硕士学位论文-植物内生生防蜡样芽孢杆菌0-9菌株转座子插入突变体库的建立及评价

单位代码10475学号104753081328分类号Q93硕士学位论文植物内生生防蜡样芽孢杆菌0-9菌株转座子插入突变体库的建立及评价学科、专业：微生物学研究方向：微生物遗传与基因工程申请学位类别：理学硕士申请人：指导教师： 二一一 年 五 月53ESTABLISHMENT AND EVALUATION OF TRANSPOSON INSERTION MUTANT LIBRARY FOR ENDOPHYTIC BIOCONTROL STRAIN Bacillus Cereus 0-9A Dissertation Submitted to the Graduate School of Henan Universityin Partial Fulfillment of the Requirementsfor the Degree of Master of ScienceByPeng LingSupervisor: Associate Professor Wang GangMay, 2011关于学位论文独创声明和学术诚信承诺本人向河南大学提出硕士学位申请。本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下独立完成的，对所研究的课题有新的见解。据我所知，除文中特别加以说明、标注和致谢的地方外，论文中不包括其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包括其他人为获得任何教育、科研机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同事对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。在此本人郑重承诺：所呈交的学位论文不存在舞弊作伪行为，文责自负。学位申请人（学位论文作者）签名： 201 年 月 日关于学位论文著作权使用授权书 本人经河南大学审核批准授予硕士学位。作为学位论文的作者，本人完全了解并同意河南大学有关保留、使用学位论文的要求，即河南大学有权向国家图书馆、科研信息机构、数据收集机构和本校图书馆等提供学位论文（纸质文本和电子文本）以供公众检索、查阅。本人授权河南大学出于宣扬、展览学校学术发展和进行学术交流等目的，可以采取影印、缩印、扫描和拷贝等复制手段保存、汇编学位论文（纸质文本和电子文本）。 （涉及保密内容的学位论文在解密后适用本授权书） 学位获得者（学位论文作者）签名： 201 年 月 日 学位论文指导教师签名： 201 年 月 日摘 要生物防治是一种环境友好型的植物病害综合治理方法，在农业生产上具有重要的应用价值。目前，对于利用微生物进行生物防治的研究中，不再局限于被动地从自然界中寻找生防菌株，而是通过建立生防菌株的突变体库，筛选生物防治相关功能基因缺失突变株，利用分子生物学技术研究该功能基因，进而揭示生防菌生防机制。植物内生生防细菌0-9是一株从小麦根部分离获得的内生蜡样芽孢杆菌，具有生物薄膜形成能力，能稳定有效的防治小麦纹枯病，而且能在小麦根际稳定定殖。为了全面解释0-9的生防机制，本研究利用转座子TnYLB-1，构建了野生菌株0-9的转座插入突变体库。通过测定生防菌0-9的生长曲线，探索菌体培养条件，选取0-9对数生长期中期的菌体制备原生质体；并通过比较不同的破解细胞壁的反应条件，最终确定制备原生质体的破壁条件为：溶菌酶终浓度0.25 mg/mL，42 反应45 min；在成功获得0-9的原生质体后，通过电击转化方法，在电阻400 ，电容5 F，1.0 kv电击参数条件下，成功完成了质粒pMarB（携带转座子TnYLB-1）对生防菌株0-9的转化。根据质粒pMarB上复制子repG+ts的温敏特性，利用高温诱导转座技术使转座子TnYLB-1转座插入到0-9基因组上，成功构建了含有1125株突变株的突变体库；另外，通过对不同高温诱导转座条件的比较，确认最佳转座条件为： 46 处理10 h，在此条件下，转座效率高达90.38%。获得0-9的突变体库后，通过初步比较突变株与野生菌株0-9菌落形态特征，从突变体库中筛选获得202株菌落形态突变株；之后从202株突变株中选取菌落形态特征与野生菌株有明显差异的5株突变株：539、573、609、629、638，进一步通过比较5株突变株和野生菌株0-9菌落形态特征、运动能力、小麦根际定殖能力、对小麦纹枯病生物防治能力以及在非生物表面形成生物薄膜的能力来对突变体库进行表型评价；并利用分子生物学手段PCR技术和Southern杂交技术对突变体库进行分子水平上的评价。表型评价结果证实，5株突变株与野生菌株在表型特征上存在着明显差异；PCR扩增结果说明5株突变株基因组上具有转座子TnYLB-1的同源序列，但在野生菌株0-9基因组上没有；利用Southern杂交技术，检测到TnYLB-1在突变株539、609、629基因组上具有不相同的插入位点，但是，在突变株573和638基因组上并没有检测到TnYLB-1插入序列。