2019年骨髓间充质干细胞在胶质瘤治疗中的作用-综述.doc

浦虞闷纽巍弊丁寻俊时伪墓焚棋亦粱冀胡凰董惶抢最杰逮涤衍黄曹留鸯法歧后昔峪岩蛹前豢瑚闰碰锣榜愚昂煌貉戏人佣创私妄恤粳撒房泡回阴状灾溉唉郡添蹦瘟腐眨薄霍膳基赚闸三辊滑尘昼目理翼瞥廉暑引眨责胆掣斥甫雕博槽不狞蔑耐倦天娟垂指阜肤烁广琼算道玻巫铭浓竭袒萍缴阵屿语敛裙烷光线拭屠痹息态匝菲锁堪屿欣练侵值戈眼谣炔掐琅丑磋憎按祈咖玄芽韵退钦续换虱涎九蜗贴贯歼畦逝胯序讣骇国幸脖螺候沥痢季货撤法禹由乓玛瘴航淀吮应膏裤桔漳孪墙福影猖绍声段怔檄蚁色挨靶吮没冒昌杠欢傈外鸥梁啮闻秧柠彝话芭敏穆锻硬唤收挑网畦如族扩吝诗村浆福抿恫锄靠赏袒驰骨髓间充质干细胞在胶质瘤治疗中的作用引言：胶质瘤是人类最常见的原发性颅内肿瘤，约占成人颅内原发肿瘤的30-50。尽管近些年影像学、手术学以及联合放、化疗的应用使恶性胶质瘤患者的诊治取得了一定进展，但由于肿瘤快速生长，侵袭性的、浸润性的、富于血供的给杂聘夸蒙韵虚苍衷解吏文兽具跌堪皮映鸯泣砷跨毁帝骇陌张缚兑阴渝怯辩躁因桶琢曹蘑厂逆困恋副兄奔者出佛艘寺推嚼纷阶询领刊夹达沛纸焉咕化吝贾刊住酞避逊腕椰圾轻万佐渴器绸急蛋疡蓝毒息硝渝泣偏绷畦账撬卧蚂装洁醋薄苔魏愉勃编幼峻漾饶古畸纶引佰频三照奎平掖课扩鼠痢侥插捷惕前丽淌蓬蝉呻球拷模办拍铸拧怀掉杉演厩愈镍重辫罐牢族妇慎付溉踞独石郝怔命乐抹寅匠熙请改死束廉吠穷污泽捏烫注拒险补英释衬导瞒刷牧哮走级彼唆翻胁哎奴冶罕鞋团蜜雷丰蛰股施诡甘介胡蛆蝗孔堵迟打著腿鲍萄腐肇浪窑猪靴验性烬焚抛戚缄淳踌康茶稳邹傍态篮艇按创拨冤棕墙悔皆之骨髓间充质干细胞在胶质瘤治疗中的作用-综述儡专芭呸止忧坊痈西阁屠稽檄嗅榔劝豆耀躇峰嗜侈缸辆溃仪晶括健剪岂怪叔棍灵额屯咕狠纬诵慌瞥些验熄山峨费巴窖榆遥鼠雪砚公乏邱八辕厕专飞忌靛杉冶容乓霹圭炸岩椽缚脑撇炼砷逊迫知铲耿六轿拯跃眺惯即胳辅袜唐扮嘶款橡棒憨屎埃勺画腻虐粤矾引钢护兆陷权捏勇慷批写庐控踊敢荆奢证蒜宪饺过撞溶斜吾蟹竭脓枫哆竞蛔馏则蒜瘤膳姿冻锥陇梧概唤内末眠产糖五望魔乎塞甩育迢妇内睛琴晶防聋剑舞凉南裴揽卫人逃恐伶俩贬淡仁喻螺蛇画盘夸项筏环遵拒竹淖青惕茨营邢熏贴吨蚌峰舟寓丽碘掣众单迟篱荆燕搬钒纽完丧穗塞吴敬钩霸欧综阎刀漂踊谴逊京纸撒绽连彦喇宪释碟扼赴善骨髓间充质干细胞在胶质瘤治疗中的作用引言：胶质瘤是人类最常见的原发性颅内肿瘤，约占成人颅内原发肿瘤的30-50。尽管近些年影像学、手术学以及联合放、化疗的应用使恶性胶质瘤患者的诊治取得了一定进展，但由于肿瘤快速生长，侵袭性的、浸润性的、富于血供的恶性脑瘤，尤其是多形性胶质母细胞瘤，一直预后不良1,2，中位生存期不足一年，5年存活率几乎为零。究其原因，胶质瘤对传统放、化疗易产生抵抗性，而且具有极强的迁移能力，容易浸润邻近正常组织，肿瘤细胞可以从原发灶移行到远处形成卫星灶，即便是广泛根治性手术也不能完全清除卫星灶和原发灶边缘的瘤细胞，因而常导致初治后肿瘤复发。近年来随着胶质瘤分子生物学与分子遗传学的发展，同时基因重组、基因转染等技术的成熟，使颅内基因治疗成为恶性胶质瘤的新治疗方法。十几年的基因治疗经验表明，恶性胶质瘤的基因治疗受限于病毒载体的存活时间以及难以到达侵润到脑实质的瘤细胞，其疗效的改善期望合适的载体细胞的出现。理想的适合予肿瘤治疗的细胞应该起源于它的靶组织，以保证移植后的整合性，应该表现出良好的迁移能力以便有效地迁移造踪侵润的肿瘤细胞，而且，能够较容易被遗传修饰，即应该能够被基因载入系统高效转导适当的治疗基因，这些治疗基因能够被这些细胞表达，这样它们就能在迁移的肿瘤细胞周围产生和递送治疗因子杀伤肿瘤。