcR技术是分子生物学实验技术、医学等领域中的一项革命性创新和里程碑D】。PCR技术原理是将待扩增的DNA做模板，用来与模板正链和负链互补的两种寡聚核苷酸做引物，经过模板DNA的变性、模板与引物结合复性以及在DNA聚合酶作用下发生引物链延伸反应等三步循环来扩增两引物间的DNA片段。每一循环的DNA产物经变性后又成为下一个循环的模板DNA。整个工作过程需要在三种不同温度下(即变性、退火、延伸)循环完成，每经历一次循环可使基因增加一倍，经过2530次左右的循环，最终使基因扩增100万倍以上。荧光定量多聚酶链式反应是一种将荧光能量传递技术(fluorescenceresonanceenergytransfer，FRET)应用于多聚酶链式反应(PCR)仪中，从而进行定量检测的技术。1浙江工业大学硕士学位论文FRET即是通过受体发色团之间偶极一偶极相互作用，能量从供体发色团转移至受体发色团，转移效率与曲个发色团之间距离的6次幂倒数成比例。荧光的强度与溶液中模板的量成正比，因此可用于PCR定量分析6加1。：墨墨墨臣口_-_，5_霉墨互正圆；墨墨正雹墨墨互墨墨墨墨皿，夕了_了一一_；墨墨墨盈正互盘冒雹墨宣雹墨；了_，l链式反应的雪崩效应图11PCR原理示意图PCR理论方程如公式(卜1)表示N：扩增子数量N0：起始模板数量E：扩增效率n：循环数N=N0(1+E)n(卜1)根据扩增原理，扩增是呈指数增长方式，所以在反应体系和反应条件相同的情况下，样本含量是与扩增产物的对数成正比的，因此在一定的条件下荧光强度和样本含量是成正比的嘲。实时荧光PCR自动检测系统就是利用这种对荧光信号的检测来监测整个PcR的扩增过程，以获得实时在线描述PCR过程动力学曲线。这样可将扩增和检测合二为一4浙江工业大学硕士学位论文同时进行，降低传统方法的各种人为因素的影响，提高检测的自动化水平和准确度嘲。该技术实现了PCR从定性到定量的技术飞跃，不但可靠性和特异性强、高灵敏度，能实现多重反应，而且无污染性、具有实时性和准确性，自动化程度高等多种优点n12国内外发展现状121PcR检测系统的历史发展状况聚合酶链式反应在1993年被发明到目前为止，经历了四种类型的PCR相关产品：手动式水浴基因的扩增这种方法的特点是：使用水浴箱方式，设备非常简单，成本低，不需要控制升降温的过程，实验时间比较短，实验效果基本符合要求，缺点是实验人员劳动强度比较大，由于实验者操作疲劳容易引起实验差错，另外标本试管在水浴箱之间的短暂移动过程中被暴露在空气中，实验操作者的移动速度也会影响标本的温度等，对结果的准确性会产生不良的影响。定性基因扩增仪也被称为干式PCR仪，不再使用上述的水浴箱方式，可以进行定性判断。在这种类型的扩增仪上集成定量检测部分就可以升级为定量基因扩增仪。终点定量半定量基因扩增仪上一类定性PCR仪只能判断实验试剂的阴阳性，而无法直接定量分析特定核酸的浓度，这类定量PCR能完成定性PCR无法实现的一些功能：能对其浓度变化量进行分析、判断处理。实时荧光定量PCR检测系统这类的PCR检测系统是由实时定量PcR仪、荧光电量专用试剂、分析处理软件组合而成的一套系统，是在定性PcR技术基础上发展起来的核酸定量技术所应用的产品。实时荧光定量PcR方法的优点是当前确定样品中DNA拷贝数最敏感、最准确的方法。它避免了终点PCR法进入平台期以及在饱和期后定量时容易产生的较大误差值，实现了DNARNA的精确定量。采用该技术的实时荧光定量PCR检测系统不仅可以实现对DNARNA模板的定量，而且具有灵敏度、特异性高的特点，能够实现准确实时、自动化、免污染、多重反应等优点，实时荧光定量PCR检测系统目前在医学临床检验及研究方面有着非常重要的地位m别。浙江工业大学硕士学位论文122当前国际最新PCR检测系统的发展方向经过不到二十年的PCR技术的发展历程，推动了分子生物学的巨大发展。