毕业设计（论文）-通过ELISA法对大米样品中黄曲霉素含量的研究.doc

中国计量学院本科毕业设计（论文）通过ELISA法对大米样品中黄曲霉素含量的研究Study on the content of aflatoxin in rice samples by ELISA method 学生姓名 学号 学生专业 食品质量与安全 班级 自考 二级学院 生命科学学院 指导教师 陈文伟教授 中国计量学院2015年09月郑 重 声 明本人呈交的毕业设计论文，是在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，所有数据、图片资料真实可靠。尽我所知，除文中已经注明引用的内容外，本学位论文的研究成果不包含他人享有著作权的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集体，均已在文中以明确的方式标明。本学位论文的知识产权归属于培养单位。学生签名： 日期： 分类号： O656.3 密 级： 公开 UDC： 641/664 学校代码： 10356中国计量学院 本科毕业设计（论文） 通过ELISA法对大米样品中黄曲霉素含量的研究Study on the content of aflatoxin in rice samples by ELISA method作 者 学号 048113300005 申请学位 工学学士 指导教师 学科专业 食品质量与安全 培养单位 中国计量学院 答辩委员会主席 评 阅 人 2015 年 09月致 谢本论文是在导师陈文伟老师的严格要求和悉心指导下完成的。老师渊博的知识、严谨的治学态度、不懈的敬业精神以及谦逊勤勉的工作作风、宽厚热情的待人方式给予了我深刻的印象，这将对我今后的工作和处事都产生十分重要的影响，并使我受益终生。衷心感谢老师在学习上的谆谆教诲和至诚鼓励以及生活上的热情关怀。感谢学院的各位老师对我的帮助，为我解答疑惑，在实验过程中及论文写作上给予的无私帮助和指导。通过ELISA法对大米样品中黄曲霉素含量的研究摘要：据报道，在一次2014年1月至9月输日食品中违反日本法的国家名称及次数、以及其中属于违反微生物标准的次数和所属微生物标准原因的次数的调查中，发现共有52个国家出现问题，且违反微生物标准的次数有269例，其中因为黄曲霉毒素违反微生物标准的达到98例，远远超过其他微生物违反数。这说明了许多食品中黄曲霉毒素存在的问题严重，对于黄曲霉毒素的检测迫在眉睫。本文主要通过利用ELISA方法，检测大米农作物是否被黄曲霉菌寄生产生黄曲霉毒素所感染。其研究原理是根据抗体和抗原之间特异性的免疫学反应，最后测定酶活力的方法来增加测定的灵敏度。ELISA法将已知的待测黄曲霉素B1（AFB1）抗原吸附于固定载体的免疫吸附剂上，洗涤未吸附的其他抗原和杂质，加入酶标记的AFB1抗体与样品中的待测物发生特异性免疫学反应，形成酶标记的抗原-抗体复合物，洗涤后，加入酶底物，进行显色反应，通过颜色的深浅来测定AFB1抗原的含量。本文还探讨了ELISA测定食品样品过程中提取液PH值、含盐量、油脂浓度对检测结果的影响，初步证实了影响的存在，同时有一定的溶剂萃取提取液可消除这些影响，为建立不同食品样品中黄曲霉毒素B1的提取方法提供了理论依据。关键词：黄曲霉毒素、ELISA、大米、检测中图分类号：O656.3IStudy on the content of aflatoxin in rice samples by ELISA methodAbstract: according to reports, in a January 2014 to 9 months lose food illegal Japanese national name and number, and which belong to violate the number of microbiological criteria and investigation of the number of the microorganism of the genus standard reason, found a total of 52 countries problems, and