综合表型评价和分子生物学评价结果，我们初步认为所建立的突变体库是由转座子TnYLB-1随机插入到野生菌株0-9基因组上获得的，可以作为下一步研究野生菌株0-9生防机制的基础。关键词：生物防治，遗传转化，转座插入，突变体库 ABSTRACTBiological control plays an important role in agriculture as an environment-friendly method of comprehensive control of plant disease. Nowadays, the study of biological control is no longer confined to passively separate biocontrol bacteria from nature, but to find the mechanism of biocontrol bacteria by establish mutant libraries. Bacillus cereus 0-9, isolated from the health wheat root by our laboratory, showed the ability of forming biofilm on non-biological materials and the effective function on controlling the wheat sharp eyespot in the greenhouse; and could colonize the wheat rhizosphere well. In this study, we measured the growth curve of 0-9, and according to the curve, we choose the cells of 0-9, which is in the mid-logarithmic phase, as the material of making protoplasts. After comparing the effective of making protoplasts under different conditions, we ultimately chose the following condition: breaking the cells wall at 42 45min by using lysozyme (0.25 mg/mL), and we got the protoplasts of 0-9 with high regeneration rate.Then, plasmid pMarB carrying transponson TnYLB-1 was transformed into 0-9 protoplasts by electroporation. According to the transposon TnYLB-1 mediated insertional mutagenesis technique, the transposon TnYLB-1 successfully inserted the genome of 0-9 and 1125 mutants were screened that are resistant to kanamycin but erythromycin.In order to verify integration of TnYLB-1 into 0-9 chromosome and test whether the insertions are likely to be random, PCR and southern blotting analyses were performed on 5 kanamycin resistant clones that had been named 539,573,609,629,638 and showed obvious difference with the wild type. And the PCR amplification results proved the fact that the five kanamycin resistant clones have homologous sequence with transposon TnYLB-1, while the wild strain without; moreover, the result of southern blotting analyses told us three of the 5 kanamycin resistant clones, that is 539,609,629, have single unique