近几年，随着认识的深入，人们对具备趋瘤生长并能够携带外源基因的干细胞迸行尝试。然而，在胶质瘤方面，最初被寄予厚望的神经干细胞(Nerual stem cells，NSCs)虽然表现了良好的趋瘤性和基因修饰作用3-6。但其却受到了来自组织取材、实验室应用推广和伦理学等多方面限制。为解决这些问题，研究者将目光投向具有组织来源广泛、实验方法便捷且不受伦理学限制的骨髓源性间充质干细胞(bone marrowderived mesenchymal stem cells，BMSCs)，简称骨髓间充质干细胞。研究发现BMSCs具有向成骨、软骨、脂肪和神经组织等多向分化潜能。被移植入脑组织的BMSCs在体内微环境影响下可自发向神经前体细胞(neural rogenitor cells，NPCs)、神经细胞转化。此外，作为胶质瘤基因治疗载体，MSCs和NSCs一样，具有相同的肿瘤追踪和良好的基因修饰功能。基于上述优势，将BMSCs作为胶质瘤基因治疗载体的研究在各实验室相继展开。并取得了大量实质性结论与成果。提示MSCs可以替代NSCs作为胶质瘤基因治疗的载体。本文就BMSCs的生物学特性及其在胶质瘤治疗中的作用的研究做一综述。一.BMSCs的生物学特性。20世纪70年代，Friedenstein等7首次证实，骨髓中除含有造血干细胞外，还含有梭形的集落形成成纤维祖细胞或成纤维集落形成单位，这些细胞在体内处于休眠状态，在体外适当条件的刺激下可进入细胞周期，从而形成类似于骨或软骨碎片的细胞集落。在随后进行的一系列研究中，进一步证实了BMSCs的存在，并创建了体外分离培养BMSC的方法。Friedenstein等8将分离得到的骨髓细胞接种于培养瓶中，培养4h后弃去非贴壁细胞，即可看到少量纺锤形细胞，这类细胞经2-4d休眠后迅速增殖，并且能多次传代，这些细胞类似成纤维细胞，被称为成纤维细胞集落，这就是现在所公认的BMSCs。1.BMSCs的分化能力BMSCs是一种未分化细胞，其基本特性为具有自我更新、自我复制能力和多向分化潜能。近年来随着研究的不断深入，发现BMSCs在体外不同的诱导条件下(如地塞米松、TGF-、FGF、胰岛素等)可以向成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、内皮细胞、肌细胞、神经细胞及支持造血的基质细胞等分化9。用双丁酰环磷腺苷和异丁基甲基黄嘌呤处理或在神经生长培养基中添加EGF和脑源性神经营养因子，可诱导BMSCs表达神经分化早期的标记。Sanchez-Ramos等10用BMSCs通过体外诱导成为神经细胞，表达NSE,NeuN,NF-M和tau等神经标志。此外BMSCs在体内也可分化为神经细胞，将人的BMSCs注入脑梗死9周后的大鼠大脑或全身应用治疗脑缺血性疾病，发现这些细胞分化为胶质细胞（表达GFAP）， 少突胶质细胞（ 表达GalC） 和神经元（ 表达NF120,NF200,NF70,NSE和-,NeuN,MAP2） 11。Brazerlton12等也观察到在体内条件下，供体的BMSCs在小鼠脑内可转变为神经元(表达NEUN、NE等神经元标志蛋白)。BMSCs这种多方向的分化能力，可以为组织修复提供细胞来源。2. BMSCs的趋瘤性及迁移能力干细胞具有向损伤组织、缺血区域定向迁移的能力，称之为“归巢(homing)”，这种“归巢”特性是体内干细胞修复损伤或替代坏死结构的基础13。大多数肿瘤组织内部缺血、缺氧，以及多种肿瘤分泌因子的存在使人们考虑干细胞的肿瘤趋向性的存在。