in violation of the standard microbial number of 269 cases, which because of Aspergillus flavus toxin in violation of the standard microbial reach 98 cases, far more than other microorganisms in violation of the number. This shows that the problem of the existence of aflatoxin in many foods is serious, and the detection of aflatoxin is extremely urgent.In this paper, the ELISA method is used to detect whether the rice crops are infected with the yellow aspergillus toxin. The principle of the study is to determine the sensitivity of the enzyme activity by increasing the specificity of the antibody and antigen.Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) will be known tested aflatoxin B1 (AFB1) antigen adsorbed on immobilized immune adsorption agent, washing not adsorbed to other antigens and impurities, join enzyme labeled AFB1 antibody in the sample and the analyte specific immunological reaction, enzyme labeled antigen antibody complex formation, after washing, adding enzyme substrate, color reaction, through shades of colors to determine AFB1 antigen content.Is also discussed in this paper ELISA determination of food samples in the process of extracting liquid PH value, salt content, effect of oil concentration on the detection results initially confirmed that the influence, at the same time, there are certain solvent extraction extract can eliminate these effects and provide a theoretical basis for the establishment of the extraction method of aflatoxin B1 in different food samples.Key words: aflatoxin, ELISA, rice, detectionFigure classification: O656.3II目 录摘要目录1 引言11.1 研究意义11.2 国内外研究现状11.3 研究内容22 材料与仪器32.1 实验材料32.1.1 样品32.1.2 实验试剂32.1.3 实验仪器32.2 实验原理42.2.1 样品提取42.2.2 AFB1样品制备52.2.3 ELISA检测步骤52.3 提取方法的优化53 结果与分析73.1 ELISA定量分析的质控参数73.1.1 线性范围73.1.2 灵敏度73.1.3 精密度83.1.4 准确度83.2 单因素实验93.2.1 不同提取溶剂对大米样品加标回收率的影响93.2.2 PH值对ELISA测定结果的影响103.2.3 盐浓度对ELISA测定结果的影响103.2.4 油脂对ELISA测定结果的影响114 结论12参考文献13作者简历14学位论文数据集15IV中国计量学院本科毕业论文1. 