定量PCR技术让PcR检测技术实现了从定性到定量阶段，通过计算实时监控PCR过程的变化数据，可以快速灵敏地精确定量样本的起始模板浓度，目前已经在分子生物学研究和医学临床诊断等很多领域得到了非常广泛的应用副，在现代农业转基因作物的定性检测、转基因成分含量的检测中也发挥着重要作用u到目前主要形式是有采用传统的96孔板的荧光实时定量PCR系统。传统的96孔板的优点是可以测试的样本容量大，并且不需要特制耗材。普通的96孔板的仪器一般采用卤钨灯来激发、并且用CCD方式来检测荧光信号，激发及检测的光路结构设置在96孔板的上部，这样由于每个样品孔位距激发光源和荧光检测器的距离都有差别，造成边缘效应，这样会影响到测试结果。这类仪器在实验过程中通常为了得到准确的实验结果，需要使用荧光染料来参照及校正实验结果u州。但是卤钨灯的使用具有下述一些缺点：寿命短、更换成本较高，另外会产生较多热能也会一定程度上影响到实验结果的准确性。采用CCD结构的优点是可以一次性快速扫描所有样品的荧光信号值，但是也存在灵敏度低，检测样品间会存在个别的荧光信号的相互干扰现象u别。另一种类型是离心式的仪器，这类定量PCR系统通常采用了LED激发和PMT(光电倍增管)检测结构方式，离心式的结构设计可以避免边缘效应对测试结果的影响。由于LED是冷光源，没有热量产生，不会影响实验结果准确性，所以不需要使用其他的荧光染料来校正仪器，而且由于LED光源寿命长不需经常去更换。虽然PMT检测灵敏度非常高，但每次只能收集单个荧光信号。这一类仪器的优点是运行速度很快，但也存在不少缺点，如样本量较少，耗材特殊且价格高，不能设置梯度功能等缺点。杭州博日科技有限公司最新开发的的LineGene9600是一款达到目前国际先进水平的荧光定量PCR系统，它使用了长寿命、高稳定的L印光源作为激发光源，在检测上突破性的改用PMT代替普通使用CCD方式来检测荧光信号，并采用光纤来传导光路信号，这样不但避免了边缘效应的影响，减小样品间的荧光信号的相互干扰，准确的检测到样本的荧光信号值。目前市场上的主流荧光定量PCR系统有如下的知名公司及产品：浙江工业大学硕士学位论文肌od悟b-ladkiltIltstrItMm8I一7500型LizhtCycler矗480IQ5Iz3000P霉-71：、=_=!l=j-心-I-_。一口-一浮皇：=箜墨=_萨一JBIOEERI-I-置-矗ioF嘶l，nDiot曲E坤dorfEIicycler96TP800FTC一2000一agtercyclcreDrealDlez梧凰I零j雩遵t。一。量孽毫I圃13实时荧光定量的开发意义实时荧光定量PCR系统是目前世界上公认的用于医学临床及生物学研究的最先进的核酸分子诊断手段，它具有检测精度、灵敏度非常高，加上检测重复性较好和线性范围较广等明显的优越性，被世界各国研究机构承认并推崇。PCR仪的应用范围广，涉及几乎所有的生命科学领域：临床检验、疾病控制、科研实验室、环境卫生、食品检测、食品安全、检验检疫、化妆品检测等1。试剂厂商生产了包括肝炎、性病、优生优育、呼吸道疾病、禽流感、沙门菌、炭疽芽孢杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、阪崎肠杆菌、口蹄疫、新城疫、猪瘟、大肠埃希菌0157：H7、寄生虫病等在内的数十种荧光定量PcR试剂盒，购买方便，价格便宜，并获得了国家相关认证n引。当前实时荧光定量PCR技术的实际应用以及鉴于当前流行病的多发以及国内外己将实时荧光定量PCR检测技术强制应用于相关行业，相继制定了国际、国家、及行业标准作为法律依据。