毕业设计（论文）-四环素对蓝藻的急性毒性研究.doc

上海应用技术学院毕业论文题 目： 四环素对蓝藻的急性毒性研究 专 业： 环境工程 班 级： 09107411 学生姓名： 学生学号： 0810741116 指导老师： 化学与环境工程学院2013年5月30日上海应用技术学院毕业设计（论文）任务书题目：四环素对蓝藻的急性毒性研究学生姓名：倪吉 学号：0810741116 专业：环境工程任务起止日期：2012年12月25日至2013年5月30日 共16周一、 课题的任务内容：1、了解并掌握抗生素四环素的化学性质及生物有效性。2、了解藻类的一般实验室培养方法。3、 掌握急性毒性实验方法。4、化合物的染毒及抗生素残留分析。二、原始条件及数据：1、铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）FACHB 905购于中国科学院武汉水生所（武汉，中国）。藻细胞用BG11（pH=9.0）培养基培养。置于RXZ智能人工气候箱，温度281C，光强40mol/m2S，湿度60%，白天/黑夜=12h/12h。2、急性毒性实验参照OECD标准实验方法进行。3、化合物染毒基本条件具备。4、急性毒性实验及蛋白含量检测条件具备。5、抗生素液相检测方法基本建立。三、设计的技术要求（论文的研究要求）1、掌握蓝藻培养方法；2、掌握藻类急性毒性实验方法；3、掌握蛋白含量测定方法；4、掌握液相检测抗生素的方法。5、掌握数据分析基本方法。四、毕业设计（论文）应完成的具体工作1、实验室稳定培养蓝藻细胞；2、蓝藻细胞生长曲线绘制及EC50计算；3、蛋白含量检测；4、抗生素在藻液体系中的含量变化检测。5、数据分析，论文撰写。五、查阅文献要求及主要的参考文献1. Chorus, I.; Bartram, J., Toxic Cyanobacteria in Water: a guide to their public health consequences, monitoring and management. E & FN SPON Routledge: New York, 1999.2. Galey, F. D.; Beasley, V. R.; Carmichael, W. W.; Kleppe, G.; Hooser, S. B.; Haschek, W. M., Blue-green algae (Microcystis aeruginosa) hepatotoxicosis in dairy cows. Am J Vet Res 1987, 48 (9), 1415-20.3. Carmichael, W. W., Cyanobacteria secondary metabolites-The cyantoxins. J. Appl. Bacteriol. 1992, 72 (6), 445-459.4. WHO, Guidelines for drinking-water quality, 2nd ed.; addendum to Vol. 2, Health criteria and other supporting information. Geneva, Switzerland, 1998.5. Mackintosh, C.; Klumpp, S., Tautomycin from the bacterium Streptomuces-verticillatus- another potent and specific inhibitor of protein phosphatase-1 and phosphatese-2A. FEBS Lett. 1990, 277 (1-2), 137-140.6. Matsushima, R.; Yoshizawa, S.; Watanabe, M. F.; Harada, K.; Furusawa, M.; Carmichael, W. W.; Fujiki, H., Inbitro and invivo effects of protein phosphatase inhibitors, microcystins and nodularin, on mouse skin and fibroblasts. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1990, 171 (2),867-874.7. Honkanan, R. E.; Codispoti, B. A.; Tse, K.; Boynton, A. L., Characterization of natural toxins with inhibitory activity against serine thereonine protein phosphatases. Toxicon 1994, 32 (3), 339-350.8. Bogtalli, S.; Bruno, M.; Curini, R.; Corcia, A. D.; Fanali, C.; Lagana, A., Mornitoring algal toxins in lake water by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Environ. Sci.Technol. 2006, 40, 2917-2923.9. Harada, K.-I.; Matsuura, K.; Suzuki, M.; Oka, H.; Watanabe, M. F.; Oishi, S.; Dahlem, A. M.; Beasley, V. R.; Carmichael, W. W., Analysis and purification of toxic peptides from cyanobacteria by reversed-phase high-performance liquid chromatography. Journal of Chromatography A 1988, 448, 275-283.10. Meriluoto, J.; Kincaid, B.; Smyth, M. R.; Wasberg, M., Electrochemical detection of microcystins, cyanobacterial peptide hepatotoxins, following high-performance liquid.六、进度安排：（设计或论文各阶段的要求，时间安排）14周：文献综述撰写，英文翻译。514周：实验室实验。1516周：整理数据，论文撰写。指导老师： 叶璟审核意见：教研室主任： 曹萍 四环素对蓝藻的急性毒性研究摘要：四环素类抗生素是目前使用最广泛、用量最大的抗生素种类之一, 其在环境中的大量残留带来了潜在的环境风险。本文介绍了四环素类抗生素的污染现状以及生态毒性。并以水华蓝藻铜绿微囊藻为研究对象，通过四环素对铜绿微囊藻的生长抑制、四环素对藻液pH值的影响、四环素对蛋白质含量的影响，研究四环素对蓝藻的急性毒性。结果表明：1 mg/L的四环素能够刺激铜绿微囊藻细胞的生长，而铜绿微囊藻在长时间暴露于高浓度四环素时其生长明显受到抑制。本文同时通过高效液相色谱法检测了四环素在铜绿微囊藻液中的降解情况，结果表明：该反应属于一级动力学反应，Ln（四环素浓度）与反应时间呈线性关系。为今后的研究方向进行了探计，旨在为其生态风险评价提供有价值的参考。关键词： 四环素、铜绿微囊藻、急性毒性、抑制、降解Acute toxicity of tetracycline on Microcystis aeruginosaAbstract: Tetracycline antibiotics are widely used in the world. This is one of the largest types of antibiotics, which can remain in the environment and bring potential environmental risks. In this study, the eco-toxicity of tetracyclines on cyanobacteria Microcystis aeruginosa was studied. Growth inhibition of this kind of algae exposure to tetracycline was measured. pH values, protein content, were also studied to determine the acute toxicity of tetracycline on M. aeruginosa. The results showed that at low concentration 1 mg/L tetracycline can stimulate the growth of M. aeruginosa, and in prolonged exposure to high concentrations of tetracycline, M. aeruginosa