insertions; however, the insertions on the chromosome DNA of 573and 638 were not detected. In addition, we compared the phenotypic characters between the 5 kanamycin resistant clones and the wild strain 0-9, such as the ability of forming biofilm, the characteristics of colony morphology and swimming, the effective of bio-control and the root-colonization ability; as a result, we found that there is obvious discrepancy between them.In sum, we think that the transposon TnYLB-1 was successfully inserted on the genome of Bacillus cereus 0-9 with randomness of insertion sites; therefore, we could isolate insertion mutations from the mutant library of 0-9, and research the relative function genes which play important role in preventing plant diseases.KEY WORDS：biological control,transformation,insertional mutagenesis,mutant library目 录摘 要IABSTRACTIII目 录VI1 引言11.1 小麦纹枯病的危害以及防治11.1.1 小麦纹枯病对农业生产的影响11.1.2 小麦纹枯病的主要防治方法11.2 植物病害生物防治21.2.1 植物病害生物防治的概念21.2.2 植物病害生物防治的发展前景21.2.3 分子生物学技术在研究植物病害生物防治机制中的应用31.3 植物内生生防细菌41.3.1 植物内生细菌的概念41.3.2 植物内生芽孢杆菌在生物防治研究中的应用51.3.3 植物内生生防细菌与其生防能力相关特性51.4 立题依据和研究意义72 材料与方法92.1 实验材料92.1.1 菌株及质粒92.1.2 供试小麦92.1.3 供试病原真菌102.1.4 培养基102.1.5 试剂112.2 实验方法122.2.1 生防芽孢杆菌0-9原生质体电击转化122.2.2 诱导转座，建立突变体库162.2.3 突变体库的评价173 结果与分析253.1 生防芽孢杆菌0-9原生质体电击转化253.1.1 质粒pMarB电击转化E.coli GM2163253.1.2 生防菌0-9生长曲线测定253.1.3 生防菌0-9原生质体的制备以及电击转化253.2 诱导转座子TnYLB-1转座：283.3 突变体库的评价：283.3.1 表型评价：293.3.2 从分子水平上评价突变体库：384 结论415 讨论456 展望49参考文献：51版权声明55致谢571 引言1.1 小麦纹枯病的危害以及防治1.1.1 小麦纹枯病对农业生产的影响由禾谷丝核菌（Rhizoctonia cerealis Vander Hoeven）侵染所引起的小麦纹枯病( wheat- sharp eyesport )是世界范围危害小麦生长的一种重要土壤传播病害。小麦幼苗感染纹枯病后，茎基部发黑，叶鞘枯死，产量严重下降1。据有关资料显示2，由小麦纹枯病造成的小麦减产轻微时可达到5%10%，严重时可达到20 %40 %，最严重时颗粒无收。由于小麦是主要的农产品之一，其产量关系着整个农业生产的发展，更关系着世界粮食资源问题，因此，有效防治小麦纹枯病的发生是保证小麦高产稳产的前提条件。1.1.2 小麦纹枯病的主要防治方法小麦纹枯病的高发期是冬前和拔节期，具有明显的发病规律3，我国某些地区根据这些规律及特点，采用传统的轮作方法以降低小麦纹枯病的危害程度；另外，对作物抗耐病品种的开发也成为人们防治作物病害的重要措施。但是，由于小麦纹枯病病原菌通过土壤传播，且具有广泛的宿主范围，因此轮作方法不能有效的抑制病害；而目前在生产中尚缺乏抗病品种4，因此，对小麦纹枯病的防治主要采用田间喷洒化学农药或者用化学药剂如三唑酮（triadimefon）、井冈霉素（validamycin）、戊唑醇（tebuconazole）、咯菌腈（fludioxonil）、丙环唑（propiconazole）、苯醚甲环唑（difenoconazole）等5拌种以杀死致病真菌，从而有效控制小麦纹枯病的发生。