相对于价格非常昂贵的国外进口定量PcR仪器设备，选择有着较大性价比优势的国产荧光定量PCR仪将是国内大多数用户的必要选择，也是国家食品药品监督管理局、国家卫生部临床检验中心以及国家卫生主管部门所提倡的；使用质量性能与进口仪器相当的国产荧光定量PcR仪，使更多的用户能够拥有先进的实时荧光定量PCR技术和设备，能为国家节省大量外汇同时还能促进民族产业的发展、国产仪器的技术进步，利国利民。能让国内企业在国内普及实时荧光定量PCR技术和设备的同时参与国际市场的竞争，发展壮大。5-浙江工业大学硕士学位论文第2章实时荧光定量PCR检测系统的结构21实时荧光定量PCR技术原理211实时荧光定量PCR技术介绍实时荧光定量PcR技术原理，是指将荧光基因加入到PcR的反应体系之中，实时监测整个PcR的进程中荧光信号的累积，通过分析标准品产生的标准曲线来对所测模板来进行定量分析的这种方法n射。相应的仪器和试剂的商品化的发展使实时荧光定量方法在实际研究工作及临床医学中能够得到了普遍的应用乜们。系统设备通过计算机系统来实时控制荧光定量系统运行，同时监测定量PCR的循环过程中的荧光强度变化量并收集荧光强度变化数据。将数据经过配套的实时分析软件分析处理，这些原始数据被转换成检测到荧光的强度值和关联的循环数值对应的图表显示在计算机上住。计算机可以分析这些传输过来的原始数据，实时软件能对这些数据进行修正处理，保证检测到的背景荧光值在某一设定的范围内。实时荧光定量PcR检测系统可以对这些数据处理后来设定一个域值，这就是我们利用来分析荧光强度的方法。所谓Ct值就是我们检测的样品(试剂)到达域值时所经历的循环数值，同时扩增标有相应浓度的标准品，这样分析软件系统可以根据所测的数据来描绘出一条标准曲线，就可以通过这条标准曲线来计算出我们需要检测的样品的实际浓度值陇3。浙江工业大学硕士学位论文r一1，_mnPE平台期姗J呻硼Jm，。Cf壁_l“8E|墨舢舯I指数增长明|号。FIL|：砌舯：线1生增长期-丌媚循觋喟Y佣帅觋啪J；l；II-lIlIllIIIIlIIIIlIIJII，lJlIIlI奄刍由q矗由由矗“OCycI|图21典型的PCR扩增曲线如图2一l所示，是一条典型的PCR扩增曲线，PCR的扩增包含3个阶段：1)线性增长期；2)指数增长期；3)平台期：不同浓度的样本，PCR扩增时进入指数增长期的时候(循环数)是不一样的，高浓度的样本较早进入指数增长期，而低浓度的样本要在较多循环的扩增之后，才能进入指数增长期。通过这个现象，我们可通过PcR扩增曲线比较各个样本开始进入指数增长期的循环数，从而计算样本的浓度，达到定量分析的目的。绝对定量分析后的样本数据主要有两个：计算浓度和Ct值计算浓度：通过与标准样本的比较，或标准曲线的比较，计算出的样本浓度。Ct值：是指荧光曲线开始进入指数增长期的循环数。212分析原理定量分析有两种分析方法：最大二阶导数法、样点拟合法1。最大二阶导数法：该方法是通过自动计算出荧光曲线在各个循环点的二阶导数值，将它的最大值位置定义为Ct值，从而完成定量分析的目的。这种方法得出的结果是基于理想实验结果。样点拟合法：这种分析方法是先通过设定一根基线，再设定一个阈值，并画出阈值线；再在样本荧光曲线上的基线以上的、对数增长区域内取几个样点，样点的拟合直线与阈值的交叉点所对应的循环数即为Ct值。浙江工业大学硕士学位论文1)最大二阶导数法的分析原理嘲最大二阶导数法分析原理具体如下：首先，通过计算得到每个样本荧光曲线(荧光强度一循环数)最大二阶导数所在位置。然后，将所有最大二阶导数所在位置的荧光强度的最大值作为阈值，并通过阈值作水平线，水平线将与定量曲线相交，交点所对应的循环数叫阈值循环数，即：Ct值。通过计算得到2个或2个以上不同浓度的标准品的Ct值，并将标准品的Ct值与其对数浓度所在样点进行线性拟合，进而得到Ct值一对数浓度曲线(线性函数)。