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-本文为网络收集精选范文、公文、论文、和其他应用文档,如需本文,请下载-vWF和HDAC1在胃癌细胞株BGC823中的表达及对细胞粘附侵袭迁移能力的影响本文从网络收集而来,上传到平台为了帮到更多的人,如果您需要使用本文档,请点击下载按钮下载本文档(有偿下载),另外祝您生活愉快,工作顺利,万事如意!【摘要】 目的: 研究 血管性血友病因子(vWF)及组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)在人胃癌细胞株BGC823中的表达及对细胞粘附、侵袭、迁移能力的 影响 ,并探讨其机制. 方法 :体外培养人胃癌细胞株BGC823,分别以vWF抗体(vWF Ab)及HDAC1抗体(HDAC1 Ab)作用处理;用RTPCR和免疫细胞化学方法检测细胞中vWF和HDAC1的表达及相互作用. 噻唑兰比色(MTT)法检测对细胞外基质成分型胶原粘附能力的变化;Boyden小室法检测细胞侵袭、迁移能力的改变. 结果:BGC823细胞能够表达vWF和HDAC1;经HDAC1 Ab处理后,细胞中vWF mRNA相对含量由处理前的增加到,vWF蛋白表达增强;vWF Ab处理组细胞的粘附率较未处理组明显下降(P );vWF Ab处理组细胞侵袭、迁移穿膜细胞数分别为和,与空白对照组相比较差异具有统计学意义(P ). 结论:人胃癌细胞株BGC823能够表达vWF 及HADC1;HDAC1可调节vWF的表达;vWF在 BGC823细胞的粘附、侵袭及迁移过程中起重要促进作用. 【关键词】 胃肿瘤;细胞系,肿瘤;von willebrand因子;组蛋白去乙酰化酶1;肿瘤转移 【Abstract】 AIM: To investigate the expressions and effects on adhesion, invasion and motility of von Willebrand factor (vWF) and histone deacetylase 1 (HDAC1) in human gastric cancer cell line BGC823 in vitro and the related mechanism of antimetastasis. METHODS: Human gastric cancer cell line BGC823 cultured in vitro were treated respectively with vWF antibody (vWF Ab) and HDAC1 antibody (HDAC1 Ab). The expressions of vWF and HDAC1 in BGC823 were detected by RTPCR and immunocytochemistry. The effects of vWF and HDAC1 on the adhesion, invasion and motility of human gastric cancer cell line BGC823 in vitro were explored respectively by MTT colorimetric assay and Boyden chamber. RESULTS: The human gastric cancer cell line BGC823 expressed vWF and HDAC1. After treatment with HDAC1 antibody, the expression level of vWF mRNA in BGC823 was increased from about to , and the expression of vWF protEin was increased. Compared with the control group, the adhesion, invasion () and motility () abilities of the BGC823 cells were decreased significantly (P ) after treatment with vWF antibody. CONCLUSION: Human gastric cancer cell line BGC823 can express vWF and HDAC1, and the expression of vWF can be regulated by HDAC1. vWF takes an important part in the adhesion, invasion and motility of the BGC823 cells. 【Keywords】 stomach neoplasms; cell line, tumor; vWF; HDAC1; neoplasm metastasis 0 引言 血管性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)生理状态下参与凝血的发生,但 目前 临床研究报道其与结肠癌1、骨肉瘤2和恶性黑色素瘤3等肿瘤的转移也有密切关系. 组蛋白去乙酰化酶1(histone deacetylase,HDAC1)作为调控基因的关键酶,参与了vWF的转录调节4,其功能异常也被证实与恶性肿瘤的发生和 发展 有关5. 