利用化学农药防治作物病害，会在田间残留大量化学药剂，造成严重的环境污染，破坏自然界的生态平衡6，威胁着人类的生存和发展；另外，长期使用化学药剂，会导致病原菌产生抗逆性强的菌核7，不易被药剂杀死，从而达不到很好的防治效果，反而增大防治难度。因此，人们开始寻找一种高效、环保、安全的防治措施。自Weller（1988）成功地用荧光假单胞菌防治小麦全蚀病以来，生物防治作为一种安全无污染而又高效的植物病害综合治理方法逐渐成为人们研究开发的热点。1 引言1.2 植物病害生物防治1.2.1 植物病害生物防治的概念生物防治，简单来说，就是利用自然界中的有益生物来防治病虫害。而植物病害生物防治又称植物病害综合治理，是指利用有益微生物的生理生化特征以及其生态学作用，降低病原物数量或减弱病原的致病活力，从而达到防治植物病害的效果8。事实上，这种治理方法就是利用植物、病原物、有益微生物在自然生长环境中的相互关系，来达到抑制病原物生长或降低其毒力的目的，并同时促进植物生长9。比如，自然界中存在一些微生物，它们通过抗生作用（Antibiosis）、营养和空间竞争（Competitive activity ）、重寄生作用（Hyperparasitism ）以及诱导系统抗性（Induced systemic resistance ）等机理能有效控制病原物的数量，以降低或消除病原物的危害9；而植物病害生物防治方法正好是利用这类微生物的生物学作用来防治植物病害。 1.2.2 植物病害生物防治的发展前景目前，环境保护成为全世界最关注的话题，“资源节约型，环境友好型”产业已逐渐成为国际公认的发展潮流。在农业生产方面，可持续发展战略要求发展“绿色”产业，生产无污染的“绿色”农产品，因此生物防治作为一种环境友好型的综合防治措施在农业生产实践中具有重要的开发和利用价值。1987年，美国国家科学院有关专家把生物防治定义为：“利用自然的或经过改造的生物、基因或基因产物来减少有害生物的作用，使其有利于有益生物，如作物、树木、动物和益虫及微生物”。从生物防治的定义上来看，这种方法实际上是利用自然界的发展规律来解决问题，因此不会破坏自然规律，更不会对人类社会的发展造成威胁。与其他的防治措施相比，生物防治对人类以及其他生物没有毒害作用，也不会破坏自然界的生态平衡，完全符合农业可持续发展战略的要求，具有很大的研究价值。生物防治方法涉及到生物间的互作关系，同时也与每种生物在自然界中的生态适应性相关。而同一生物在不同的生态体系中的适应能力以及其他相关特性会有所不同，这可能会影响到其稳定有效的发挥生物防治作用。比如，在实验室条件下所开发出的生防菌在被引入到自然生态环境中后，它能否很快适应自然生态环境，能否仍很好的定殖到植物体并与植物建立和谐关系，能否仍维持其强大的竞争能力，决定了它在自然界生态系统中防治植物病害的能力。所以，对生物防治的研究，重点是要保证所开发的生防因子能够在农业生产实践中有效且稳定的发挥其生物防治作用，理想的生防菌应具有营养竞争能力强，抗菌物质产生量高，生长速度快及适应性强等特点10。但是，目前，生物防治研究仍处于实验室阶段，许多生防菌的田间防治效果并不稳定，因此还不能广泛应用到农业生产实践中。为了开发出理想的生防菌，国内外相关研究主要采取以下措施：变单一菌剂的使用为多菌混合使用，利用不同微生物的抗病机制，延长有效期并提高防治病害的广谱性；对现有的野生型生防细菌进行基因改造，以获得广谱高效的新型生物农药；对病原物的流行和生态学进行更多的研究，使环境和操作更有利于生防微生物作用的发挥；解决活菌制剂的保藏和生防菌种的复壮两大生物防治产品开发的难题11。1.2.3 分子生物学技术在研究植物病害生物防治机制中的应用在先进的科学技术条件支持下，国内外研究人员对自然界中许多典型的生防菌的生防机制进行了探讨，发现不同的生防菌发挥生防作用的机理不同，但概括起来主要包括：营养和空间位点竞争、拮抗作用、诱导植物抗病抗性、重寄生、溶菌等作用机制12。目前在生防菌生防机制的研究中，遗传转化技术和转座子插入突变技术成为人们的研究热点。细菌的遗传转化(transformation) 是指处于感受态的受体菌吸收外源DNA 片段，并将其整合在自己的染色体上，获得新的稳定的可遗传的性状的过程13 。转化技术已成为重组DNA 技术的一项基本操作方法,广泛应用于基因定位、基因克隆、外源基因表达、基因图谱绘制 14,15等研究方面。从自然界中筛选的生防菌往往需要进行基因工程改造，才能成为理想的生防因子。目前对生防菌遗传转化的方法主要有感受态细胞转化法和原生质体转化法。孙会刚16等人通过原生质体转化方法，建立了携带转座子Tn917 质粒p- TV1 对枯草芽孢杆菌NCD22 野生菌株的转化体系；王玉飞17等人采用电击转化感受态细胞的方法, 成功将获得含转座子Tn917 质粒pLTV3转化到炭疽杆菌A16R，获得炭疽杆菌芽孢形成缺陷突变株。1951年Barbara Mclintock首先在玉米中发现了控制元件，后来命名为转座元件或转座子 (transposon) 18。转座子又称跳跃因子,是基因组中一段不必借助于同源序列就可移动的DNA序列，它们可以直接从基因组内的一个位点移到另一个位点，甚至可在质粒之间，质粒和染色体之间,质粒和转导的噬菌体之间来回转移，并能引起靶基因的变异、失活19。