黄瓜液泡膜H'+-PPase基因的cDNA克隆与表达分析-硕士论文

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P P a s e 对逆境的反应9 1 2 1 盐胁迫9 1 2 2 冷胁迫l O 1 2 3 缺氧胁迫1 0 13 液泡膜旷P P a s e 与生长素极性运输1 1 1 4 液泡膜旷P P a s e 基因的克隆1 2 2 材料与方法1 3 2 1 试验材料。1 3 2 1 1 植物材料及处理1 3 2 1 2 菌株与质粒1 3 2 1 3 酶及生化试剂13 2 1 4P C R 引物13 2 2 试验方法_ 1 4 2 2 1 植物材料总R N A 的提取1 4 2 2 2R N A 电泳检测16 2 2 3 反转录c D N A 第一条链的合成1 6 2 2 4e D N A 纯化( 用于5 R A C E ) 1 6 2 2 5e D N A 末端加尾( 用于5 哩t A C E ) 1 7 2 2 6 黄瓜i - i + - P P a s e 基因的e D N A 全长序列的获得1 8 2 2 6 1 中间片段一的克隆1 8 2 2 6 2 基因中间片段二的克隆1 9 2 2 6 33 R A C E 获得3 端序列1 9 2 2 6 45 R A C E 获得5 端序列1 9 2 2 6 5 基因全长的获得2 0 2 2 6 6 琼脂糖凝胶中D N A 片段的回收2 0 2 2 7D N A 片段与克隆载体的连接2 l 2 2 8 大肠杆菌感受态细胞的制备2 l 2 2 9 大肠杆菌的转化及筛选2 2 2 2 1 0 碱法质粒D N A 的提取2 2 2 2 1 1 质粒D N A 的酶切鉴定：2 3 2 2 1 2D N A 序列测定2 3 2 2 1 3 黄瓜W - P P a s e 基因反义表达载体的构建2 3 2 2 1 4 黄瓜矿P P a s e 基因正义表达载体的构建2 4 2 2 1 5 农杆菌感受态细胞的制备与转化2 4 2 2 1 5 1 农杆菌感受态细胞制备2 4 2 2 15 2 冻融法转化农杆菌2 4 2 2 1 6 黄瓜H + - P P a s e 序列的生物信息学分析2 5 3 结果与分析2 5 3 1 黄瓜i - I + P P a s e 基因的分离2 5 3 1 1R N A 的提取及反转录2 5 3 1 2 中间片段一和片段二的分离2 6 3 1 33 片段的分离。2 7 3 1 457 片段的分离2 8 3 1 5 全长c D N A 的分离2 8 3 2 黄瓜I - I * P P a s e 基因的序列分析2 9 3 2 1 黄瓜H + P P a s e 基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列2 9 3 2 2 黄瓜矿P P a s e 基因氨基酸序列分析2 9 3 2 3 液泡膜焦磷酸酶系统进化树分析3 4 3 2 4 跨膜结构分析3 5 3 2 5 顺式作用元件分析3 5 3 3 黄瓜液泡膜矿P P a s e 基因的组织表达分析3 5 3 3 1 在不同器官中表达3 5 3 3 2N a C l 处理对黄瓜叶片C u P P a s e 表达的影响。3 6 3 3 2 高低温处理对黄瓜叶片C u P P a s e 表达的影响3 6 3 4 黄瓜I - i + P P a s e 基因正反义表达载体的构建3 7 3 4 1 黄瓜旷P P a s e 基因反义表达载体的构建3 7 3 4 2 黄瓜矿P P a s e 基因正义表达载体的构建。3 7 4 讨论4 1 4 1 基因全长的获得。4 1 4 2 顺式作用元件分析4 1 4 3 不同胁迫处理下黄瓜矿P P a s e 基因的表达4 1 5 结论4 2 参考文献4 3 致谢5 3 攻读硕士期间发表的论文情况5 4 I I I 山东农业大学硕士学位论文 中文摘要 液泡膜矿P P a s e 是植物中普遍存在的一种质子泵，在盐胁迫、干旱 胁迫以及低温胁迫下，它对维持植物细胞的离子平衡具有重要的作用；另 外还可以作为调节因子控制植物生长素等物质的运输，在调节植物生长发 育中具有一定的作用。黄瓜是我国最重要的蔬菜作物之一，在生产过程中 经常遇到盐害、低温、干旱等逆境胁迫，而液泡膜H + - P P a s e 与植物对多 种逆境的抗性具有密切的关系。随着黄瓜栽培面积尤其是设施栽培面积的 不断扩大，盐害、低温胁迫等成为限制黄瓜生产的重要障碍因子。