高效毛细管电泳

高效毛细管电泳,生物基础实验中心生物化学分室2010年10月,CapillaryElectrophoresis(CE),毛细管电泳的组成部分,毛细管电泳仪的基本结构,毛细管电泳的特点,高分离效率-HighPerformance毛细管电泳：超高分辨率分离时代的来临（Science2002,1441）快速-HighSpeedSecondsMinutes分析范围广-Comprehensive离子()小分子大分子病毒细胞(um)经济-LowCost试剂消耗可用分（￥）来计算环保-Green水相分离体系，对人和环境无危害,高分离效率,毛细管电泳灵活多样的模式选择,毛细管区带电泳（CZE）毛细管凝胶电泳（CGE）毛细管等电聚焦（CIEF）毛细管胶束电动色谱（MEKC）亲和毛细管电泳（ACE）非水相毛细管电泳（NACE）毛细管电色谱（CEC）,OneInstrument,第一章毛细管区带电泳(CZE),毛细管区带电泳(CZE),无凝胶，无表面活性剂最基本最常用，分辨率高，操作简单离子化合物蛋白纯度构型确认分析,什么是电泳Electrophoresis?,带电的分子在电场的作用下发生移动,电压、电流、功率,贝克曼毛细管电泳：电压：030kV(300-500V/cm)电流：0300uA(150uA)功率：09W,毛细管电泳分离过程,电渗流(ElectroosmoticFlow,EOF),电渗流,纯电泳,电渗流+电泳,表观速度=电渗流速度+电泳速度,电渗流的正面及负面作用,正面作用增加分离速度使得正、负电荷物质同时分离,负面作用减少分离时间和分离有效距离电渗流的波动极大的影响了迁移时间的重复性,电渗流的影响因素-1.pH值,电渗流的影响因素-2.温度,温度升高，电渗流降低；温度变化1%，迁移时间变化2-3%；液体制冷：更高的电压、更高的离子强度和更大内径的毛细管；,电渗流的影响因素,3.毛细管壁的吸附4.离子强度离子强度越高，电渗流越小5.缓冲溶液添加剂离子型表面活性剂、有机溶剂、环糊精,出峰时间不断拖后？涂层毛细管,毛细管的预处理,外壁：聚酰亚胺涂层窗口的制做：3-5mm非涂层：烧制，酸腐蚀，刀刮涂层：浓硫酸，加热活化/预处理：非涂层：甲醇，NaOH，水，缓冲液涂层：HCl，水，缓冲液,进样方法的选择,(1)压力进样0.1-25psi(2)电动进样1-10kV(3)重力进样,CGE选择性进样样品的富集,定量分析更准确,如何提高进样准确度？,CZE分离条件的选择,毛细管类型-涂层还是非涂层？毛细管长度-长毛细管还是短毛细管？毛细管内径-粗毛细管还是细毛细管？缓冲液体系-种类和pH值添加剂类型-甲醇|环糊精|乙腈检测器选择-紫外|二极管阵列|激光诱导荧光,CE检测器种类及性能,检测器,UV:蛋白/DNA，PI，纯度，相互作用200,214,254,280nm涂层毛细管需用UV,检测器,PDA:蛋白分子量SDS-Mw，有波长校正功能,小分子检测,有紫外吸收首先选择二极管阵列检测器或紫外检测器无紫外吸收-可以衍生化的，可以采用自外衍生的方法再用紫外检测器检测，如氨基酸、还原性糖等-不可以衍生化的，可采用间接紫外法用紫外检测器检测，也可以尝试电化学检测器有荧光或需要高灵敏度检测的可采用LIF检测器需要测定结构或者难以用光学检测器检测的，可以考虑质谱检测,大分子检测,蛋白、核