目前，转座子不仅可用于分析生物遗传进化上分子作用引起的一些现象，还为基因工程和分子生物学研究提供了强有力的工具20,21，可以在不了解基因产物的生化性质和表达模式的情况下，分离克隆植物基因，即转座子标签22(transposon tagging)。其原理是利用转座子的插入造成基因突变，以转座子序列为基础，从突变株的基因文库中筛选出带有此转座子的克隆，它必定含有与转座子序列相邻的突变基因的部分序列，再利用这部分序列从野生型基因文库中获得完整的基因。在生物防治机制研究中，人们首先通过遗传转化技术将携带转座子的质粒转化到生防菌细胞内，之后通过诱导转座技术诱导转座子发生转座，从质粒载体上随机插入到生防菌基因组上，从而获得生防菌的突变体，建立相关突变体库；在得到某个生防菌的突变体库后，从突变体库中筛选控制生防菌某个性状表达的相关功能基因的缺陷突变株，通过反向PCR技术以及DNA序列测序技术对转座子插入位点的侧翼序列进行测序，获得与生防菌株某个性状相关的功能基因；之后再利用其他分子生物学手段对该功能基因进行研究，探索其与生防菌株生防能力之间的关系，进而探索生防菌的生防机制23。1.3 植物内生生防细菌1.3.1 植物内生细菌的概念随着科学技术的发展，人们在植物病害生物防治研究方面取得很大进步，许多研究发现自然界中植物病害的生防菌种类繁多，主要包括放线菌、真菌、细菌等。放线菌主要以链霉菌及其变种24为代表；真菌以酵母菌、盾壳霉、木霉菌、毛壳菌、粘帚霉等25为代表；细菌以假单胞杆菌、芽孢杆菌、巴氏杆菌以及放射性土壤杆菌26为典型。近年来，人们发现植物内生细菌作为生防细菌中的一大类，是最具潜在应用和开发价值的生防因子。田宏先27等报道了马铃薯组织内生菌对马铃薯茎基腐病的田间防治及增产作用。Hinton28 等也通过试验证明, 玉米内生阴沟杆菌(Enterobactercloacae) 作为种子保护剂,能有效防治玉米病害。1992年，克洛珀(Kloepper)等人提出了植物内生细菌的概念，他们认为植物内生细菌(endophytic bacteria)是指能够定殖在健康植物各种组织和器官的细胞间或细胞内，并与植物建立和谐联合关系的一类微生物 29,30。这类细菌与寄主植物在长期共同进化过程中形成密切的相互关系，且生存微环境稳定，成为化肥、农药和其他微生态制剂的最佳竞争者，它的合理应用将减少化学药剂造成的环境污染，提高农田生态系统的生物多样性，有利于保持生态平衡。1.3.2 植物内生芽孢杆菌在生物防治研究中的应用在植物内生生防细菌这个大群体中，芽孢杆菌是一类典型代表。芽孢杆菌能产生芽孢，对干燥、高温、紫外辐射等恶劣环境具有很强的抵抗能力，在植物的表面易于存活、定殖，而且其抑菌范围比较广泛，能有效防治许多病原真菌的所引起的植物病害31。另外，芽孢杆菌具有对人畜无毒无害，不污染环境等优点；在生产芽孢杆菌制剂方面，工艺简单，不易产生抗药性，施用方便，符合现代社会对农业生产以及有害生物综合防治( IPM) 的要求，因此成为生物防治研究中的研究重点。在近年来对土壤传播病害以及种传病害的研究中，已发现许多芽孢杆菌成功防治植物病害的成功例子，这些芽孢杆菌主要包括枯草芽抱杆菌(B.subtilis)，多粘芽抱杆菌(B.polymyxa)、蜡状芽抱杆菌(B.cereus)和巨大芽抱杆菌(B.megaterium )31。如易有金32等研究发现, B. subtilis B - 001菌株可通过自然孔口和伤口入侵寄主植物,取接种植株的茎部组织切片在电镜下观察,发现该菌株在烟草的微管束和细胞内定殖。L.Cavaglieri33筛选出来的B.subtilis CE1可以在玉米根部的表面及内部迅速的定殖并繁殖,能够有效的抑制玉米病原真菌串珠镰刀菌(Fusarium verticillioides)的生长及其代谢产物Fumonisin B1的积累。1.3.3 植物内生生防细菌与其生防能力相关特性（1） 植物内生生防细菌的定殖能力许多研究34,35表明,生防菌的定殖能力是决定其发挥稳定生防效果的关键因素，理想的生防菌应该能很好的定殖在作物体或作物根际。定殖是指微生物在植物体某个特定部位或是植物根际繁殖并持续其种群的能力36。利用基因标记、抗生素标记、同位素跟踪、荧光标记、扫描电镜观察等方法对生防菌的定殖情况进行观察，发现，在作物根表，生防菌主要定殖在表皮细胞间隙或裂缝处，以及侧根、根毛或其它突起物基部；另外发现，生防菌随种子表面扩展到根后，迅速占据上述部位，并大量增殖，大大提高种群密度，从而通过种群优势以抑制其他有害或无害微生物的生长和繁殖，同时减少病原物的侵染机会，以促进植物的生长37。 生防菌的定殖能力与很多因素相关，如生防菌自身的遗传学特性,其对根部分泌物的利用能力38,植物和土著微生物种类39以及土壤环境因子等。 Liljeroth40等证明:在小麦根的较老部位定殖的细菌与在根尖定殖的细菌的生理型很不一样,尤其是对基质利用的专化性不同。