growth was suppressed. This paper also detected the degradation of tetracycline in M. aeruginosa culture medium by high performance liquid chromatography (HPLC). The results showed that the reaction is a first-order kinetics reaction, Ln (tetracycline concentration) and the reaction time showed linear relationship. And discussed the future research directions, aimed to provide valuable reference for the ecological risk assessment of the antibiotics.KeyWords: Tetracycline; Microcystis aeruginosa; Acute toxicity; Inhibit; Degradation目录1. 引言（绪论）11.1 抗生素的污染现状11.2 四环素类抗生素的污染现状21.3 四环素类抗生素的生态毒性31.3.1 四环素类抗生素对微生物的生态毒性31.3.2 四环素类抗生素对植物的生态毒性41.3.3 四环素类抗生素对动物的生态毒性41.4 四环素的理化性质和药理毒理51.4.1 四环素的理化性质51.4.2 四环素的药理毒理51.5 蓝藻、铜绿微囊藻61.5.1 蓝藻概述61.5.2 铜绿微囊藻概述61.5.3 藻类水华61.6 微囊藻毒素的污染现状71.6.1 微囊藻毒素的污染现状71.6.2 天然及水库水体的微囊藻毒素污染71.6.3 饮用水的微囊藻毒素污染81.7 课题研究的意义和目的81.8 课题研究的内容82. 实验条件及预实验92.1 实验条件92.1.1 实验仪器92.1.2 实验材料92.1.3 实验药品112.2 预实验112.2.1 BG11培养液的配置112.2.2 高压蒸气灭菌122.2.3 铜绿微囊藻的接种122.2.4 铜绿微囊藻的培养122.3 实验方案论证123. 实验方案与方法143.1 四环素储备液的配置143.2 铜绿微囊藻细胞数与吸光度的关系143.2.1 实验原理143.2.2 实验方法153.3 铜绿微囊藻生长曲线及抑制率153.4 铜绿微囊藻pH变化规律163.5 考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量163.5.1 实验原理163.5.2 试剂配制163.5.3 实验方法163.6 高效液相色谱检测四环素在铜绿微囊藻液中的降解173.6.1 实验原理173.6.2 实验特点173.6.3 实验方法184. 结果与讨论204.1 铜绿微囊藻细胞数与吸光度的关系204.2 生长曲线与抑制率204.3 铜绿微囊藻pH变化规律254.4 考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量264.5 高效液相色谱检测四环素在铜绿微囊藻液中的降解284.5.1 标准曲线284.5.2 降解曲线315. 结论37四环素对蓝藻的急性毒性研究441. 引言（绪论）1.1 抗生素的污染现状抗生素是一类生物（主要是真菌、放线菌或细菌等微生物）在其代谢过程中产生的具有杀灭或抑制他种生物（主要是微生物）作用的化学物质。除从微生物培养液提取外，有些抗生素已能通过人工合成或半合成得到。抗生素能在不同程度上起到抗菌、杀菌和抑菌作用，其作用机理主要包括：通过抑制细菌细胞壁的形成，使细菌因丧失细胞壁保护而死亡；影响胞浆膜通透性，使细菌屏障和运输物质功能受到障碍；影响蛋白质合成，使细菌生长受到抑制；影响核酸代谢，使细菌生长分裂受到抑制等等。一般来说，抗生素包括人用和兽用两类。目前大部分医院对药物的使用仍以抗生素的处方为主，这就造成了医疗系统强加给生病病人抗生素的滥用；另有一些家庭自医的人群，随意到药店擅自购买抗生素服用。抗生素在畜禽生产中的使用就更加令人担忧，常以高剂量使用治疗各种疾病，以低剂量使用促进畜禽生长和增产，因此其在畜禽生产中的使用量非常大。含有抗生素的畜禽粪便的土地利用是土壤中抗生素类污染物的主要来源。据报道, 在畜禽生产中使用的抗生素有 30%90%以母体化合物形式随畜禽粪便排出，某些抗生素能以母体化合物形式排出高达95%1、2。因此对该问题更应引起重视。