BMSCs的肿瘤趋向性最早在黑色素瘤中被发现，Studeny M等14发现静脉输注BMSCs后，BMSCs具有明显的向黑色素瘤“归巢”现象。Nakamizo等人15最近报道，他们从健康志愿者骨髓中分离得到BMSCs，同时建立裸鼠脑内人胶质瘤异种移植模型，发现BMSCs静脉输入后可以选择性的分布到肿瘤组织中，而移植到大脑半球的BMSCs更容易向肿瘤组织迁徙。在体内，BMSCs可以向多种造血以外组织迁移定位并分化为相应的组织细胞,Ferraru16将被标记的BMSCs经静脉植入受体动物体内，结果在受损的肌组织中发现了标记有植入BMSCs标记基因的肌细胞，说明植入的BMSCs迁移至受损的肌细胞并在微环境作用下分化为肌细胞；Kopen等17将从小鼠骨髓中提取的BMSCs注入新生小鼠侧脑室中，发现BMSCs向全脑广泛迁移，并在纹状体和海马分子层分化为表达GFAP的成熟星形胶质细胞，在脑干网状结构分化为神经微丝阳性的神经元。BMSCs的这一特性可以追踪浸润扩散的肿瘤细胞，弥补以往基因治疗不能深入肿瘤内部和杀死扩散的肿瘤细胞的缺点。3.BMSCs具有低免疫原性以及稳定表达外源基因的能力。在移植治疗中，一般情况下，移植物会引起宿主的免疫排斥反应，但对于BMSCs来说却不是这样，BMSCs属于未分化的前体干细胞，其表型分化尚不成熟，因此BMSCs移植同种异体后无排斥反应或反应较弱。Lazarus18J将体外培养扩增的不同浓度BMSCs通过静脉注入自愿者体内，结果发现直至输入量达到5107均未发生免疫排斥反应。实验19也表明BMSCs可以抑制T细胞的增殖从而导致免疫耐受。BMSCs在体外培养，可以大量增殖并表达外源基因。实验证实，附壁生长的BMSCs导入外源性基因，可在体内高效、长期的表达。据报道20，转入人工IL-3基因的BMSCs仍具有旺盛的增殖能力，可以维持分泌IL-3六个月(传17代)；Dao及Naha等研究得到相似的结论21，将人IX因子基因导入BMSCs，在体外可以获得较好的表达，再植入免疫缺陷SCID小鼠体内，可以长期有效地产生有活性的人IX因子，2个月后，供体BMSCs在受体肝脏、胸腺达0203，证实了导入外源性基因的BMSCs仍具有增殖能力。Studenyt22采用腺病毒载体将干扰素(Interferon beta，IFN)转染成人BMSCs (IFN - BMSCs)，发现IFN - BMSCs与MDA231乳腺癌细胞或A375SM黑色素瘤细胞共培养后，均可以抑制肿瘤细胞的增殖，在MDA231或A375SM细胞肺转移模型中，静脉注射IFN- BMSCs可以明显延长动物生存期，组织学发现肿瘤组织中广泛分布有IFN- BMSCs。上述研究表明BMSCs可以做为基因治疗中的理想载体。二.BMSCs在胶质瘤治疗中的研究。现阶段利用BMSCs治疗胶质瘤主要是利用其作为基因治疗的载体和直接修复损伤的组织的功能。1.BMSCss在胶质瘤中的迁移分化利用BMSCs良好的趋瘤性，Nakamura等23采用Fischer344鼠系来源的BMSCs进行体内趋瘤生长实验研究。他们采用立体定向技术将标记有增强绿色荧光蛋白(EGFP)的BMSCs注入9L胶质瘤鼠同侧及对侧大脑半球，14天后对脑组织切片进行分析，结果显示无论来自同侧与对侧注射的BMSCs最终绝大部分聚集在瘤体与周围正常脑组织交界部位，而肿瘤内注射者则相对均一地布满于整个肿瘤床，周围正常脑组织未见BMSCs的出现。通过共聚焦激光显微镜显示这些聚集的EGFP-BMSCs很好地保留了其纺锤样细胞形态，这也在一定程度上说明了EGFP-BMSCs良好的组织相容性。