根据所得Ct值一对数浓度曲线(线性函数)、样本的Ct值，可以计算每个样本的样本浓度。将计算所得样本浓度与标准浓度进行对比，得到样本的检测结果。；左图中：1检测所得荧光曲线：2荧光曲线的二阶导数!：曲线!13最大二阶导数所在点I14一最大二阶导数所在点il卜通过阈值的水平线；!lIJi循环数图22最大二阶导数法Ct值的计算原理图8-浙江工业大学硕士学位论文蓬3。、一、-k、h、I、-图23样本浓度的计算原理图2)样点拟合法的分析原理瞄3样点拟合法分析原理具体如下：首先，根据样本荧光曲线的指数增长区的曲线，拟合出荧光强度对数与循环数的曲线。然后，根据扩增曲线的噪声情况确定基线，在基线以上选择2个或2个以上样点，通过拟合取得荧光强度对数一循环数的线性函数。通过样点拟合的线性函数与阈值相交于一点，该点所对应的循环数叫阈值循环数，即：Ct值。通过计算得到2个或2个以上不同浓度的标准品的Ct值，并将标准品的Ct值与其对数浓度所在样点进行线性拟合，进而得到Ct值一对数浓度曲线(线性函数)。根据所得Ct值一对数浓度曲线(线性函数)、样本的ct值，可以计算每个样本的样本浓度。将计算所得样本浓度与标准浓度进行对比，得到样本的检测结果A1a1C坦a3坪图2-4样本拟合法Ct值的计算图SlS2S3荧光强度对数与循环数曲线LlL2L3样点拟合所得直线AlA2A3样点拟合直线与阈值的交点浙江工业大学硕士学位论文22实时荧光定量PCR系统结构构成实时荧光定量PCR仪主要由PcR仪及实时荧光检测系统两部分组成。，前面的原理介绍了定量PCR的定量方式是需要通过样本和标准品之间的对比来实现的，因此实现定量PcR仪的关键参数有控温精确性、升降温速度，以及样品孔间的温度均匀性，这些参数的微小差异都会被指数级放大，从而影响检测精度。对于荧光检测系统，目前的主流是多通道多色的检测方式，仪器可以适用的荧光素种类、激发通道数量，决定其适用范围：多通道是指仪器可同时检测样品中的多种荧光的能力，通道数越多说明该仪器适用的样本范围大、性能也就强大，仪器可以同时检测单管内多模版等，应用也就更广泛埋引。荧光检测系统主要由激发光源和荧光检测器两部分组成。目前被广泛采用的主要激发光源有卤钨灯光源、发光二极管LED光源，也有少部分采用氩离子激光器光源。卤钨灯光源需配多色滤光镜来实现不同的激发波长，而发光二极管需要不同颜色的L功才能实现不同激发波长，但是LED具有价格、能耗、寿命等方面的优势。荧光检测系统一般采用超低温CCD成像系统或者PMT光电倍增管，两者区别是CCD可以一次多点检测，但灵敏度不高；PMT灵敏度很高但是一次只能检测一个样品，需要花费较长的时间通过逐个扫描实现多个样品检测。目前荧光定量PcR仪主要采用传统的96孔板式、离心式等结构方案，都有各自的优缺点。LineGene9600荧光定量PCR检测系统的基本组成如图25所示。它采用半导体加热器升降温方式来实现PCR检测所需要的温度循环过程，同时利用实时检测荧光强度的方式来分析PCR实验模板的扩增浓度，检测荧光强度的方式为采用高灵敏度的光路处理系统对实时荧光信号进行检测并进行软件分析处理盥引。图2-5PCR检测系统构成图浙江工业大学硕士学位论文PCR扩增仪主机它是组成PcR检测系统的核心部分，由温度循环装置和荧光检测装置两部分构成。在PCR反应过程中，非常关键部分是对温度的控制，如图26示意了PCR扩增仪控制系统的构成。通过软件控制半导体制冷器实现测试样品的快速升降温。荧光检测系统主要由发光二极管LED作为激发光源和PMT光电倍增管检测器两部分组成。PCR检测系统下位机作为上位机和扩增仪主机之间的连接通信部分，接收从上位机的设置数据来控制扩增仪按要求运行；同时将PCR扩增仪主机的光路系统、PMT检测器采集到的实时荧光信号及温度信号传送到上位机处理，实现中间传递及控制功能。