北京大学临床药理研究所肖永红教授等专家调查推算，中国每年生产抗生素原料21万吨，有9.7万吨抗生素用于畜牧养殖业，占年总产量的46.1%。滥用抗生素使得抗生素以活性形式存在于污水中。超过90%的人类使用的抗生素以活性形式排出体外，这些抗生素接着出现在我们的饮用水中，不仅会进入人体干扰正常的菌群平衡，而且还可以通过杀灭周围环境中的有益菌来破坏生态平衡。同时，农业滥用抗生素正在导致超级病毒的传播，非传染性疾病和免疫性疾病大大增加了，人类的免疫系统正在衰退，而抗生素的滥用也是造成新型疾病增加的原因之一。多方面的资料表明，现有水处理技术对污水中含有的相当一部分抗生素没有明显的去除效果如抗癫痫药卡马西平的去除率仅为8%，而降血脂药氯贝酸的去除率几乎为0，全部随污水处理厂出水进入受纳水体。因此，对于含有抗生素的医院污水或城市生活污水，无论是否经过处理，只要实施排放，均可以导致对地表水、地下水以及农田土壤环境的污染。此外兽药抗生素在畜禽养殖业中以亚治疗剂量长期添加于动物饲料，起到刺激动物生长和促进增产的作用。目前在全球范围内几乎所有地区都采用抗生素来实现增加产量、提高经济效益的目的。然而，研究表明，抗生素药物只有15%可被吸收利用，大约85%未被代谢而被直接排放至环境中。例如，绵羊口服的土霉素中21%通过尿液排出体外，而对于幼牛1775%的氯四环素未经代谢就以母体化合物的形态被排出体外。到2010年，全国畜禽粪便的排放量将达45亿吨。如此大量的畜禽粪便排放，是构成我国抗生素面源污染的主要原因之一。抗生素在水产养殖中也被广泛使用，近年来公布的数据表明，水产养殖业使用的抗生素仅有2030%被鱼类吸收，7080%进入水环境中。因此，水产养殖业中抗生素的大量使用，是抗生素进入水环境的一个重要途径3。1.2 四环素类抗生素的污染现状四环素类是由链霉菌产生的一类广谱抗生素，在化学结构上都属于多环并四苯羧基酰胺母核的衍生物，可分为天然品和四环素类抗生素，一般通过与核蛋白体的30S亚单位结合，阻止氨酰基tRNA同核蛋白体结合产生药理作用，起到抑菌、杀菌作用。20世纪40年代末、50年代初，金霉素、土霉素和四环素相继从链霉菌发酵液中分离得到，这3种四环素类抗生素都显示了完全的交叉抗性，有着相似的、广泛的抗菌谱，对革兰氏阳性、革兰氏阴性菌、支原体、立克次体和衣原体之类的微生物都有活性。1957年，去甲环素被发现，通过对这些抗生素进行降解研究，人们发现它们具有极为相似的化学结构，有4个环线形相连构成主体骨架，从此“四环素”被看成一类新的抗生素。目前，四环素类抗生素中最主要种类包括四环素、土霉素、金霉素等，其他半合成制取种类主要包括甲烯土霉素、强力霉素、二甲胺基四环素等。四环素类抗生素在进入人或动物体内后，由于氧化、还原、水解以及共轭接合作用，这些药物形态的改变使其理化性质和生态毒性发生变化，但研究显示，随动物体排出以后，代谢物质可能会恢复为其母体化合物4。在密集型养鱼场，最终有70%80%药物流入环境之中5。在密集型畜牧养殖场这种现象同样严重。有报道显示：土霉素在绵羊粪便中残留21%，金霉素在小公牛粪便中残留17%75%6。Liguoro等7以60mgkg-1d-1土霉素的量对50头农场喂养的西门塔尔牛进行5 d口服实验，此后对其粪肥中土霉素含量进行测定。结果表明，土霉素在粪肥中的半衰期为30 d，在粪肥熟化5个月后仍然检测到土霉素的残留，含量达到820 gk-1。在德国农业土壤和草原土壤的010cm土壤表层中分别检测到含有4 mgk-1和0.86 mgk-1的四环素8。而在荷兰，有研究推测，如果将荷兰在饲料中添加的所有促生长剂分散在200万hm2的耕地上，那么每平方米的耕地上可能发现130 mg抗生素及其代谢物，与之对应的是每千克干土为0.9 mg。实际上，四环素类抗生素的分布不可能如此均一，因此可以预测，部分地区的局部浓度要高于平均值。即由于抗生素环境浓度预测模型的不成熟，以及抗生素环境分布的变异性，局部地区的浓度真实值可能远大于预测平均值9。由此可见，四环素类抗生素的污染作为一个全球性普遍存在的问题，这类物质一般均具备高生物活性和持久性，这就决定了其必然具有一定的潜在生态环境风险。尤其是随着集约化现代畜禽养殖业的迅速发展，抗生素类药物构成对环境以及对生态系统和人体健康的威胁日益暴露。虽然，人们对药物及个人防护品污染物（PPCPs）等新型污染物造成的生态环境问题给予了越来越多的关注，而作为PPCPs这一大类污染物中的四环素类药物的环境污染方面的研究还相对较少1013，尤其是其污染机理及生态毒性的研究还处于研究的起始阶段。因此，对四环素类药物的生态毒理研究非常必要。