酸-可以首先选择紫外检测器-如果需要高灵敏度检测可以采用柱前或者柱上衍生的方法标记荧光，然后用LIF检测-如果需要特异性检测，可使用特异性荧光探针，标记后再LIF检测-需要测定分子量或氨基酸序列，可采用质谱检测多糖-含量较高的多糖可以采用末端吸收法以紫外检测器检测-含量较低的还原性多糖可用衍生试剂标记后以LIF、UV的方式检测,检测器,激光诱导荧光(LIF)488，635nm蛋白化学标记：FITC488520罗丹明488560免疫标记DNA标记引物嵌合糖谱APTS标记,第二章毛细管凝胶电泳（CGE）,毛细管凝胶电泳(CGE),双功能胶(纤维素及衍生物溶液5%，每次更新)动态涂层，增大黏度，降低EOF；筛分胶；涂层毛细管蛋白分子量测定(SDS-Mwkit)核酸片断分析(dsDNA1000kit),蛋白质分子量的测定,SDS-Mw分子量测定双功能胶CGE,ssDNA100-RkitdsDNA1000kit,单链和双链核酸分析,寡核苷酸,PCR产物,第三章分离条件选择流程,分离条件的选择是毛细管电泳中最重要但也是最难之处。不同的专业研究工作者可能会有各自不同的选择策略和流程，我们提出如下九步选择流程，仅供参考：第一步，尽可能多地了解分离样品的类型、来源、组成及其性质；第二步，根据样品的可能性质和来源，选择分离模式，若无样品信息可先选CZE；,第三步，根据样品性质确定检测方法，一般先选直接紫外吸收；第四步，确定样品处理方式，包括衍生方案以及离心过滤除蛋白等；第五步，根据样品解离常数计算最佳pH，或利用75mID毛细管和磷酸缓冲体系确定pH范围;,第六步，根据所需pH构建缓冲体系，包括进一步优化pH、缓冲试剂浓度等；第七步，优化其他操作参数，如毛细管尺寸、分离电压和温度等；第八步，确定是否需要使用添加剂和使用非水溶剂；第九步，确定是否需要换用其他分离模式。,在毛细管电泳条件选择中，还应充分注意下列操作事项：1)最好对样品和缓冲液进行过滤或离心处理。2)毛细管的洗涤或平衡，与缓冲体系、pH以及柱子有关。磷酸根与石英和玻璃之间存在慢相互作用，需要延长平衡或冲洗时间，处理的时间应由分离重现性决定。,3)欲降低缓冲液的电导，应尽量使用所谓的“生物缓冲试剂”；欲降低检测背景，则应尽量使用无机缓冲试剂。4)欲保持分离重现，要尽量采用相同的条件，包括毛细管、缓冲液、温度、电压、洗涤等。,第四章各类物质的分离要点,阴离子及有机酸-此类物质没有紫外吸收，要采用间接检测法;-间接紫外法一般以铬酸钠等物质作为背景吸收物;-CTAB通常用作电渗流反向剂，以加速出峰，提高峰的尖锐度;-要使用反向极性分离;,阳离子及金属离子的分离-此类物质没有紫外吸收，要采用间接检测法;-间接紫外法一般以氨基吡啶等物质作为背景吸收物;-与阴离子不同的是阳离子的分析不需要在缓冲溶液中添加电渗流反向试剂;-也不需要使用反向极性分离;,易电离有极性的化合物-一般采用长60cm的毛细管;-分离的最佳pH在分析物pKa+/-1左右;-通常不需要添加剂;,弱极性物质和水溶性差的物质（一些中药成分、农药等）-要注意分析物的溶解性，防止在毛细管中的沉淀;-通过有机溶剂的添加，提高分析物在buffer中的溶解度添加SDS，增加溶解度;-降低样品中分析物的浓度，延长ramptime也可以防止分析物的析出;,还原性的单糖、寡糖和多糖（葡萄