从不同 的角度研究与黄瓜逆境有关的科学问题具有重要的意义。本试验以新泰 密刺黄瓜为试材，用R T - P C R 结合R A C E 法从黄瓜幼叶中克隆了液泡膜 旷P P a s e 基因的全长序列，构建了正反义表达载体，并利用R T P C R 的方 法对非生物胁迫下黄瓜液泡膜旷P P a s e 基因的表达进行了研究。主要结 果如下： 1 利用同源序列设计兼并引物，通过R T - P C R 的方法，在黄瓜叶片中分离 到黄瓜液泡膜旷P P a s e 基因的中间片段，再结合R A C E 技术获得了黄瓜 液泡膜旷P P a s e 基因，命名为C u P P a s e 。G e n e B a n k 注册号为G Q 2 2 3 7 8 6 。 2 序列分析表明，C u P P a s ee D N A 全长2 , 6 5 0b p ，编码区2 3 0 7b p ，编码 7 6 8 个氨基酸，预测蛋白质分子量约为8 0K D ，理论p I 值为5 3 2 。该基因 有1 4 个强的跨膜螺旋结构，P l a n t C a r e 分析结果显示该基因序列具有脱落 酸诱导、生长素诱导、赤霉素诱导、水杨酸诱导、低温、干旱等诱导的顺 式作用元件。 3 C u P P a s e 在叶和根中表达较高，茎中表达较低。C u P P a s e 表达受盐胁迫 以及高低温胁迫诱导，并且与处理时间有密切关系，在三种胁迫条件下， 其表达均表现先升高后降低的趋势。 4 为研究黄瓜H + P P a s e 基因的功能，构建其正义表达载体p B l l 2 1 C u P P a s e 和反义表达载体p B l l 2 1 C u P P a s e l 。 关键词：黄瓜；I r P P a s e 基因；表达；正义表达载体；反义表达载体 黄瓜液泡膜旷P P a s e 基因的c D N A 克隆与表达分析 A B S T R A C T T o n o p l a s t 口- P P a s ei sac o m m o np r o t o np u m pi np l a n t s ，a n di tp l a y sa v i t a lr o l ei n m a i n t a i n i n gi o n i ce q u i l i b r i u mi nc e l l s ；i ta l s oc o n t r o l l st h e t r a n p o r t a t i o no fp h y t o h o r m o n ea sar e g u l a t o r yf a c t o ra n dS Of o n hp l a y sar o l e i nr e g u l a t i n gt h eg r o w t ha n dd e v e l o p m e n to fp l a n t s C u c u m b e ri so n eo ft h e m a i nv e g e t a b l e si nC h i n a I nt h ec u l t i v a t i o no fi t ，s a l t ，f r e e z i n g ，d r o u g h ta n d o t h e rs t r e s s e sa r eo f t e ne n c o u n t e r e d R e s i s t a n c eo f p l a n t st os e v e r a ls t r e s s e si s c l o s e l y r e l a t e dw i t ht o n o p l a s t 旷P P a s e R e c e n t l y , w i t ht h e i n c r e a s i n g c u l t i v a t i o na r e ao fc u c u m b e r , s a l ta n dt e m p e r a t u r es t r e s s e sh a v eb e c o m ea l i m i t e df a c t o rf o rc u c u m b e rp r o d u c t i o n , t h e r e f o r e ，i t sm e a n i n g f u lt oi n c r e a s e c u c u m b e rt o l e r