1.3 四环素类抗生素的生态毒性1.3.1 四环素类抗生素对微生物的生态毒性由于四环素类抗生素主要用来抑制菌类物质的生长发育，因此近年来研究者们对于四环素对细菌、真菌和微藻等的生态毒性做了广泛研究。一般情况下，四环素对原核生物（如蓝藻）的毒性高于单细胞真核生物（如微藻类），单细胞生物对抗生素的敏感度则高于多细胞生物，这也与设计生产四环素类药物的初衷一致。例如，通过对费氏弧菌的长达24h毒性研究表明，四环素的EC50值为0.0251 mgkg-114。Ferreira等同时研究了四环素对扁藻的和卤虫的生长抑制情况，结果表明，扁藻对四环素的敏感度大约为卤虫的70倍，这一规律也被许多类似实验所验证1518。四环素类药物对微藻的毒性主要体现在抑制微藻蛋白质合成和叶绿体的生成最终造成对微藻生长的抑制。Ferreira等依据OECD201准则藻类生长抑制测试（OECD，1984）研究了四环素对扁藻的生长抑制情况。通过96 h暴露，在四环素浓度大于5.3 mgL-1溶液中扁藻的生长抑制显著，NOEC值为3.6 mgL-1，LOEC值为5.3 mgL-1，72 h及96h IC50值分别为13.16（95%置信区间为：10.2418.89 mgL-1）和11.18 mgL-1（95%置信区间：8.3915.84 mgL-1）。此外，四环素类药物能够抑制铜绿微囊藻和绿藻的蛋白质合成。强力霉素对绿藻的毒性为IC50=15.2 mgL-119，土霉素能抑制等鞭金藻叶绿素含量的生成，并且药量越大抑制作用越强；对类胡萝卜素的生成起促进作用，药量越大则类胡萝卜素含量越多。叶绿素含量减少，则藻细胞的光合作用强度下降，即新陈代谢强度减弱，细胞的繁殖能力下降。20王志强运用藻类抑制试验，以光密度法确定藻细胞的生物量，研究了兽医临床12种常用的抗菌药对铜绿微囊藻的急性毒性。试验结果表明，大多数所测定的抗菌药对铜绿微囊藻藻都有不同程度的抑制作用，半数抑制浓度（EC50）值处于mg/L水平，同时，抗菌药对藻类的急性毒性呈明显的剂量效应关系，并且铜绿微囊藻对抗菌药较为敏感21。表1-1 抗菌药对铜绿微囊藻的急性毒性抗菌药对铜绿微囊藻的急性毒性药物浓度范围48hEC5072hEC5096hEC50红霉素0.02-0.640.220.0860.047泰乐菌素0.10-3.200.2680.2230.128替米考星0.04-1.280.2070.1390.061泰妙菌素0.01-0.320.470.1620.083新霉素1.00-32.0016.63814.8419.473阿米卡星2.00-64.0031.01321.24114.325卡那霉素4.00-128.00氟苯尼考1.00-32.005.2835.9925.796恩诺沙星1.00-32.003.30732.095诺氟沙星4.00-128.001.3.2 四环素类抗生素对植物的生态毒性目前四环素类抗生素对植物的生态毒性的研究主要集中在对实验室模拟条件下水生植物和陆生植物的水培养条件下的毒性研究。多项研究表明，四环素类抗生素可能通过抑制叶绿体合酶的活性，从而对植物生长产生抑制作用，影响植物发芽率和根的生长，这与四环素对微藻的毒性研究结果相似。四环素类药物对植物根的毒性较大，高浓度时显著抑制初生根的生长，这可能与四环素在植物根部的蓄积量有关，在根部蓄积量最多，因此表现出对根生长的抑制作用最为显著。Migliore等22的研究证实了该机制，研究发现植物的根是抗生素药物的主要积累场所。当土霉素浓度升高时，紫花苜蓿的叶子出现变黄现象，四环素类抗生素对紫花苜蓿的毒性可能是由于四环素与叶绿体合酶结构相似，因此四环素抑制了叶绿体翻译活性及叶绿体合酶的活性。23、24Kong等25通过一系列溶液培养实验对于紫花苜蓿对土霉素的摄取情况及土霉素对紫花苜蓿发芽及根的生长的影响进行了研究。研究表明，当浓度高于0.02 mmolL-1时，土霉素对紫花苜蓿的生长有显著的抑制作用。根的生长较发芽对土霉素更为敏感，土霉素对紫花苜蓿发芽及根生长的抑制率分别达61%和85%。1.3.3 四环素类抗生素对动物的生态毒性四环素类抗生素能够抑制水生动物多种酶的活性，如乙氧基试卤灵-O-去乙基酶、-半乳糖苷酶等，并可能造成鱼类较严重的DNA损伤。Wollenberger等根据水蚤急性毒性试验的标准协议（ISO，1989b）测定了包括四环素类抗生素在内的9种抗生素对水蚤的急性毒性，并根据48 h急性毒性试验EC50值进行排序。同时，根据水蚤繁殖测试标准过程（OECD，1996）利用半静态检验估计其对水蚤生殖能力的毒性效应。结果表明，土霉素的48h EC50超过1000 mgL-1，而四环素的NOEC值为340 mgL-1，在每个浓度均观察到对水蚤生殖能力的影响，其影响较急性毒性水平低一个数量级。