截至目前,关于vWF和HDAC1对胃癌细胞转移能力影响的体外研究尚少见报道. 我们以胃癌细胞BGC823为研究对象,采用vWF抗体及HDAC1抗体进行体外干预,观察vWF和HDAC1的表达、相互作用和对细胞粘附、侵袭、迁移能力的影响,并初步探讨其作用机制. 1 材料和方法 材料 RPMI1640(美国Gibco公司);胰酶(美国Amresco公司);超级新生牛血清(FBS)(杭州四季青生物工程有限公司);型胶原(兰州大学病理研究所自制);四甲基偶氮唑蓝(MTT)及牛血清白蛋白(BSA)(美国Sigma公司);兔抗人vWF多克隆抗体(Ab6994,英国Abcam公司);兔抗人HDAC1多克隆抗体(BA0914)及SP免疫组化试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司);Trizol试剂、RTPCR两步法试剂盒及焦碳酸二乙酯(DEPC)(上海生物工程有限公司);目的基因、内参引物及Marker(D512A)(TakaRa);博伊登(Boyden)小室与多聚碳酸酯膜( m孔径)(美国Millipore公司);人胃癌细胞株BGC823( 中国 科学 院上海细胞生物研究所). 方法 细胞培养 用含100 mL/L灭活新生牛血清的RPMI1640培养液(含105 U/L青霉素、100 mg/L链霉素)在37 50 mL/L CO2及饱和湿度的培养箱中维持培养. SP法免疫细胞化学染色 取对数生长期BGC823细胞,消化离心后,将细胞悬液加入已预置无菌小玻片的12 孔板中,每孔含细胞2104个,培养36 h后,取出盖玻片,PBS 洗3次,4无水乙醇固定. 免疫组化参照试剂说明书进行,苏木精轻度复染,脱水透明,显微镜下观察结果. PBS代替一抗做阴性对照. 判断标准:HDAC1以细胞核呈清晰棕黄色颗粒为阳性细胞,vWF以细胞浆出现棕黄色颗粒为阳性细胞. RTPCR 细胞处理 实验分为对照组:无任何干预,细胞在37 50 mL/L CO2条件下培养 48 h后检测vWF mRNA及HDAC1 mRNA表达;vWF Ab处理组:用20 g/mL vWF Ab作用细胞 48 h后,检测HDAC1 mRNA表达;HDAC1 Ab处理组:用10 g/mL HDAC1 Ab作用细胞 48 h后,检测vWF mRNA表达. 两步法RTPCR 用 Trizol试剂提取细胞总RNA,参照AMV第一链cDNA合成试剂盒说明书操作合成cDNA,以OligodT为引物反转录,vWF及HDAC1特异引物进行PCR扩增,vWF的引物序列为,上游5 ATAGGAGCACACCCCTTGC 3,下游5 CACTTTGTCGCCCATTATCC 3,大小为141 bp;HDAC1的引物序列为,上游5 CTCTCCAGCTCTGGCTTCC 3,下游5 AGACCTGGCACCCTTTATGG 3, 大小为234 bp;以GAPDH为内参照,引物序列为,上游5 TTCTCCCCATTCCGTCTTCC3,下游5 GTACATGGTATTCACCACCC 3,大小为456 bp. 反应条件:vWF及GAPDH条件一致:94变性 4 min, 94 30 s, 52 40 s, 72 50 s,共循环36次后72延伸5 min;HDAC1为94变性4 min, 94 30 s, 54 40 s, 72 50 s,共循环45次后72延伸5 min. 扩增产物进行 g/L琼脂糖凝胶电泳,电泳图像经凝胶成像扫描仪 分析 ,比较vWF和HDAC1相对表达量. 粘附抗体抑制实验 分别将20 g/mL vWF Ab和10 g/mL HDAC1 Ab加入RPMI1640培养基中,与BGC823细胞共培养48 h;将96孔板预先用3 gmL 型胶原20 L孔包被,20 mL/L BSA封板处理,加入调好的细胞悬液200 L孔(5105个mL);CO2培养箱分别孵育30,60,90和120 min后,弃去培养液,PBS冲洗除去未粘附细胞;弃PBS后加入MTT 20 L,及无血清RPMI1640 200 L,CO2孵育3 h;吸弃培养孔内上清液,加入二甲基亚砜(DMSO) 200 L溶解,噻唑兰显色,酶联免疫检测仪570 nm处测各孔吸光度(A570 nm)值,同时设立相应的RPMI1640培养对照组. 各组重复3次. 体外侵袭抑制实验 分别将 20 g/mL vWF Ab, 10 g/mL HDAC1 Ab和vWF Ab及HDAC1 Ab混合液加于无血清RPMI1640培养基中,与BGC823细胞共培养 48 h,对照组不做抗体处理;在Boyden小室的下室加入含有 500 mL/L FBS的培养液200 L,上下室之间用孔径8 m的聚碳酸酯膜分开,膜上均匀铺浓度为3 gmL 的型胶原50 L室,将小室置于37温箱中聚合30 min. 上室内加入预处理的细胞悬液200 L室(含2105个细胞),37 50 mL/L CO2条件下放置48 h. 弃上室液体,用棉签擦掉膜上未侵袭细胞及胶,PBS洗3次,950 mL/L乙醇固定15 min,常规HE染色. 结果判定:在400倍光镜下每个滤膜分别计数5个视野的穿膜细胞数, 计算 平均每个视野的细胞数. 实验组和对照组重复3次. 按下式计算抗体作用对细胞侵袭的抑制率(IR): IR(%)=(1-实验组平均侵袭细胞数/对照组平均侵袭细胞数)100%. 体外迁移抑制实验 细胞处理同侵袭实验,聚碳酸酯膜表面不铺胶,其余步骤同侵袭实验. 通过计
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