引 言1.1. 研究意义黄曲霉毒素是黄曲霉、寄生曲霉和黑曲霉等真菌所产生的具有生物活性的次级代谢产物。是一种毒性极强的剧毒物质，其毒性相当于氰化钾的10倍，砒霜的68倍。黄曲霉毒素有很强的致癌、致畸和致突变作用，1993年黄曲霉毒素被世界卫生组织（WHO）的癌症研究机构划定为1类致癌物。因黄曲霉毒素而引起的人类急性中毒事件，国内外已有许多报导，其中最早要追溯到20世纪60年代发生在英国的火鸡突发性死亡事件，该事件导致了近10万只火鸡的死亡，追查其原因，罪魁祸首就是发生了霉变的花生饼饲料。大米是我国南方地区人民的主食，结合南方地区相对湿度较大的环境以及黄梅季节的气候，大米是很容易被黄曲霉素污染的食品之一，并且大米中的黄曲霉素可经摄食直接进入人体，危害人类健康。因此，加强对黄曲霉毒素的检测是十分有必要的。本文主要通过利用ELISA方法，检测大米农作物是否被黄曲霉菌寄生产生黄曲霉毒素所感染。探讨了ELISA测定食品样品过程中提取液PH值、含盐量、油脂含量对检测结果的影响，初步证实了影响的存在，同时有一定的溶剂萃取提取液可消除这些影响，为建立不同食品样品中黄曲霉毒素的提取方法提供了理论依据。1.2. 国内外研究现状黄曲霉毒素是一组化学结构类似的化合物，已分离鉴定出12种包括B1、B2、G1、G2、M1、M2、P1、Q、H1、GM、B2a和毒醇，其中B1的致癌性最强。现在已有许多资料证明了AFB1对动物的毒性中毒机理。AFB1可引起肝炎和肝癌、肝组织和胆管增生，病人的主要临床表现为呕吐、腹泻、厌食和昏睡等症状，最终因肝肾衰竭而死亡。因此，掌握黄曲霉毒素的检测方法对食品安全检测具有重要的意义。目前黄曲霉毒素的测定方法主要有薄层分析法、高效液相色谱法、荧光光度法、酶联免疫吸附法、免疫亲和层析柱-高效液相色谱法、免疫亲和层析柱-荧光光度计法等。它们有各自的优缺点，黄曲霉毒素的检测目前多采用试剂盒检测法，因为试剂盒检测简便、费用低、快速，且能定性和定量进行分析。真菌毒素检测试剂盒的工作原理是薄层色谱法或免疫化学法。本文的课题是“通过ELISA法对大米样品中黄曲霉素含量的研究”，也就是通过酶联免疫吸附法。1.3. 研究内容本课题研究利用ELISA方法，检测大米农作物是否被黄曲霉菌寄生产生黄曲霉毒素所感染。探讨了ELISA测定食品样品过程中提取液PH值、含盐量、油脂含量对检测结果的影响，初步证实了影响的存在，同时有一定的溶剂萃取提取液可消除这些影响，为建立不同食品样品中黄曲霉毒素B1的提取方法提供了理论依据。2. 材料与仪器2.1. 实验材料2.1.1. 样品大米（研磨成粉）2.1.2. 实验试剂甲醇；三氯甲烷；石油醚；无水Na2SO4；NaCl；0.01M PBS 磷酸盐缓冲液（PH7.4）2.1.3. 实验仪器酶标仪（MK芬兰雷勃公司）；小型粉碎机（上海淀久中樂机械制造有限公司）；微量振荡器（深圳市威斯比生物科技发展公司）；微量移液器；（上海佳安分析仪器厂）恒温水浴锅；（常州智博瑞仪器制造有限公司）分析天平；（上海沪粤明科学仪器有限公司）分液漏斗；蒸发皿；移液管；容量瓶；磨口三角瓶；定量滤纸；ELISA快速测试盒；（北京智云达科技有限公司）2.2. 实验原理ELISA分析方法建立的基本原理是直接竞争ELISA，即根据抗体和抗原之间的特异性免疫学反应，最后用测定酶活力的方法来增加测定的灵敏度。操作步骤如下：首先将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体，洗去未结合的剩余抗体。待测管中加受检样品和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应。若受检样品中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合；若受检样本中含有抗原，则与酶标抗原共同竞争固相抗体。