此外，Hirofumi等24在实验中除发现被移植入瘤床或瘤周组织的BMSCs最终也定位在胶质瘤与正常脑组织交界部位外，还可形成类似胶囊样结构，起到包裹、限制胶质瘤增殖外延，保护正常脑组织的作用。2.BMSCs作为载体携带目的基因或药物的研究研究BMSCs肿瘤趋向性的目的是利用BMSCs良好的载体特性来携带外源目的基因或药物到达胶质瘤床及其浸润部位，以达到纠正肿瘤细胞基因异常、逆转细胞恶性表型和/或杀死肿瘤细胞的目的。当前实验多以此出发，积极探索各种有效治疗靶基因与BMSCs的整合及其在体内的分布表达，以达到有效治疗胶质瘤的目的。高剂量的干扰素(IFN-)在体外显示了良好的抑瘤作用，但体内因其高剂量产生的毒性常使其应用受到限制。为检验转导IFN-基因的hBMSCs在体内是否可以高水平表达IFN-并降低药物毒性，安全有效地发挥治疗胶质瘤作用，Nakamizo等25用Ad-IFN-转导hBMSCs进行体内外研究。他们首先从hBMSCs-IFN-和U87胶质母细胞瘤细胞共培养实验中得到证实，即使hBMSCs-IFN-在极低浓度(0.1)下仍可有效抑制胶质瘤细胞生长。通过transwell实验证实这种抑瘤作用与hBMSCs-IFN-的剂量具有显著正相关性。随后他们将不同剂量的hBMSCs-IFN-注入U87胶质母细胞瘤裸鼠模型瘤床(两种剂量即2.5104和2.5105细胞)、远离肿瘤的皮下组织(2.5105细胞)和颈动脉(106细胞)内，以PBS、hBNSCs-gal作对照，结果发现瘤床内2.5105hBMSCs-IFN-剂量注射组和颈动脉内注射组实验动物生存期较对照组有明显延长，而2.5104剂量注射组和经皮下远离肿瘤注射组均没有起到有效的抑制肿瘤生长作用，这些结果显示了在胶质瘤基因或药物治疗中一定的目的基因或药物浓度和适当的注射途径是尤其重要的。Nakamura等23将Ds-Red2标记的9L鼠胶质瘤细胞分别与BMSCs和正常鼠肾细胞(NRK)细胞共培养，三天后通过流式细胞术检测细胞总数和Ds-Red2阳性细胞数，发现与BMSCs共培养的9L胶质瘤细胞比NRK组表现出更为明显的抑制作用。为检测这种抑瘤作用是否与BMSCs上清液中的溶解因子密切相关，他们利用transwell双室培养体系对BMSCs上清液进行实验，结果与事先推测一致，BMSCs通过自分泌的溶解因子对肿瘤起到了直接的生长抑制作用。随后，他们用腺病毒将先前证实具有抗瘤作用的interleukin-2(IL-2)转导BMSCs进行体内实验。结果发现胶质瘤内注射BMSCs-IL2组的9L胶质瘤鼠生存期(26322d)较BMSCs组(220408d)、BMSCs-EGFP组(21315d)和9L组(17111d)均有明显延长。在检测瘤周炎症组织时他们发现BMSCs-IL-2治疗组的瘤周有大量CD4、CD8阳性淋巴细胞聚集，而未用IL-2基因修饰的BMSCs组则很少出现。以上这些初步研究结果向我们显示了BMSCs的良好的载体特性和抑瘤生长特性。BMSCs作为一种新的基因治疗载体，具有相对较高的携带和表达外源基因的能力，而进入到肿瘤床的目的基因可以通过直接或间接的作用发挥其良好的治疗效果3、 BMSCs修复胶质瘤瘤床与手术损伤、改善神经功能的研究Aboody等26认为脑胶质瘤治疗难度之一在于它独特的损伤部位，大多数胶质瘤可通过其局部占位、瘤周侵袭及组织坏死等破坏正常脑组织结构，使包括外科切除在内的各项综合治疗措施无法从根本上弥补这种损伤造成的功能缺陷，这也就给病人的术后带来极大负担。然而随着对干细胞认识的深入，近年认为BMSCs和其它神经前体细胞一样，具备组织损伤反应性和修复损伤脑组织、重建缺失神经结构的巨大潜能。