LiCl对IDH2突变的神经胶质瘤细胞增殖及迁移影响的研究.doc

LiCl对IDH2突变的神经胶质瘤细胞增殖及迁移影响的研究【摘要】：神经胶质瘤是颅内常见的恶性肿瘤,具有发病率、复发率、死亡率高和治愈率低的“三高一低”的特点,依照WHO组织病理学和临床标准,人类大脑神经胶质瘤分为I-IV级,WHOIV级被认为是神经胶质母细胞瘤,在成年人群中,是主要盛行和恶性的原始大脑肿瘤。异柠檬酸脱氢酶(isocitratedehydrogenase,IDH)是一类酶家族,在人基因组中,有5类IDH基因可编码3类异柠檬酸脱氢酶：IDH1,IDH2和IDH3,均可催化异柠檬酸(ICT)生成还原性辅酶(NADPH)和-酮戊二酸(-KG)。研究发现,IDH1(R132)突变在继发性胶质母细胞瘤和低级别神经胶质瘤中发生率较高,IDH2(R172)突变则较低,IDH1和IDH2突变都是单一位点的氨基酸突变。IDH1突变后其催化活性降低,相对应的酶促反应产物NADPH和-KG的产量下降,但同时又使其获得了一种新的酶促活性,催化NADPH和a-KG生成2-HG。IDH突变后,细胞内HIF-1稳定性提高,进而调节其下游靶基因的表达,促进肿瘤细胞的生长。当前,肿瘤细胞内微环境是癌症研究领域的核心问题,对肿瘤生长、迁移的生物学机制的正确理解,有助于为针对神经胶质瘤的增殖和迁移相关信号分子的靶向药物的设计和筛选提供理论和实验依据。本课题拟在前期工作和思路的基础上,探讨在IDH突变的真实细胞内环境下,氯化锂在调节神经胶质瘤中与增殖和迁移相关的信号分子的作用机制。本实验首先将穿梭质粒pEGFP-N1、重组质粒pEGFP-N1-IDH2R172G和pEGFP-N1-IDH2转染大鼠神经胶质瘤C6细胞株,通过WesternBlot实验检测细胞内低氧诱导因子(HIF-1)、细胞周期蛋白(CyclinD1)、血管内皮生长因子(VEGF)和M2型丙酮酸激酶(M2-PK)的蛋白表达水平,利用明胶酶谱实验,对基质金属蛋白酶-2,9(MMP-2,9)的分泌水平进行检测。实验结果表明,IDH2突变可提高细胞内HIF-1a稳定性,CyclinD1、VEGF、MMP-2,9、M2-PK的表达量明显提高。说明IDH2突变后,酶活性下降,导致催化产物-KG量减少,HIF-1稳定性提高,进而引起HIF-1的下游靶基因CyclinD1、VEGF、MMP-2,9的表达量提高。体外划痕擦伤实验结果表明,在pEGFP-N1-IDH2R172G处理组中,划痕两侧细胞向划痕中央生长的速度较pEGFP-N1和pEGFP-N1-IDH2处理组快。LiCl是应用在治疗抑郁症和极端情绪方面重要的药物,可抑制肌糖单磷酸酶和糖原合酶激酶-3(GSK-3)活性。GSK-3是在所有真核细胞中发现的一种多功能的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶,可以调节许多过程,包括新陈代谢、细胞分化和死亡等。LY294002可通过抑制Akt磷酸化等来抑制PI3K/Akt信号途径,从而使GSK-3磷酸化水平降低,活性提高。本研究利用LiCl和LY294002对细胞内GSK-3的磷酸化水平进行调节,分析细胞内GSK-3的磷酸化水平对IDH2突变的C6细胞株增殖活力的影响。WesternBlot实验结果表明,LY294002可以降低GSK-3的磷酸化水平,而LiCl不能再提高已经被LY294002处理过的C6细胞内的GSK-3p的磷酸化水平,MTT实验结果表明,LY294002可以抑制细胞的增殖活性,并且pEGFP-Nl-IDH2组的抑制率总是高于pEGFP-N1组和pEGFP-N1-IDH2R172G组,而LiCl对LY294002处理之后的C6细胞的增殖活性没有影响。接着,本实验分析了LiCl对IDH2突变的C6细胞迁移和增殖的影响,MTT实验结果表明,锂离子可以降低细胞的增殖活性,推测是由于锂离子抑制GSK-3的活性之后,导致细胞内糖代谢发生紊乱,诱导了细胞的凋亡。在C6细胞中,无论IDH2是否发生突变,锂离子均可以导致HIF-1的稳定性降低,从而使C6细胞的增殖能力受到抑制,并且在野生型IDH2处理组中,HIF-1稳定性降低的程度高。在对照组EGFP和野生型IDH2处理组中,LiCl可使-catenin核积累量提高,但在突变型IDH2处理组中,-catenin核积累量却降低。通过明胶酶谱实验表明,在pEGFP-N1-IDH2R172G处理组中,MMP-2和MMP-9分泌水平提高的程度不如pEGFP-N1和pEGFP-N1-IDH2处理组中高,说明MMP-2和MMP-9分泌水平的提高还是由于IDH2突变的原因,Wnt/-catenin信号通路只是起到了比较微弱的作用。