a n c et os t r e s st h r o u g hs o m em e t h o di n c l u d i n gg e n eu t i l i z a t i o n I nt h i ss t u d y , t h ef u l l l e n g t he D N Ao ft o n o p l a s t 旷P P a s eW a sa m p l i f i e db y R T - P C Ra n dR A C Em e t h o d sf r o my o u n gl e a v e so fc u c u m b e r ( C u c u m i s s a t i v u s L ) F u r t h e r m o r e ，w ec o n s t r u c t e d t h es e n s ea n dt h ea n t i s e n s e e x p r e s s i o n v e c t o r s T o m a t o t r a n s g e n e w a ss t u d i e d u s i n g A g r o b a c t e r i u m m e d i a t e dp l a n t t r a n s f o r m a t i o n T h e g e n ce x p r e s s i o n o f t o n o p l a s t 旷一P P a s eu n d e rs e v e r a ls t r e s s e sW a sa l s os t u d i e dU S 吨R T - P C R m e t h o d s n l em a i nr e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： 1 H o m o l o g o u ss e q u e n c ed e s i g nw e r ea p p l i e dt oa n n e xp r i m e r W i t hR T - P C R a n dR A C Em e t h o d s ，ae D N Ao ft o n o p l a s t 矿- P P a s e ，n a m e dC u P P a s e ，W a s a m p l i f i e df r o mc u c u m b e r ( C u c u m i ss a t i v u sL ) I t sa c c e s s i o nn u m b e ri n G c n B a n kW a sG Q 2 2 3 7 8 6 2 S e q u e n c i n ga n a l y s i ss h o w e dt h a tt h e f u l lc D N Al e n g t ho fC u P P a s e c o n s i s t e do f2 , 6 5 0b pw h i c hc o n t a i n sa l lo p e nr e a d i n gf r a m eo f2 ，3 0 7 n u c l e o t i d e sc o d i n gf o ra7 6 8 一a m i n oa c i dp r o t e i no f8 0k D T h ep r e d i c t e d P 1w a s5 3 2 1 4t r a n s m e m b r a n eh e l i c e sw e r ef o u n di nt h eg e n ea n dt h e r e s u l to fP l a n t C a r ea n a l y s i ss h o w e dt h a ti th a dt h ep r o p e r t yi n d u c e db y a b s c i s i ca c i d ，a u x i n ，g i b b e r e l l i n ，s a l i c y l i ca c i d ，f r e e z i n g ，d r o u g h ta n do t h e r f a c t o r s 2 山东农业大学硕士学位论文 3 R T - P C Rs h o w e dt h a tC u P P a s eh a dh i 。