糖、半乳糖等及其聚合物）-通常无紫外和荧光，注意检测问题;-可用APTS等衍生试剂衍生，使其带上电荷和紫外/荧光基团;-多糖也可以采用末端吸收来检测（180-200nm），不需要衍生化处理，但是要尽量采用高pH使得羟基部分电离带电;,非还原性的单糖、寡糖和多糖-很难采用衍生的方法检测，通常对单糖和寡糖采用间接检测法;-对多糖采用末端吸收的方法来检测;-通常采用高pH使得羟基部分电离带电;-高pH缓冲液还有防止多糖在毛细管内壁吸附的作用;,单链核苷酸、双链核苷酸片断及PCR产物-容易在毛细管内壁吸附，通常需要使用涂层管或者对毛细管进行动态涂层;-分子筛原理，凝胶的种类和浓度决定了分辨率的最佳范围和大小;,多肽及蛋白质-一般来说小的肽段不需要考虑在毛细管内壁的吸附问题;-对于大的肽段和蛋白质一定要考虑在毛细管内壁的吸附，可采用极端pH和涂层毛细管的方法来避免吸附;-在使用极端pH条件的时候，通常都是用正向电压分离;-在使用涂层毛细管时通常没有电渗流，而蛋白是两性物质，需要仔细考虑使用涂层管时的分离极性,毛细管电泳广泛的分析范围,阴/阳离子定量检测小分子化合物手性拆分碱性药物天然产物/中药成分分析生物小分子及代谢产物测定临床诊断标志物测定及发现核酸/基因分析氨基酸/多肽/蛋白分析,第五章P/ACEMDQ使用注意事项及保养,毛细管的切割及窗口制备,毛细管切割时用力不能过大，不可压断毛细管；仅需切割一次，不可来回切割；非涂层毛细管的窗口可使用火烧、强酸腐蚀、刀刮等方式制作，窗口的大小以3mm左右为最佳，最好不要超过5mm，窗口过大时易导致毛细管的折断(尤其是LIF检测器中)；涂层毛细管的窗口只可采用强酸腐蚀、刀刮的方式制作，切勿用火。,毛细管的活化,非涂层管：甲醇(5min)水(5min)0.1MNaOH(15-30min)水(5min)缓冲液(5-15min)涂层管：0.1MHCl(2min)水(2min)缓冲液(2min)，绝对不能用碱冲洗毛细管，也不可采用pH超过8的缓冲液,非涂层毛细管的使用及提高重复性,新毛细管应严格按照前处理步骤进行清洁处理样品之间的冲洗步骤应只以buffer冲洗为佳，避免NaOH、水等物质的冲洗。冲洗的时间3-5min，若重复性不佳，可提高冲洗压力或延长时间若以上步骤还是难以达到理想重复性，每次出峰时间的后移，则有样品吸附。需用0.1NaOH冲洗0.5-2min，再用水和Buffer较长时间冲洗，以确保buffer与毛细管内壁之间的平衡稳定形成,非涂层毛细管的使用及提高重复性,SDS或CTAB等表面活性剂与毛细管表面之间的平衡较慢，此类实验一般不采用NaOH冲洗毛细管，而是采用buffer的长时间冲洗和预电泳来提高实验的重复性。当实验进行到一定次数以后再用NaOH来清洁毛细管，并用buffer长时间冲洗获得平衡；实验结束以后要用buffer长时间冲洗毛细管，然后将毛细管两端用buffer封上，来防止毛细管内溶液蒸发干。,毛细管的保存,非涂层管：第二天继续使用：NaOH,Buffer冲洗，两端用Buffer封闭；一段时间不使用：NaOH,水，空气；下次使用前重新活化；涂层管：水洗，两端用水封闭，4度存放。由于涂层管消除了电渗流和物质在毛细管内壁的吸附，通常来说重复性是非常令人满意的，如果涂层管出现重复性不佳的情况，则很有可能是涂层的损坏。