Korber等利用双稀释连续培养(Dua1一Diluitno Continuous Cluture)和批量培养体系(Batch Culture Systms)分析细菌运动能力与其定殖能力的关系，发现细菌的运动能力其在定殖过程中具有决定性的作用41。在了解生防菌的定殖能力以及其影响因素后，我们可以通过分子生物学技术等手段对生防菌进行改良，提高其在作物体或作物根际的定殖能力，为其发挥稳定的生防能力提供保障。（2）植物内生生防细菌生物薄膜形成能力生物薄膜(biofilm)是指微生物菌体互相黏附在一起或附着到一些生物或非生物表面上，并包埋在胞外多聚物基质中的生长状态42。目前已经发现，生物薄膜实际上是一个微小生境，该生境与周围环境可能有着明显的区别，从而使其中的细胞展现出区别于游离细胞的特性,因为形成这一结构后，聚集成团的群体细胞能够具有类似多细胞组织的功能及特性43。生物薄膜的形成有利于遗传物质的水平转移，对细菌的环境适应能力、进化能力等有很大的影响；同时有利于提高细胞对药物的抗性，并能对外界环境条件改变作出快速的反应，有利于减少环境变化带来的不利影响，对于不利的环境变化，具有很强的抗性。随着对生防菌定殖能力影响因素的探索，许多研究发现，生防菌的定殖能力与其生物薄膜形成能力相关。植物内生菌在植物体内或体表定殖后表现出明显的聚集成团的生长行为，如形成聚集团(aggregates)、微菌落(microcolonies)、共质体(symplasmata)等形式的生物薄膜附着于植物组织上。有研究发现，多粘类芽胞杆菌(Paenibacillus polymyxa)44、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)45均以生物薄膜的方式定殖在宿主植物组织上；解淀粉芽胞杆菌(B.amyloliquefaciens) 在大豆种子上的定殖能力受其生物薄膜形成能力的影响 46。Achouak47 等报道的成团肠杆菌( Enterobacter agglomerans) , 在水稻根面定殖过程中形成的菌体细胞簇连而成的凝块状结构,有对宿主水稻的定殖专一性。Morris CE48 等观察到在许多植物叶表面定殖的多种细菌有6080是以聚集形式存在。Monier49发现丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)的细胞在植物叶片表面定殖后，总的活细胞数量一直都很高，与其是否形成聚集体的状态无关，但是如果叶片周期性的暴露在干燥环境下，尽管叶片上活细胞的总量会随着处理时间的延长减少，5d后大约只有15%的存活率，但这其中，大多数的存活细菌都存在于聚集体中。冯永军50等对国内宋未先生分离的水稻优势内生菌成团泛菌YS19菌株的研究，也发现其在水稻根茎叶部组织定殖后形成细胞聚集的共质体结构。另外， Danhorn T51等发现，参与生物薄膜形成的细菌表面多糖和蛋白均能与植物细胞发生相互作用，并且细菌细胞之间的信息交流也在通过形成生物薄膜结构而定殖到植物组织上的过程中发挥重要作用。目前对生物薄膜结构和功能的研究已成为植物微生物相互作用研究的热点，了解生物薄膜形成与生防菌定殖能力的相关性，对植物一微生物相互作用的理论研究有着重要价值，同时有利于研究如何提高生防菌定殖能力，进而保证生防菌在田间发挥稳定的生防作用。1.4 立题依据和研究意义小麦纹枯病是一种严重影响小麦产量的土壤传播病害。化学防治易造成环境污染；轮作效果不稳；目前也没有对小麦纹枯病产生免疫的小麦品种。生物防治作为一种安全无污染、有效的植物病害综合治理方法是防治小麦纹枯病的理想措施。近年来，有关研究发现植物内生细菌因其能在植物体定殖，具有较强的营养和位点竞争力，并能与植物体建立和谐关系，是一类最具潜力的生防因子。芽孢杆菌是植物内生细菌中的典型生防细菌，具有对人畜无毒无害，不污染环境，在植物的表面易于存活、定殖等优点,而且生产芽孢杆菌制剂的工艺简单,不易产生抗药性，施用方便。因此，目前对芽孢杆菌生防制剂的开发已成为生物防治研究中的热点。在生防菌的开发过程中，人们发现生防菌株的定殖能力是影响其发挥稳定生防作用的关键因素，因此，研究影响生防菌定殖能力的因素成为通往成功开发生防制剂道路中的关键。随着人们对影响细菌定殖能力因素的研究，发现生物薄膜作为细菌在自然界中的主要存在方式，在植物- 细菌相互作用中扮着重要角色；而且有相关研究发现生物薄膜的形成与细菌的定殖能力之间存在相关性。然而，目前并没有分子生物学证据来证明，生防细菌生物薄膜的形成能影响其在作物体或作物根际的定殖能力，从而进一步影响其生物防治能力。因此，本研究试图利用研究生防菌生防机制的研究思路和手段，通过建立生防菌0-9的突变体库，从突变体库中筛选生物薄膜形成能力缺陷突变株，并对突变株和野生型菌株的定殖能力以及生防能力进行比较，寻找生物薄膜形成与菌株定殖能力以及生防能力之间的关系。在整个研究思路中，建立突变体库是重中之重，是研究的基础。一个理想的突变体库，其插入突变位点应具有随机性。