受检样品中抗原量越多，则由这些抗原与固体抗体结合的机会越多，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。洗涤除去标记和为标记的游离抗原，加底物显色，在一定时间内终止反应，颜色深浅与抗原量呈负相关。原理如图1所示。图1 检测黄曲霉毒素ELISA竞争法的原理示意2.2.1. 样品提取参考相关文献的方法进行制备，将固体样品（大米）粉碎后，过20目筛网，混合均匀，用四分法进行取样。样品处理：准确称取20g的大米样品置于250ml的磨口三角瓶中，加入100ml甲醇水（55+45）溶液，振荡15min，过滤，弃去初滤液。准确吸取20ml滤液（相当于4g样品）于250ml分液漏斗中，加入80ml三氯甲烷，加塞振荡5min，静置分层（约30min）放出下层三氯甲烷层，经盛有约20g预先用三氯甲烷湿润的无水Na2SO4定量缓慢滤纸漏斗过滤于100ml蒸发皿中，再加入10ml三氯甲烷于分液漏斗中，重复振摇提取，三氯甲烷一并滤于蒸发皿中，最后用少量三氯甲烷洗涤过滤漏斗，洗液并入蒸发皿中。将蒸发皿放入通风橱，于65水浴上通风挥干后，冷却。准确加入20ml甲醇水（1：1）溶液，充分溶解凝结物，即为待测样品提取液。2.2.2. AFB1样品制备用甲醇将AFB1配制成1mg/ml溶液，再用甲醇-PBS溶液（20+80）稀释至约10g/ml，紫外分光光度计测定溶液（361nm）的光密度值，代入下式计算：X=A*M*1000*f/E式中：X该溶液中AFB1的浓度，g/mlA测得的光密度值MAFB1的分子量312E摩尔消光系数，21800f使用仪器的校正因素根据计算将该溶液配制成10g/ml标准溶液，检测时，用甲醇-PBS溶液将该标准溶液稀释至所需浓度（0.05g/ml、0.1g/ml、0.5g/ml、1g/ml、5g/ml、10g/ml）。2.2.3. ELISA检测步骤1.试剂准备从冰箱中取出黄曲霉毒素B1酶联免疫试剂盒，平衡至室温。用1.5ml酶标稀释液稀释冻干酶标抗原，充分摇匀，制成实验用酶标抗原溶液。洗涤抗体板条2次，拍干后备用。2.抗原抗体反应选择数孔分别加入50lAFB1系列标准溶液，其余孔中各加入50l待测样品提取液，随即在各孔中分别加入50l酶标抗原溶液，摇匀，37避光温育30min。3显色将温育后的抗体板取出，弃去未反应抗原溶液，用洗液洗涤5次，每次间隔2分钟。拍干后各孔中分别加入50l底物液和50l显色剂，37显色15分钟。往各孔中分别加入50l终止液。4测定终止反应后，立即用酶标仪在450nm波长处测定各孔OD值，并绘制标准曲线，计算出样品中的AFB1含量。2.3. 提取方法的优化参照国际（GB/T 5009.22-1996）并加以改进准确称取20.0g大米样品（已粉碎并过20目筛）于250ml具塞锥形瓶中准确加入100ml甲醇/水（50：50）提取溶液，瓶塞上涂上一层水后将瓶盖盖紧（防止液漏），在振荡器上振荡30min后，过滤，弃去1/4初滤液收集试样滤液，摇匀，即为待测样品提取液。溶剂与水的配比设计如下：甲醇/水（85:15，v/v）； 丙酮/水（85:15，v/v）甲醇/水（70:30，v/v）； 丙酮/水（70:30，v/v）甲醇/水（50:50，v/v）； 丙酮/水（50:50，v/v）3. 结果与分析3.1. ELISA定量分析的质控参数3.1.1. 线性范围ELISA检测过程中会受到试剂、温度、仪器灵敏度等因素的影响，为了考察检测方法的可靠性，确定定量范围，将AFB1标准溶液浓度按0g/kg，0.05g/kg，0.1g/kg，0.5g/kg，1g/kg，2.5g/kg，5g/kg，10g/kg依次加到酶标板的孔中，测定吸光度值，以对数浓度LgC为横坐标，以吸光度比值Ai（样本）/Ao（正常）为纵坐标，绘制标测曲线。试验结果显示ELISA试剂盒的检测性能良好，在0.1g/kg -10g/kg的浓度范围内，浓度对数LgC与Ai/Ao值呈线性关系，线性方程为Y= -37.889x + 49.745，相关系数R2= 0.9913，所以该试剂盒定量的线性范围为0.1g/kg -10g/kg。线性结果见图2：图2 ELISA方法检测线性曲线3.1.2. 