本研究工作试图揭示LiCl对IDH突变的神经胶质瘤细胞中相关信号通路分子调节作用,确定其抑制肿瘤细胞增殖和迁移的分子机制,进一步充实对目前有关IDH突变与神经胶质瘤生长和迁移关系的研究。【关键词】：神经胶质瘤异柠檬酸脱氢酶-2氯化锂迁移增殖【学位授予单位】：山西大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2013【分类号】：R739.41【目录】：中文摘要12-14ABSTRACT14-17第一章文献综述17-271.1异柠檬酸脱氢酶(isocitratedehydrogenase,IDH)突变对胶质瘤细胞中HIF-1的影响17-191.1.1神经胶质瘤171.1.2IDH突变的特点以及对HIF-1的影响17-191.2HIF-1对下游靶基因MMPs,VEGF和CyclinD1表达的影响19-211.3LiCl对肿瘤细胞中Wnt/-catenin及其他通路的调控作用21-221.4研究LiCl与IDH突变之间的关系和意义22-231.5论文设计思路23-271.5.1研究背景23-241.5.2实验目的和主要研究内容241.5.3实验方案及流程24-261.5.4研究的创新点26-27第二章C6细胞中IDH2突变对其迁移和增殖的影响27-412.1实验材料27-292.1.1细胞和质粒272.1.2酶和生化试剂27-282.1.3试剂的配制28-292.1.4实验仪器292.2实验方法29-332.2.1细胞培养29-302.2.2三种质粒转染C6细胞302.2.3三种质粒转染C6细胞后细胞内HIF-1、CyclinD1、M2-PK以及培养基内VEGF的表达水平分析30-322.2.4免疫荧光检测实验322.2.5明胶酶谱实验32-332.2.6体外划痕擦伤实验332.3实验结果33-392.3.1三种质粒转染C6细胞后细胞内HIF-1、CyclinD1、M2-PK以及培养基内VEGF的水平变化33-352.3.2C6细胞内HIF-1和VEGF的免疫荧光检测结果35-362.3.3明胶酶谱检测C6细胞内MMP-2,9的分泌水平36-382.3.4体外划痕擦伤检测C6细胞的迁移能力38-392.4讨论39-41第三章GSK-3的磷酸化对IDH2突变的C6细胞增殖活性的影响41-483.1实验材料41-423.1.1细胞和质粒413.1.2酶和生化试剂413.1.3试剂的配制41-423.1.4实验仪器423.2实验方法42-433.2.1细胞培养423.2.2三种质粒转染C6细胞423.2.3LiCl处理细胞423.2.4LY294002处理细胞423.2.5LiCl和LY294002作用分别转染三种质粒的C6细胞后细胞内GSK-3的磷酸化水平分析423.2.6LY294002作用分别转染三种质粒的C6细胞后对细胞增殖活力的影响42-433.2.7LY294002和LiCl先后作用分别转染三种质粒的C6细胞后对细胞增殖活力的影响433.3实验结果43-463.3.1LiCl作用分别转染三种质粒的C6细胞后细胞内GSK-3的磷酸化水平变化43-443.3.2LY294002作用分别转染三种质粒的C6细胞后细胞内GSK-3的磷酸化水平变化443.3.3LY294002和LiCl先后作用分别转染三种质粒的C6细胞后细胞内GSK-3的磷酸化水平变化44-453.3.4LY294002作用分别转染三种质粒的C6细胞后对细胞增殖活力的影响45-463.3.5LY294002和LiCl先后作用分别转染三种质粒的C6细胞后对细胞增殖活力的影响463.4讨论46-48第四章LiCl对IDH2突变的C6细胞迁移和增殖的影响48-564.1实验材料48-494.1.1细胞和质粒484.1.2酶和生化试剂484.1.3试剂的配制48-494.1.4实验仪器494.2实验方法49-514.2.1细胞培养494.2.2三种质粒转染C6细胞494.2.3LiCl处理细胞494.2.4LiCl作用分别转染三种质粒的C6细胞后对细胞增殖活力的影响494.2.5明胶酶谱实验49-504.2.6体外划痕擦伤实验504.2.7LiCl作用分别转染三种质粒的C6细胞后细胞内HIF-1的表达水平分析和-catenin的核积累量的分析50-514.3实验结果51-544.3.1LiCl作用分别转染三种质粒的C6细胞后对细胞增殖活力的影响51