g he x p r e s s i o ni nl e a fa n dr o o tw h i l e h a dl o we x p r e s s i o ni ns t e m E x p r e s s i o no fC u P P a s ew a si n d u c e db ys a l t , h i g ha n dl o wt e m p e r a t u r es t r e s s e s ，a n dt h ei n d u c t i o nl e v e lw a sr e l a t e d 研也 t r e a t m e n tt i m e 4 I no r d e rt od e t e r m i n et h ef u n c t i o no ft o n o p l a s t 矿- P P a s ei nc u c u m b e r , a s e n s ea n da na n t i s e s ev e c t o rw e r ec o n s t r u c t e df o rp l a n tt r a n s f o r m a t i o n K e y w o r d s ：C u c u m i ss a t i v u sL ；l r P P a s eg e n e ；e x p r e s s i o n ；s e n s e e x p r e s s i o nv e c t o r ；a n t i s e n s ee x p r e s s i o nv e c t o r 黄瓜液泡膜I r - P P a s e 基因的c D N A 克隆与表达分析 引言 黄瓜( C u c u m i ss a t i v u sL ) 别名胡瓜、王瓜，是葫芦科( C u c u b i t a c e a e ) 甜瓜属一年生攀援草本植物，是一种世界性的重要蔬菜。在我国已有两千 多年的栽培历史( 吴永仁，1 9 9 4 ) ，是我国主栽蔬菜之一，尤其是在保护 地栽培中( 曲波等，2 0 0 3 ；魏德军等，2 0 0 2 ) 。黄瓜在生产过程中经常遇 到各种非生物胁迫( 汪天等，2 0 0 5 ；魏国强等，2 0 0 4 ；杨风娟等，2 0 0 6 ； S k i 等，2 0 0 6 ) ，随着黄瓜栽培面积尤其是设施栽培面积的不断扩大，盐 害和温度胁迫已成为限制黄瓜生产的重要障碍因子( 段九菊等，2 0 0 6 ；王 永键等，2 0 0 1 ) 。 液泡膜焦磷酸酶是逆境协迫相关酶之一，它能够以焦磷酸( P P i ) 作为能 量来源，将旷泵到液泡中，从而形成跨液泡膜矿电化学势梯度，有利于 一些无机离子、有机酸、糖类以及其他的一些化合物进入液泡内，从而提 高整个细胞的渗透势。该酶广泛地存在于自然界中，参与合成糖类、核酸 和蛋白质等多种代谢途径中所形成的焦磷酸的水解。植物组织中的P P i 主 要是在R N A 、蛋白质、糖类等物质的生物合成过程中产生的，P P i 积累到 一定程度，若不及时清除必然会抑制生物合成的正常进行，影响植物的正 常生长发育。植物细胞质内的P P a s e 可以分解P P i ：植物液泡膜上的P P a s e 和A T P a s e 共同作用，构成了植物液泡完整的质子泵跨膜x 山- r 体系，在 植物生理活动过程中起着重要作用( 包爱科等，2 0 0 6 ) 。P P a s e 除了具有水 解P P i 的功能外，还参与生物能的保存、细胞质p H 的调节、P i 、P P i 的 转换等过程。此外，还可能参与泵运矿质离子进入液泡，从而调节膨压( 李 小园，2 0 0 4 ) 1 1 液泡膜质子泵的结构及功能 1 1 1 液泡膜质子泵的结构及活性调节 植物液泡膜上普遍含有两种质子泵：I - g A T P a s e 和旷P P a s e ( H e d r i c h 等，1 9 8 9 ) ，它们分别以A T P 和无机焦磷酸为底物，以水解产生的能量将 质子泵入液泡，维持胞质p H 值平衡，同时为植物的各种代谢产物提供次 级驱动力( 胡有贞等，2 0 0 9 ) 。 1 1 1 1 液泡膜矿A T P a s e 4 山东农业大学硕士学位论文 液泡膜旷A T P a s e 是一个多亚基蛋白质复合体，分子量约为6 5 0 - - 7 0 0 k D a ，是普遍存在于各种植物液泡膜和内膜系统其他组分上的一种重要的 膜结合初级质子转运体，在液泡膜上高度富集，约占液泡膜蛋白的 6 5 3 5 。