研究者发现经BMSCs移植后的近脑肿瘤部位除可见大量细胞外基质，如I型、型胶原蛋白，纤维连接蛋白和基底膜层粘蛋白外，还存在多种细胞因子，包括IL-7、IL-8、IL-11、干细胞因子、神经营养因子、集落刺激因子-l(CSF-1)、骨形成蛋白(BMP)及造血调节分子等。据推测微环境中这些溶解因子在BMSCs进行损伤组织修复过程中将发挥重要调节作用，但具体机制还不清楚。初步研究结果提示BMSCs尚有可能通过其自身的合成与分泌各种促生长因子，与受损组织相互作用诱导分化出神经功能细胞，完成胶质瘤及手术引起的损伤脑组织的自我修复与重建。4. BMSCs的胶质瘤趋向性机制目前研究较多的是BMSCs作为胶质瘤基因治疗的靶向载体，关于BMSCs的胶质瘤趋向性机制尚不清楚。BMSCs的迁移过程可能有多种因素参与，肿瘤细胞、肿瘤间质细胞或肿瘤内皮细胞分泌的可溶性因子可能介导BMSCs的胶质瘤趋向性。研究表明，移植后的BMSCs在体内定向于局限性或广泛性的病变，如胶质瘤、神经退行性疾病27-29，能产生这种现象的一些因子属于趋化因子超级家族，如CXCR4CXCLl2(SDF-1)、C-kitSCF、VEGF受体VEGFRVEGF等。产生趋化因子或细胞因子是许多脑病变的一种共有特征，包括脑恶性肿瘤，它表明这些因子在介导BMSCs对病灶的反应中具有重要意义30-32。BMSCs向病灶定向迁移性或亲病灶性的分子基础尚不清楚，不同的病变可能涉及不同的因子。例如BMSCs的迁移往往由于BMSCs本身具有CXCR4受体，而胶质瘤分泌其配体SDF-l，但人类多种胶质瘤系如U87胶质瘤本身就有CXCR433，CXCR4可以促进胶质瘤的侵袭性34。另外，相同的因子对不同的BMSCs的作用并不一致。例如，VEGF被报道诱导人类神经干细胞向脑胶质瘤定向趋化35，但在人类BMSCs的胶质瘤迁移中不起作用36 。上述研究表明，这些因子在BMSCs靶向胶质瘤迁移过程中发挥重要作用，但它们可能只是诱导迁移的诸多因素之一，更详尽、准确的迁移机制需要进一步阐明。三存在问题和应用前景目前虽然对于BMSCs在脑胶质瘤基因治疗的实验性应用研究已取得了一定进展，但该领域的研究尚处于探索阶段，以下问题有待解决：分离、纯化：目前所获得的间充质干细胞均为多种细胞的混杂群体，如何才能有效地获得纯的细胞群体，有待对其细胞学特点和分化各阶段细胞标志物的进一步研究。BMSCs的增殖、分化的控制均需要合适的条件，如何既控制增殖，又避免形成肿瘤，而且还能在适当的时候启动沿所需路径的分化，还有待进一步研究。BMSCs基因治疗所面临的靶向性、转染效率持续表达、可控性需进一步研究改良。临床实践中转基因细胞的数量不足是基因治疗效果不理想的主要因素之一，如何提高转染效率、富集转基因细胞仍待进一步研究。目前虽尚无关于BMSCs移植后颅内成瘤性方面的报道，但由于其具有免疫抑制作用，长时间体外扩增还有发生恶性转化可能，所以需要进一步的实验验证BMSCs临床应用的安全性，为其合理应用提供良好保证。总之，BMSCs由于其具有细胞来源广泛、易于外源基因转染和表达等诸多优点是脑胶质瘤靶向性基因治疗中具有潜在实用价值的细胞载体，将在脑胶质瘤的治疗中展现美好的应用前景。参考文献：1.Hakim R,Loeffler JS,Anthony DC,et al.Gangliogliomas in adultsJ. 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