2006年，Yoann Le Breton52等人报道了质粒pMarB上所携带的转座子TnYLB-1具有高效的转座效率，并且能随机插入宿主基因组上。因此本文试图通过原生质体电击转化方法，将携带转座子TnYLB-1的质粒pMarB转化到植物内生生防芽孢杆菌 0-9的细胞内，并通过诱导转座，建立0-9的转座插入突变体库；同时，通过Southern杂交技术和PCR从分子水平上对突变体库进行评价；并通过比较突变株和野生菌株0-9的生物薄膜形成能力、定殖能力、生物防治能力等特性，对突变体库进行表型评价。建立生防芽孢杆菌0-9的突变体库，为探索生防细菌生物薄膜的形成与其定殖能力以及生防能力之间的关系提供研究基础；为研究生防菌0-9的生防机制提供研究平台；另外也可以利用突变体库研究某些功能基因，为芽孢杆菌相关研究提供理论数据。2 材料与方法2 材料与方法2.1 实验材料2.1.1 菌株及质粒（1） 供试菌株：菌株0-9：由本实验室刘凤英等人从拔节期健康小麦苗根部分离保存的蜡样芽胞杆菌，能定殖在小麦根际和根内，具有产几丁质酶、葡聚糖酶、蛋白酶的能力，运动能力较强，能在非生物物质表面附着并形成生物薄膜，同时对小麦纹枯病具有较好生防效果，在实验室条件下其防治效果可达82.86%53。 Escherichia coli GM2163：甲基化缺陷型菌株，购自于Fermentas公司。（2） 供试质粒：pMarB52，片段大小为8319 bp，含有转座子TnYLB-1，温度敏感型复制子repG+ts（30 复制,50 不能复制)。质粒骨架上面含有红霉素（Erm）抗性基因，转座子上面带有卡那霉素（Kan）抗性基因，如图2-1所示。 图2-1：pMarB质粒图谱FIG. 2-1. Physical map of the plasmid pMarB2.1.2 供试小麦矮抗58，购自开封种子公司。2.1.3 供试病原真菌禾谷丝核菌（R.cerealis），由本实验室刘凤英等人从发病小麦植株分离，保存于4 ，具有较强的致病能力53。2.1.4 培养基LB：10 g胰蛋白胨，5 g酵母提取物，10 g NaC1，20 g琼脂，1 000 mL蒸馏水，pH 7.2，121 灭菌20 min。PDA：200 g马铃薯，20 g葡萄糖，20 g琼脂，1 000 mL蒸馏水，121 灭菌20 min，pH自然。麦粒沙培养基：将适量小麦粒于水中浸泡1 h，沸水煮1 h，捞出控干后称量，按小麦湿重与葡萄糖重量比，称取1%的葡萄糖与小麦粒拌匀，再按小麦湿重与砂土重量比1:1混合拌匀，分装，121 灭菌1 h。SOB：0.05%NaCl，0.5%酵母提取物，2%胰蛋白胨，10 mL 250 mmol/L KCl溶液，NaOH调pH值至7.0，用双蒸水定容到1L，121 灭菌20 min。使用时，加入5 mL 2 mol/L的无菌MgCl2 54。SOC：SOB，20 mmol/L葡萄糖54。PAB：10 g蛋白胨，1.5 g酵母提取物，1.5 g牛肉膏，3.5 g NaCl，1.0 g葡萄糖，3.68 g K2HPO4，1.32 g KH2PO4，NaOH调pH值至7.0，用蒸馏水定容到1 L；SMM：1 mol/L蔗糖，0.04 mol/L马来酸，0.04 mol/L MgCl2，溶解后用NaOH调pH值至6.5，双蒸水定容到1 L，121 灭菌20 min。DM3：0.8%琼脂粉，45.55 g甘露醇，5 g酸水解酪素，5 g酵母提取物，3.5 g K2HPO4，1.5 g KH2PO4，5 g葡萄糖，4.07 g MgCl2，双蒸水定容到1 L，120 灭菌20 min。使用时，待培养基温度为55 时加入0.1 g BSA。BGM：LB，0.015 mmol/L硫酸铵，10 mmol/L磷酸钾(pH7.0)，3.4 mol/L柠檬酸钠，1 mmol/L硫酸镁，0.1%葡萄糖(w/v)，双蒸水定容到1 L，120 灭菌20 min。Msgg：5 mmol/L磷酸钾(pH7.0)，100 mmol/L MOPS(pH7.0)，2 mmol/L MgCl2，700 mol/L CaCl2，50 mol/L MnCl2，50 mol/L FeCl2，1 mol/L ZnCl2，2 mol/L VB1，0.5%甘油，0.5%谷氨酸，50 g/ml色氨酸，50 g/ml苯丙氨酸，双蒸水定容到1 L，120 灭菌20 min。EPS55：7 g K2HPO4，3 g KH2PO4，0.1 g MgSO47H2O，0.01 g CaCl2，0.001 g FeSO4，0.1 g NaCl，1 g葡萄糖，0.125 g酵母提取物，双蒸水定容到1 L，120 灭菌20 min。2.1.5 试剂（1） 质粒提取所需试剂参照分子克隆实验指南第三版： 溶液I54：50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris-Cl（pH8.0），10 mmol/L EDTA（pH8.0），121 灭菌15 min，4 保存。 溶液II54：0.2 N NaOH，1% SDS（m/V），新鲜配制，室温下使用。 