研究表明，各种矿A T P a s e 均含有三种主要的亚基，分别为负责 催化A T P 水解的A 亚基，调节活性的B 亚基和执行质子通道功能的C 亚基， 而且多数情况下这三种亚基是由多基因编码的( D i e t z 等，2 0 0 1 ) ，而其 他各种亚基的种类和数目则随实验材料的不同而表现出种属、器官和发育 阶段的特异性( F i s c h e r - S c h l i e b s 等，1 9 9 7 ) 。液泡膜旷A T P a s e 全酶结构 分为两部分：其中的V H A A 亚基到V H A H 亚基组成矿A T P a s e 的亲水 区1 ) ，露于胞质一侧；V H A a 、V H A - e 、V H A d 和V H A e 等亚基则组 成与液泡膜整合的疏水区0 ) 。 近期研究发现液泡膜矿- A T P a s e 的某些亚基由多个等位基因编码，可 能与这些亚基对不同环境的适应特异性有关( K l u g e 等，2 0 0 3 ) 。液泡膜 矿A T P a s e 的结构复杂，调控方式也很多样：转录调控是对其进行活性调 节的主要机带l J ( K l u g e 等，2 0 0 3 ) ；而液泡膜旷A T P a s eB 亚基和C 亚基 的磷酸化也被认为是提高酶活的原因之一( H o n g H e r m e n s d o r f 等，2 0 0 6 ) ； 另外，细胞的氧化还原水平、胞质p H 值是影响酶促动力的直接因素 ( T a v a k o l i 等，2 0 0 1 ) 。 在同一植物的不同组织或同一细胞的不同发育阶段，其液泡p H 的变 化以及植物对环境条件变化的响应均表明矿A T P a s e 会受到相应的调节 ( R o b e r t o 等，2 0 0 2 ) 。盐胁迫诱导盐地碱蓬( S u a e d as a l s a ) ( W a n g 等，2 0 0 2 ) 、 滨藜( A t r i p l e xh a l i m u sL ) ( N i u 等，1 9 9 6 ) 、冰叶日中花( M e s e m b r y a n t h e m u m c r y s t a l l i n u mL ) ( B a r k l a 等，1 9 9 5 ) 、小麦抗盐突变体( T e t s u r o 等，2 0 0 3 ) 旷A T P a s e 活性增加，从而为N 删逆向转运提供驱动力。此外，随植物 的生长条件和发育阶段的变化，其W - A T P a s e 的结构也会发生相应的变 化，从而调节细胞的生理行为，做出对环境变化的应答( R e a 等，1 9 8 6 ) 。 目前许多研究表明，在冷害和盐胁迫条件下，I - V A T P a s e 通过改变其自身 结构状态以适应环境的变化，从而使植株在逆境条件下得以存活。 旷A T P a s e 对冷害的敏感性还依赖于植株的发育阶段，幼嫩植株较成年植 株更为敏感。另外，旷A T P a s e 活性的大小还受到亚基之间相互作用的 黄瓜液泡膜I - V - P P a s e 基因的c D N A 克隆与表达分析 调节( N e l s o n 等，1 9 8 9 ) 。 A T P a s e 的最适p H 约为7 2 ，酶活性受阴离子促进，顺序为 C I B r I H C 0 3 S 0 4 弘( K l u g e 等，2 0 0 3 ) 。其抑制剂有C o n c a n a m y c i nA ( 刀球肮霉素A ) 、B a f i l o m y c i nA ( 巴弗洛霉素A ) 、N 0 3 等。其中 C o n c a n a m y c i nA ( C C A ) 是一种比B a f i l o m y c i nA 更有效的V - I - I + - A T P a s e 活性 专一性抑制剂，可结合到C 亚基上( H u s s 等，2 0 0 2 ) ，N e u r o s p o r ae r a s s a 细胞的生长可被C o n c a n a m y c i n A 抑制( B o w m a n 等，1 9 9 7 ) 。 1 1 1 2 液泡膜I - Y P P a s e 液泡膜旷P P a s e 是同型二聚体质子转移酶，它的开放阅读框( O R F ) 由22 8 3 - 2 31 9 个核苷酸组成，编码大约7 6 1 7 7 3 个氨基酸残基( M a e s h i m a ， 2 0 01 ；N a k a n i s h i a n dM a e s h i m a , 19 9 8 ) 。