灵敏度以测定浓度依次降低的黄曲霉素B1标准溶液在450nm时的吸光值来确定最低检测浓度，即检测的灵敏度。分别制配不同浓度的AFB1标准溶液，其浓度分别是0.05g/kg，0.1g/kg，0.5g/kg，1g/kg，2.5g/kg，5g/kg，10g/kg。该方法的灵敏度是指检测样品测得最低浓度的A值与0g/kg测得的A值的差大于0.1的读数，这个浓度就是最低检测浓度。从表 抗数据可以看出，最低检测低浓度可达到0.1g/kg。结果如表1所示：表1 样品中AFB1的最低检测量AFB1浓度A450均值A45001.351.371.291.340.051.281.291.241.270.11.211.171.191.190.50.890.880.910.8910.660.610.610.632.50.440.490.470.4750.380.380.390.38100.190.210.170.193.1.3. 精密度精密度是指测定同一匀质样品的一组测量值彼此符合的程度。它们越接近就越精密。分析时,常用RSD（相对标准偏差，也称变异系数）表示精密度。在本次实验中，对AFB1标准曲线做不同批号和同一批号不同板条的精密度进行实验，重复次数为10，测定检测结果的变异系数。通过表2可以看出，批内和批间的相对标准偏差均小于3%，表明精密度良好。表2 ELISA标准曲线的批内批间重复性(n=10)AFB1浓度（g/kg ）批内测定批间测定Ai/Ao平均值（%）标准偏差SD相对标准偏差RSD（%）Ai/Ao平均值（%）标准偏差SD相对标准偏差RSD（%）0.188.932.682.5587.982.982.830.566.971.931.8366.012.152.04150.031.821.7229.072.882.74537.081.561.4836.741.941.841024.462.392.2624.663.012.853.1.4. 准确度准确度简单的说就是测定结果与真实值的接近程度，一般加样回收率来衡量。本次实验通过样品加标回收率实验来衡量该方法的准确度，称取一定量已粉碎的大米阴性样品，准确添加AFB1标准溶液，样品经提取、过滤和稀释后，使待测样品提取液中AFB1的浓度分别为0.1g/kg、0.5g/kg、1g/kg、5g/kg、10g/kg，每个浓度平行三次测定，通过ELISA法测定AFB1的含量。回收率（%）=测定样品中AFB1含量/添加入AFB1的量*100%数据带入上式后计算得出的回收率如表3所示，在0.1g/kg -10g/kg 范围内，大米样品加标回收率介于79%-110%之间，平均回收率为87.73%，在0.1g/kg 时，回收率大于100%，推测原因可能是干扰物质的影响。表3 大米样品添加AFB1回收率测定结果添加 AFB1的浓度（g/kg ）检测值（g/kg ）标准偏差（g/kg）回收率（100%）0.10.110.031100.50.410.0782.010.840.0484.054.060.0280.12108.250.0382.5平均回收率（%）87.733.2. 单因素实验3.2.1. 不同提取溶剂对大米样品加标回收率的影响由标 可以看出，直接用溶剂进行加标试验，不同提取方法对大米样品加标回收率都在80%以上，表明采用这些提取方法进行ELISA检测是有效的。将不同浓度的AFB1标准品分别添加于大米样品中，采用表 所示溶剂配比方法进行提取处理，按照 试验步骤，根据标准曲线测定总的黄曲霉毒素的含量，每个浓度重复三次测定，同时做样品空白。按照如下公式计算加标回收率：回收率（%）=总的AFB1含量-原样品中AFB1的量/添加入AFB1的量*100%试验结果表明，与空白溶剂加标不同，针对不同污染程度的大米样品，各方法的回收率之间存在很大差异，在低污染水平（0.1g/kg）时，50%甲醇/水溶液、50%丙酮/水溶液回收率比较好；对中污染水平（1g/kg）时，提取的最佳组合是50%甲醇/水溶液、70%丙酮/水溶液回收率最接近真实值100%；在高污染水平（10g/kg）时，85%甲醇/水溶液的回收率最高，50%甲醇/水溶液、50%丙酮/水溶液回收率都在80%以上。