如何判断毛细管的寿命到了：pH不是太高的条件下，裸管的正常使用次数500-1000次；分离效果变差，出峰时间拖后；NaOH、水、空气冲洗，再重新活化后，看分离效果和出峰时间是否可恢复。,卡盒部件,毛细管安装和拆卸时都有固定的方向，不能装错方向。,卡盒部件,毛细管的长度调节通过调节冷却软管长度来实现，更换新冷却软管的时候一定要注意两端的O形垫圈不要漏垫，深蓝色的Ferrule安装方向要注意，如图所示。浅蓝色的TubingNut不可旋得过紧,卡盒部件,检测窗口的安装应该是在将毛细管两端卡好并切割完毕以后；PDA检测器只可使用标识为8的窗口，UV检测器8和2的标识窗口都可以使用。UV及DAD检测窗口由卡盒的背面向正面插入，且不可插错方向。检测窗口安装之前一定要确保其内没有保留有未取出的黑色O形垫圈将DAD检测窗口安装后一定要将O形垫圈装入,样品瓶及托盘,2mL缓冲溶液瓶的液面高度不得低于1/2，也不可超过瓶颈；2mL缓冲溶液瓶瓶口和瓶颈内部不得沾有液体，如果有液体存在，要将瓶口和瓶颈内壁的液体擦干再盖瓶盖。否则瓶盖易滑出，从而导致毛细管及电极的折断。瓶盖上的液体残留可能会导致漏电现象发生，当发现缓冲溶液瓶盖上有液体时一定要立即擦干或更换；废液瓶要及时清理，不可过满，过高的废液量既会污染毛细管，也会造成气路的阻塞,样品瓶及托盘,三种标准配置的缓冲溶液及样品瓶各有其相对应颜色的瓶盖，不可混用；缓冲溶液瓶盖及样品瓶盖均不可用洗涤剂长时间浸泡，不可用有机溶剂洗涤或放入烘箱烘干，会导致瓶盖的老化；样品瓶帽如使用时间过长或被试剂腐蚀后，可能会出现瓶帽失去弹性而变硬，此种瓶帽不要使用；200uL的PCR管不要重复使用；使用的缓冲溶液应过滤，样品应过滤或离心,样品瓶及托盘,仪器运行期间不得打开SampleCover，只有托盘在Load状态才可以打开SampleCover和CartridgeCover。在直接控制面板和程序冲洗过程中可打开SampleCover，可利用检查毛细管工作状态；如在仪器运转中，出现样品瓶或其它异物调入舱中，应立即关机，将异物找出。,冷却液系统及电极,冷却液只需要罐装到3/4的高度；在仪器使用完毕后，让样品盘在Load状态下，先将留在卡盒中的冷却液回流才能关闭主机；电极应每月清洁，先采用湿水棉擦拭，再用酒精棉擦拭以确保其导电性；当灯箱部分和卡盒冷却液管出现黑色脏迹后可用酒精棉擦拭清除，注意：InterfaceBlock下面处于两电极之间的部分也要用酒精棉擦拭，以去除灰尘，防止CurrentLeakage,检测器及部件,检测器UV/DAD/LIF不用时，应该放入干燥箱中保存；拆换检测器前必须先关闭仪器主机电源；建议每次开机后做波长校正；光纤不使用时必须用塑料帽盖好放置，光纤不可折压；光纤接头的拆装：对于UV/DAD检测器，安装光纤接头的顺序是由下至上，拆卸光纤接头的顺序是由上至下。,检测器及部件,PDA的透射光谱，曲线最高点应高于5000，否则说明投射能量有问题，需清洗光纤探头。当发现毛细管检测窗口有断裂并有液体流出污染检测孔径及光纤接头时，应立即清洗孔径和光纤探头。如何清洗光纤探头？用清水冲洗光纤接头，并立即用洗耳球吹干，尽量不用有机溶剂冲洗。如光纤有油，用醇快速清洗，洗耳球吹干，避免乙醇使劲擦。,氘灯的使用,寿命：2000h(3000-4000h),Diagnostic