不同物种的液泡膜旷P P a s e 可能 含有多个同型基因0 3 r i n i 等，2 0 0 5 ；K i m 等，1 9 9 4 ) ，它们有1 红1 7 个a 螺 旋跨膜区，是高度疏水性蛋白，其氨基酸同源性高于8 5 ，高度保守区有 3 个( C S1 ，C S 2 和C S 3 ) ，均定位于胞质一侧( M i m u r a 等，2 0 0 4 ) ，底物结 合位点可能是突出于细胞质中的e 环( M a e s h i m a ，2 0 0 0 ) ( 图1 ) 。有研究表 明，拟南芥液泡膜焦磷酸酶和叶绿体膜旷A T P a s e ( F O F l - A T P a s e ) 的C 亚 基氨基酸序列具有很高相似性，P P a s e 第2 2 7 - 2 4 5 位的氨基酸序列与C 亚基的a 螺旋都含有与二环己基碳二亚胺( D C C I ) 结合的谷氨酸残基 ( N y r 6 n 等，1 9 9 3 ) 。 植物液泡膜旷P P a s e 的活性受环境胁迫的调节。在盐分胁迫下大麦 细胞的I - V P P a s e 活性提高( V a s e k i n a 等，2 0 0 5 ) 。R e a 等认为I - V P P a s e 对 植物细胞抵抗缺氧胁迫和冷胁迫有重要作用( R e a 等，1 9 8 6 ) 。在低温( 4 ) 胁迫下，绿豆下胚轴I - I * - P P a s e 的活性增加了1 5 2 倍。C a r y s t i n o s ( C a r y s t i n o s d e n g ，1 9 9 5 ) 等发现缺氧和冷( 1 0 ) 胁迫造成耐缺氧水稻 幼苗的矿P P a s e 基因转录水平显著增加，酶活性提高了7 5 倍，而恢复通 气后，旷P P a s e 含量降低到正常水平，因此他们认为在能量胁迫下， I - V P P a s e 可能替代旷A T P a s e 而在液泡酸度的维持方面起主要作用。 植物液泡膜旷P P a s e 活性也明显受到盐胁迫的调节，在1 0 0 和4 0 0 m m o l L d N a C l 胁迫下，盐地碱蓬叶片中矿P P a s e 活性较对照增加( W a n g 等，2 0 0 0 ) 。N a C l 处理引起盐适应的A c e r p s e u d o p l a t a n u s 细胞( F r a i c h a r d 6 山东农业大学硕士学位论文 等，1 9 9 6 ) 旷一P P a s e 活性增加。C a r y s t i n o s 等( 1 9 9 5 ) 发现水稻幼苗在缺 氧或冷胁迫下旷P P a s e 的基因转录和活性均明显增加。C o l o m b o 等( 1 9 9 3 ) 等也发现N a C I 胁迫增加了胡萝卜悬浮细胞的矿P P a s e 活性。当然，也有 研究表明高N a + X 寸i - i + P P a s e 有抑制作用，因N a + 与K + 竞争该酶的结合位 点( B l u m w f l d 等，2 0 0 0 ) 。 熊磷酸络台能鑫 P P ib i n d i n gr i t e 2 5 3 2 6 3 C SI 绷缀矮 C y t o p L a s m V a c u o l e 圈l 缀该缀熬液迤璇糕- 争鹣瀚撬羚缤构援登 M a e 蛾 2 0 0 0 ) F i g u r elT o p o l o g i 翻m o d e lo fW - P P a s e 躺糖m u r , gb e a n ( M a c - 妇趣瓯掬 1 1 1 3 液泡膜H + - A T P a s e 和旷P P a s e 的关系 研究表明，旷A T P a s e 的水平在植物发育过程中保持相对稳定，而 I - i + P P a s e 的水平则随植物的发育逐渐下降，因此认为旷P P a s e 是幼嫩组 织主要的液泡膜质子泵，而旷A T P a s e 是成熟组织中液泡膜上主要的质子 泵( M a e s h i m a 等，2 0 0 0 ) 。一般认为H + - A T P a s e 在跨液泡膜矿梯度的维 持方面起着主导作用，而H + P P a s e 作为泵矿的附属系统。大多数植物的 成熟组织中W P P a s e 含量较低( M a e s h i m a 等，2 0 0 0 ) ，因而这种能量贮 存在最适环境条件下可能显得微不足道。