结果见表4：表4 不同提取溶剂的加标回收率提取溶剂(v/v)添加入AFB1的量（g/kg）0.1110检测值回收率(%)检测值回收率(%)检测值回收率(%)甲醇/水(85:15)0.1201200.81281.28.7987.9甲醇/水(70:30)0.1151150.83683.68.3483.4甲醇/水(50:50)0.1101100.84884.88.6886.8丙酮/水(85:15)0.1161161.231238.2982.9丙酮/水(70:30)0.1241241.061008.0780.7丙酮/水(50:50)0.1061061.041048.4684.63.2.2. PH值对ELISA测定结果的影响由图3明显可以看出，样品PH值对结果的影响很大。当PH值小于4时，Ai/Ao较低，结果显示假阳性，PH值大于8时，结果显示假阴性。PH值较低，会使酶活性受到抑制，导致显色较浅，出现假阳性，PH较高，则会促使酶活性，导致假阴性，而PH值在较中性的时候，结果则较为正常，因此，应将待测样品液的PH值调整到6-7之间再进行提取和测定。图3 PH值对ELISA测定结果的影响3.2.3. 盐浓度对ELISA测定结果的影响从盐浓度对ELISA测定的图4可以看出，随着盐浓度的增加，Ai/Ao逐渐减少，测定的结果呈现假阳性，但变化比较平稳，说明盐含量小于10%，结果较接近于正常。图4 氯化钠浓度对ELISA测定结果的影响3.2.4. 油脂对ELISA测定结果的影响由图5可以看出，随着样品中油脂含量的增加，Ai/Ao逐渐减少，结果越来越趋向于假阳性。原因是样品提取液中油脂含量高，容易粘附在抗体板条的四壁，对抗原抗体反应产生一定屏蔽效应，阻碍了酶标抗原和ELISA板内抗体的结合，从而导致结果趋于阴性，从而导致假阳性的发生。因此，在检测油脂含量高的样品时，一定要先除掉油脂。图5 油脂浓度对ELISA测定结果的影响4. 结论ELISA法检测黄曲霉素不仅简便、快速、费用低，而且能定性和定量的进行分析，对检测人员的安全性也有了很大的提高，既有利于相关检测工作的开展，又有利于提高卫生检测水平。但是ELISA检测也有一定的缺陷性，其具有一定的标准线性范围，也容易受到样本中一些因素的影响造成假阳性，其中酶的活性最容易受到样本中一些因素的影响。在本次研究中，除了采用提高样品稀释倍数和空白样品提取液制备标准曲线来克服干扰外，本次研究还通过比较不同提取溶剂对ELISA检测结果的影响，其中主要是控制提取液的PH值、盐含量、油脂含量等几个变量进行研究，希望提高AFB1检测的准确度，为提高ELISA检测的准确度和灵敏度提供依据。 通过本次研究，ELISA方法评价指标已经建立，ELISA定量分析的质控参数基本确立，证实了ELISA方法用于农产品分析的可行性。通过研究，我们发现，偏酸或偏碱都会影响AFB1的准确度，中性环境更有利于检测结果的稳定和准确。同时盐含量与脂肪含量与AFB1的检测结果呈负相关，采用粗提液经三氯甲烷法萃取后，可降低盐离子的含量，使得测定的影响控制在允许范围之内。采用石油醚脱脂，可使油脂的影响降到最低。从样品的污染程度、有机试剂的危害、环境保护等方面综合考虑，采用50%甲醇/水溶液和50%丙酮/水溶液进行提取为最优方案。参考文献1 宫春波,姜连芳,张永翠,等黄曲霉毒素在食品中的危害及去除方法J食品研究与开发,2004,25 (1):120-1232 胡娜,许杨黄曲霉毒素污染控制技术研究进展J中国公共卫生,2006,22 (3):371-3733 陈晓玲等酶联免疫吸附法（ELISA）检测食用油中黄曲霉毒素B1J中国卫生检验杂志,2000,10 (1):59-604 鲍蕾,金莹,田娟,等高效液相色谱法检测人参和生姜中的黄曲霉毒素和棕曲霉毒素AJ检验检疫科学,2008,18 (4):37-405 张笑言酱油中黄曲霉毒素B1的测定意义及测定方法比较J中国调味品,2006,09 (9):53-556 龚燕ELISA法检测五类食品中黄曲霉毒素B1前处理方法的改进研究J食品工业科技,2003, (4):43-457 郑荣,毛丹,王少敏,等11 种中药材中黄曲霉毒素 G2、G1、B2、B1的HPLC 法测定J中国医药工业杂志,2010,41(5):3688 范蓓,李庆鹏,哈益明关注黄曲霉毒素国内外限量标准,完善食品安全保障措施