PCR检测系统上位机用于操作者按需要进行软件程序设置、自动数据分析以及打印结果报告，实现对PcR检测仪的全过程实时动态监控，同时进行实时数据处理分析。主要包含内容：参数设置功能(包括温度、时间、循环次数、升降温速率、检测通道选择、光电倍增管增益)；样本资料记录功能(样本编号、样本名称、样本数据)；文件运行显示功能(PCR热循环数据显示、荧光检测数据显示、仪器运行时各项数据的实时显示)；检测数据分析功能；分析结果输出功能；文件存储功能(设置数据、运行数据、分析结果)；故障保护和报警功能。浙江工业大学硕士学位论文23主要结构构成图26PCR检测系统控制系统构成图231LineGene9600荧光定量PCR系统外观图2-7LineG即e9600荧光定量PCR系统外观图上位机下位机l外形尺寸430姗395咖352哪重量28kg232LineGene9600荧光定量PCR系统组要结构系统由计算机系统和主机构成。主机由：控制部件、热盖部件、热循环部件、光电部件、传动部件、电源部件等部分组成。主机结构示意图见图28。热循环部件主要提供试管试剂PCR反映所需的温度时间控制，热盖部件用于对试管施加预热105度的恒温压力，保证试剂不被蒸发同时与热循环部件的模块热接触良好。光浙江工业大学硕士学位论文电部件中集成了两个PMT，8个LED光源，8组同心光纤，8组可定制波长的滤光片，以及聚光棱镜，光电部件装在传动部件上，以X-Y运动模式对96孔试剂进行逐孔检测，其信号被控制部件采集并经通讯系统连接到计算机，由安装在计算机上的应用软件进行数据实时显示和数据分析处理。控制传动机图28LiI圮Ge9600荧光定量PCR系统主要结构组成LineGene9600荧光定量PcR系统为一体机设计，PcR扩增反应和荧光激发检测一次完成，采用半导体制冷器技术来达到升降温的快速准确稳定。并采用自动热盖设计。为保证整个过程在变性、退火、延伸等三种不同的温度下连续循环工作，必须快速、精确的控制温度变化。我们采用了滞后小，反应灵敏定制的温度传感器，使温度传感器反应迅速灵敏。并优化设计功率输出驱动电路他的，使其能获取快速的升降温特征曲线。浙江工业大学硕士学位论文24LineGene9600荧光定量PCR系统采用的关键技术与解决方案241底部检测技术图29光电扫描结构示意图光纤LineGene9600荧光定量PCR系统采用从试管底部进行检测的方法，底部荧光检测的具有一般顶部检测所不具有的很多优点：光传感器离试管底部距离短，可获得比较大的荧光信号，用户操作空间不会和检测运动机构相干扰，容易设置系统的自动热盖装置，测试试剂的蒸发对荧光检测的影响非常小，未来可以比较容易地扩展为全自动测试系统。LineGene9600荧光定量PcR系统采用的底部检测的结构避免目前其他公司产品的一些缺点，如信号较弱，试剂蒸发影响测试结果、造成准确性下降等现象。LineGene9600荧光定量PcR系统底部荧光检测所采用了如下关键技术：采用特殊设计PCR变温模块，在模块试管孔的底部进行打孔处理，使试管底部设置荧光检测位置。同时特别订制带孔半导体制冷器，兼具大功率长寿命及冷凝水功能；采用双向引出的热管技术的散热器，将半导体制冷器产生的热量传导到仪器外部两侧进行高效散热处理，下部采用xY快速稳定的扫描机构。保证了控温部件与底部光路部件的独立高效运行，保证了该产品的优良性能。图2一10是底部检测示意图：浙江工业大学硕士学位论文-一骗缈翕隧窭貔簋一rL，一。j建一一一一一!盯2矗斧南L讪图210底部检测示意图多通道的荧光快速检测功能：实现多通道分辨是进行分子生物学研究和临床应用的需要，也是PCR技术发展的迫切需要。为快速实现多通道检测，却不影响PcR扩增本身的反应时间是技术关键。科研领域就更为需要。