溶液III54：60 mL 5 mol/L乙酸钾，11.5 mL冰乙酸，28.5 mL H2O，4 保存。溶液IV54：酚:氯仿:异戊醇（v/v）：25:24:1无水乙醇，75%乙醇（2） 质粒DNA纯化回收试剂盒：购自鼎国生物公司。（3） 芽孢杆菌基因组DNA提取所需试剂： CTAB/ NaCl溶液：4.1 g NaCl溶解于80 ml H2O，缓慢加入10 g CTAB，加水至100 ml； 氯仿:异戊醇（v/v）：24:1；酚:氯仿:异戊醇（v/v）：25:24:1； TE：10 mmol/L Tris-Cl（pH 8.0），1 mmol/L EDTA（pH 8.0）； RNase：用TE缓冲液溶解RNA酶，使终浓度为20 g/mL，-20 贮存备用；异丙醇，75%乙醇，蛋白酶K(20 mg/ml)，5 mol/L NaCl，10% SDS。（4） 抗生素：卡那霉素（Kan）：用水溶解配制成0.1 g/mL母液，过滤除菌，-20 贮存备用，使用的终浓度为50 g/mL。红霉素（Erm）：用乙醇溶解配制成0.25 mg/mL母液，过滤除菌，-20 贮存备用，使用的终浓度为10 g/mL。（5） 酶：EcoRI，PstI等购自宝生物工程有限公司。（6） PCR： dNTP，Taq酶，10Taq buffer，购自莱枫生物公司。 引物：以转座子TnYLB-1的序列作为模板，用引物设计件软件Primer 5.0设计两对引物，由上海生工合成。BKmF/BKmR：扩增产物为1.2 KbATnB/STnR：扩增产物为500 bp（7） Southern 杂交：杂交试剂盒：DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I洗涤缓冲液: 0.1 mol/L Maleic acid, 0.15 mol/L NaCl, 0.3% (v/v) Tween20, 马来酸缓冲液: 0.1 mol/L Maleic acid, 0.15 mol/L NaCl, pH7.5检测缓冲液: 0.1 mol/L Tris-Cl, 0.1 mol/L NaCl, pH9.5TE缓冲液: 10 mmol/L Tris-Cl, 1 mmol/L EDTA, Ph8.020SSC: 在800 ml水中溶解175.3 g NaCl和88.2 g柠檬酸钠，加入数滴10 mol/L NaOH溶液调节pH值至7.0，加双蒸水定容至1 L，分装后灭菌。（8） 电泳：10 mg/mL溴化乙锭，50 TAE (储存浓度)，1 TAE (工作浓度)，0.7%琼脂糖凝胶，10 loading bufferMarker：250 bp-10 Kb购自莱枫生物公司。2.2 实验方法2.2.1 生防芽孢杆菌0-9原生质体电击转化（1） 质粒pMarB（携带转座子TnYLB-1）的准备：质粒pMarB电击转化E.coli GM2163：E.coli GM2163是限制-修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，这样能确保转入的质粒能够稳定复制，所携带的基因能顺利表达。本文通过电击转化方法56，将质粒pMarB转化到E.coli GM2163细胞内，pMarB上的复制子repG+ts可以借助宿主菌的复制体系，使质粒在宿主菌细胞内大量复制，从而为后面的研究工作提供充足的质粒资源。a、制备E.coli GM2163电击感受态： 在LB平板上划线培养E.coli GM2163，挑取单菌落至50 mL LB液体培养基中，37 ，200 r/min培养16 h；按照2% 接种量转接菌液至新鲜LB液体培养基中，37 ，200 r/min培养至OD6000.4；将装有菌液的培养瓶置于冰水混合物中冷冻30 min；待菌液彻底冷却后，将其转移至预冷离心管内，6000 r/min低温冷冻离心10 min，弃上清，加入预冷无菌双蒸水重悬浮菌体，再次冷冻离心收集菌体；加入预冷的无菌10%(v/v)甘油重悬浮菌体，6000 r/min低温冷冻离心10 min，弃上清，此步骤重复两次；最后用预冷10%(v/v)甘油重悬浮菌体，使细胞浓度达到31013 cell/mL57；分装感受态细胞，每管50 L，-70 保存备用。b、质粒pMarB电击转化E.coli GM2163感受态细胞：将感受态细胞和质粒pMarB分别从冷冻冰箱取出后，置于冰上使融化；按照一定比例（质粒DNA：50 ng；感受态细胞：50 L），混合质粒和感受态细胞，并将混合物转移至预冷的电击杯（1 mm）中；在电阻400 ，电容5 F，电压2.0 kv电击参数条件下电击一次，迅速向电击杯中加入恢复培养基SOC；将电击杯中的菌悬液吸出，转入无菌管中，于30 ，100 r/min恢复培养，1 h后，向菌悬液中加入Erm(0.04 g/mL)诱导抗性，继续恢复培养2 h；恢复培养结束后，将菌悬液涂布LB(Kan 50 g/mL,Erm 10 g/mL)平板，30 静置培养过夜；待平板上