而在能量胁迫( e n e r g ys t r e s s ) 7 黄瓜液泡膜W - P P a s e 基因的c D N A 克隆与表达分析 如冷、缺氧条件下，细胞内矿P P a s e 过量表达( C a r y s t i n o s 等，1 9 9 5 ) ， 从而导致在细胞内A T P 含量急剧下降的同时，P P i 含量却在呼吸状态显著 变化过程中保持相对稳定，说明矿P P a s e 可能在逆境条件下，如在A T P 供应不足时植物的存活策略方面发挥主要作用( R e a 等，1 9 9 3 ) 。此外， 矿- P P a s e 与矿一A T P a s e 间也存在相互作用。F i s c h e r - S c h l i e b s 等 ( F i s c h e r - S c h l i e b s 等，2 0 0 2 ) 在K a l a n c h o eb l o s s f e l d i a n a 的液泡膜微囊发 现了旷- P P a s e 激活的A T P 依赖的矿转运活性，他们认为矿P P a s e 通过 与I - I + - A T P a s e A 亚基之间相互作用而对H + - A T P a s e 活性进行调节。 总之，两种质子泵在液泡膜上同时存在，密切联系，相互作用 ( F i s c h e r - S c h l i e b s 等，1 9 9 7 ；G a o 等，2 0 0 3 ) ，共同参与液泡膜上的能 量转换( M a e s h i m a ，2 0 0 0 ) ，只是在植物的不同组织、不同的发育和或分 化阶段，二者的生理地位不同而已( F i s c h e r - S c h l i e b s 等，2 0 0 2 ) 。 1 1 2 液泡膜质子泵的功能 1 1 2 1 维持稳定的胞质和液泡液p H 值 液泡膜质子泵水解底物产生的能量将胞质中的矿泵入液泡，使液泡膜 内外的酸度保持稳定：胞质p H 值维持在7 5 左右，为多种酶类提供适宜的 催化环境，同时确保蛋白在分泌途径中的翻译后修饰和折叠；而液泡液p H 值约4 O ，能够刺激膜的流动，促进膜上的物质交换及囊泡运输 ( P a d m a n a b a n 等，2 0 0 4 ) 。 1 1 2 2 参与控制液泡膨压，维持细胞的体积 细胞形态的维持不仅需要细胞壁的限制，也依赖液泡膨压的调节。并 且成熟的液泡对于胞质中各种细胞器特别是叶绿体的分布极其重要 ( M a r t i n o i a 等，2 0 0 7 ) 。为了保持中央液泡的体积，液泡液浓度一般是胞质 的6 倍，而液泡中大量溶质的积累正是由定位于液泡膜上的两种质子泵 旷一A T P a s e 和旷一P P a s e 提供主动运输的能量。 1 1 2 3 促进多种离子和代谢产物的在液泡中的积累 大多数次级代谢物对植物体是有毒的，需要一系列有效机制解毒或将 其区隔化，液泡是最常见的储存位点，由液泡膜质子泵产生的质子梯度使 多种液泡膜运输载体能逆浓度将这些有毒物质区隔，从而控制胞质中的离 子浓度和代谢物量向着有利于正常代谢的方向进行( R o y t r a k u la n d 山东农业大学硕士学位论文 V e r p o o r t e ，2 0 0 7 ) 1 1 2 4 与植物激素相互作用，影响植物的生长发育 近期大量研究发现细胞液泡质子泵与植物激素有着密不可分的联系， 脱落酸( A B A ) 、生长素( I A A ) 等植物激素对液泡膜H + - A T P a s e 和旷P P a s e 的转录和表达有明显调节作用( J a n i c k a - R u s s a k 等，2 0 0 7 ) ；同时液泡膜质 子泵蛋白的异常表达也能通过改变植物激素的分泌和运输影响植物的生 长发育( “等，2 0 0 5 ) ，如拟南芥液泡膜H + - A T P a s eC 亚基基因突变株( d e t ) 的下胚轴明显短于野生型( S c h u m a c h e r 等，1 9 9 9 ) ，梨树细胞液泡膜K + 依 赖型1 4 + P P a s e 的蛋白水平和酶活能增强幼嫩植物的细胞分化( S h i r a t a k e 等，1 9 9 7 ) 。液泡膜质子泵对植物株型的影响一方面可能由于液泡占据8 0 的细胞体积，植物细胞的生长离不开液泡的膨大，而液泡膜质子泵在此过 程中具有重要作用；另一方面可能因为液泡膜质子泵维持的胞内外稳定的 p H 值对植物激素的分泌运输是必须I 拘( L i 等，2 0 0 5 ) 。 