在LineGene9600荧光定量PCR系统中，采用并设置两组PMT同时工作，每组PMT可设置4种滤光片选择使用。通过这种方式，本系统中最大可选用8种滤光片，也就是8通道来同时使用，这在目前国际上是处于技术领先地位。同时优化处理各组滤光片，以降低各通道激发光自身的背景干扰及通道间的荧光干扰，从而实现了多通道的分辨能力，满足同一试管中检测多种荧光的功能要求。在本系统中也采用了光纤传导技术，本系统使用8组同心光纤，这样就实现了测试样品的荧光的激发和检测可以在同一孔内同时进行。对全部孔进行每个光纤定位扫描，保证信号的一致性，使PCR检测结果具有稳定和可再现的特性。我们同时开发了多路荧光汇聚进行集中检测的技术，通过采用光学十字棱镜实现用同一倍增管PMT完成4路汇聚的荧光检测功能。图21l是2路荧光汇聚检测示意图：图21l荧光汇聚示意图15-浙江工业大学硕士学位论文图2-11特殊半导体制冷器采用半导体制冷器具有的优势睁矧：1结构简单，无制冷工质，无磨损，长寿命，环境要求低，工作可靠性高；2制冷温度和速度都可以使用电流来控制，启动速度快；3可以根据需要控制制冷或者制热；4温控精度高；5温度设置范围大，达到设置温度时间短。242温度传感器及温度控制器的选择口卜刎常用的温度传感器有四类：即热电偶、热电阻RTD、热敏电阻及集成电路温度传感器：热电偶的可测温度范围最宽，而热电阻的测量线性度最优，热敏电阻的测量精度最高。每一类温度传感器有自己独特的温度测量范围、温度环境。热电阻测温元件的技术在持续不断地改进，温度测量的质量在不断提高，但要真正实现高质量、高精度的温度测量系统，热电阻的器件选择仍然极为重要。热电阻系一电阻性的元件，由金属制成，如铂，镍，铜等，所选金属必须具有可以预测的电阻值随温度变化的特性，其物理性能要易于加工制造，电阻温度系数必须足够大，使其电阻随温度的改变易于准确测量。热电阻这种线性度极好的电阻温度特性，大大简化了信号处理电路的设计制作。铂电阻在三种金属中具有最为精确、可靠的温度电阻特性馆1。浙江工业大学硕士学位论文表2一l部件构成和关键技术描述构成技术特点关键技术96O2m1带检测孔模块，4区域温模块安装和组装工艺度梯度控制功能；温度均匀性改善特殊半导体制冷器(覆铜柔性基板TE组装工艺确定型)热循环模块部件热管散热器，独立风道热面热量传送能力热敏电阻传感器安装位置动态温度均匀性改善消除低温冷凝水、气流模块密封性循环采用一组步进电机丝杠同步带传驱动快速、平稳性、惯动(X轴)性采用一组步进电机丝杠同步带传电机负载能力动(Y轴)考核电机驱动能力、低样本扫描部件XY扫描系统噪声96孔样本进行荧光扫描时原点定位扫描原点定位稳定性4光电系统组合设计(二向分色镜模采用33定量光路结构式)4通道光电信号同时存储X轴连续扫描模式系统遮光和减光设计材料发黑、遮光结构荧光检测传感器为H5784一01倍增管检测灵敏度、光路背景多色LED独立激发光激发光能力增强四通道滤光片配置和MJR的Chrom04通道干扰最小化光电部件相同。本底信号消除、拖尾消光电传感信号控制与过滤除多色LED激发光同步激发互扰最小光路间隔18咖放置化导光棒加工一致性控制加热元件采用加热膜防蒸发能力、升温时间热盖部件手动操作的灵便特性、开盖机构(铰链、扣手)防烫17浙江工业大学硕士学位论文试管压力调节采用旋紧机构手动操作的灵便特性采用宽压输入电源，4路恒流源控制电源部件TE，一路辅助加热，二路热盖驱动，一多路恒流源控制路风机控制ARM控制，DA控制恒流源，可使用降低高频EMI辐射、屏CPU控制部件RS232C、bluetooth、UsB等手段与计算蔽效果机通讯塑料件采用阻燃、符合欧盟RoHS要EMC屏蔽效能、外壳阻燃外壳性能求的不含有害物的工程塑料。(样机采用CNc成型)扫描PMT传动、控制连线采用FFc信号