1 2 液泡膜I r P P a s e 对逆境的反应 1 2 1 盐胁迫 液泡膜I - I + - P P a s e 是存在于多数陆生植物细胞中的一种质子泵，通过 催化分解焦磷酸( P P i ) ，一方面减少了P P i 浓度过高对植物胞质大分子合成 的影响，另一方面利用P P i 中的高能磷酸键，催化矿由细胞质向液泡的 运输，与旷A T P a s e 一起建立了跨液泡膜的p H 梯度( A p h 3 和电化学势梯 度( 1 l r ) ，为A p H 和1 l r 耦连的广泛的次级运输提供了动力并保存了P P i 中的自由能。这种能量贮存在最适环境条件下可能微不足道，但在胁迫环 境下却非常的重要。H + - P P a s e 是一种结构简单的质子泵，其一级结构具有 1 4 个跨膜区，分子量约7 1 8 0k D a 的多肽。其多肽序列非常保守，如在 甜菜中发现2 个同分异构体，烟草中4 个同分异构体，水稻中2 个同分异 构体，与绿豆，拟南芥、大麦I - V P P a s e 序列同源性高达8 6 9 1 ( 耿华 珠等，1 9 9 5 ) 。不同陆生植物之间序列一致性高达8 6 - 9 1 。 盐胁迫对液泡膜W P P a s e 基因的表达和酶活都有影响( 胡有贞等， 2 0 0 9 ) 。L i 等( 2 0 1 0 ) 在匍匐剪股颖( 又名四季青) 中过量表达匍匐剪股颖 矿P P a s e 基因，在l O O m m o l L 1 N a C l 处理下，与野生型相比，转基因植株 长势好于野生型。G a x i o l a 等( 2 0 0 1 ) 在拟南芥中过量表达拟南芥旷P P a s e 9 黄瓜液泡膜- P P a s e 基因的c D N A 克隆与表达分析 基因A V P l ，结果得到耐盐的转基因植株在叶片组织积聚了更多的N a + 和 K + ，而且转基因植株液泡的阳离子摄取量明显增加。A V P I 在番茄 ( L y c o p e r s i c o ne s c u l e n t u m ) 中过表达也得到了液泡的阳离子摄取量明显增 加的结果( M a e s h i m a 等，1 9 8 9 ) 。这些现象表明，A V P l 过量表达增大了液 泡内外质子的梯度，从而促进细胞质中可溶性物质的积累而达到耐盐效 果。G u o 等( 1 9 8 4 ) 等克隆了碱蓬( S u a e d as a l s a ) 的矿P P a s e 基I 园S s V P l ，其 读码框长度2 2 9 2b p ，编码7 6 4 个氨基酸，碱蓬中S s V P l 的表达受到盐处理 的诱导。对盐耐受性马铃薯细胞液泡膜I T P P a s e 对盐分也相当敏感，盐 胁迫既能改变其转录水平、也能改变其蛋白含量( F u l o a d a 等，2 0 0 4 ；G a o 等，2 0 0 6 ；P a r k s 等，2 0 0 2 ；V e r a - E s t r e l l ae 等，2 0 0 5 ：W a n g 等，2 0 0 1 ) 。 当大麦受到盐胁迫时，其液泡膜的W - P P a s e 基因在根中的表达量短期上 调( F u k u d a 等，2 0 0 4 ) 1 2 2 冷胁迫 低温对I T P P a s e 的影响目前没有一致的认识( Y a n g 等，2 0 0 4 ) 。 Y o s h i d a 等( 1 9 9 1 ) 和M a t s u u r a - E n d o 等( 1 9 9 2 ) 报道，绿豆苗旷P P a s e 在 低于1 0 下，旷P P a s e 质子转运速率下降。但在检测2 C 处理的绿豆悬浮 细胞的I - I * P P a s e 活性后认为，冷处理期间H + P P a s e 较为稳定，4 8 h 内没 有表现出明显的受抑制现象，甚至在处理的最初1 2 h 内还稍有促进作用 ( Y o s h i d a ，1 9 9 1 ) 。C a r y s t i n o s 等( 1 9 9 5 ) 则发现冷诱导矿P P a s e 活性大 幅度上升，1 0 下冷处理6 d 的水稻苗的旷P P a s e 比活是常温( 2 5 ) 下 的2 0 倍，同时免疫反应蛋白也显著增加，这说明旷P P a s e 可被低温诱导。 由于细胞