Ferreira等以硝化纤维过滤的大西洋海水中的卤虫为研究对象，通过24 h和48 h的卤虫死亡数计算死亡率，利用概率值分析法计算半致死浓度，结果显示，四环素24 h和48h IC50分别为870.47 mgL-1（95%置信区间为：778.83983.66 mgL-1）和805.99 mgL-1（95%置信区间为：650.711129 mgL-1），其NOEC和LOEC值分别为637 mgL-1和828 mgL-1。1.4 四环素的理化性质和药理毒理1.4.1 四环素的理化性质该盐酸盐为黄色结晶性粉末；无臭，味苦；有引湿性；遇光色渐变深，在碱性溶液中易破坏失效。在水中溶解，在乙醇中略溶，在氯仿或乙醚中不溶。分子式C20H24N2O8，分子量444.45。黄色晶体，熔点170175C（分解）。微溶于水，溶于乙醇和丙酮，在空气中稳定，但易吸收水分，受强日光照射变色。密度：1.644 g/cm3；沸点：790.622C at 760 mmHg；蒸汽压：0 mmHg at 25C。图1-1 四环素结构式对革兰氏阳性和阴性细菌，各种立克次氏体、螺旋体、大型病毒等有抑制作用。用于治疗肺炎、斑疹伤寒、阿米巴痢等。供口服。但有呕吐、恶心、腹泻等副作用。可由金霉素脱氯制得，或由培养能产生四环素的放线菌的发酵液中提取。1.4.2 四环素的药理毒理四环素为广谱抑菌剂，高浓度时具杀菌作用。除了常见的革兰阳性菌、革兰阴性菌以及厌氧菌外，多数立克次体属、支原体属、衣原体属、非典型分枝杆菌属、螺旋体也对本品敏感。四环素对革兰阳性菌的作用优于革兰阴性菌，但肠球菌属对其耐药。其他如放线菌属、炭疽杆菌、单核细胞增多性李斯特菌、梭状芽孢杆菌、奴卡菌属等对四环素敏感。四环素对淋病奈瑟菌具一定抗菌活性，但耐青霉素的淋球菌对四环素也耐药。四环素对弧菌、鼠疫杆菌、布鲁菌属、弯曲杆菌、耶尔森菌等革兰阴性菌抗菌作用良好，对铜绿假单胞菌无抗菌活性，对部分厌氧菌属细菌具一定抗菌作用，但远不如甲硝唑、克林霉素和氯霉素，因此临床上并不选用。多年来由于四环素类的广泛应用，临床常见病原菌包括葡萄球菌等革兰阳性菌及肠杆菌属等革兰阴性杆菌对四环素多数耐药，并且，同类品种之间存在交叉耐药。四环素的作用机制在于药物能特异性地与细菌核糖体30S亚基的A位置结合，阻止氨基酰tRNA在该位上的联结，从而抑制肽连的增长和影响细菌蛋白质的合成。1.5 蓝藻、铜绿微囊藻1.5.1 蓝藻概述蓝藻和具原核的细菌等一起，单立为原核生物界。所有的蓝藻都含有一种特殊的蓝色色素，蓝藻就是因此得名。蓝藻门分为两纲：色球藻纲和藻殖段纲。色球藻纲藻体为单细胞体或群体；藻殖段纲藻体为丝状体，有藻殖段。蓝藻在地球上分布十分广泛，遍及世界各地，但大多数（约75%）淡水产，少数海产；有些蓝藻可生活在6085C的温泉中；有些种类和菌、苔藓、蕨类和裸子植物共生；有些还可穿入钙质岩石或介壳中（如穿钙藻类）或土壤深层中（如土壤蓝藻）。1.5.2 铜绿微囊藻概述铜绿微囊藻是常见的水华蓝藻，属原核生物界、真细菌、蓝藻门、蓝藻纲、色球藻目、微囊藻科、微囊藻属。铜绿微囊藻细胞大小仅有3至8微米，且其外没有鞘包覆。细胞常聚集成肉眼可见的群落，这些群落本为圆形，经过时间发展可能会产生孔洞并呈不规则形状。原生质体的颜色是浅蓝绿色，但因细胞中具有充满空气的囊泡在光下可能呈暗色，这是光学显微镜下微囊藻的鉴别特征之一。囊泡提供微囊藻足够的浮力，使其停留在有足够光线和二氧化碳提供生长的水层。铜绿微囊藻较偏好高温，但毒性与最高生长率不一定有关联，在实验室培养中，32C具有最高的生长率，但毒性最强的温度是20C。温度低于15C时其生长会被显著的抑制。铜绿微囊藻对光照度要求不高，较低光照度即可快速增长，光照度20006000 Lx适宜铜绿微囊藻快速增殖，在4000 Lx时生长最快。除了毒素外，铜绿微囊藻形成水华时淡水溶氧量的显著降低也会导致水中动物的死亡。1.5.3 藻类水华在许多富营养化水体中，由于蓝藻的增殖，常常会形成大量的水华，这不但影响水质，且在某些时期具毒性。蓝藻的毒素是细胞内毒素，当细胞腐败裂解后，毒素被释放到水体中。野生动物、家畜及家禽饮用了含有毒藻及藻毒的水后，会引起中毒甚至死亡，人饮用后也会出现中毒现象，因此当作为饮用水源的湖泊、水库和河流中出现蓝藻水华时，则应引起注意。水华能够引起家畜和禽类中毒死亡以来，已证实有十一多种蓝藻能够引起动物中毒甚至死亡，其中铜绿微囊藻、水华鱼腥藻和水华束丝藻是形成淡水蓝藻水华的主要种类，故有关的研究较多。铜绿微囊藻的毒素是多肤类的肝毒素，主要引起动物肝脏淤血肿大，并对肝细胞有破坏作用。1.6 微囊藻毒素的污染现状1.6.1 微囊藻毒素的污染现状蓝藻分布广泛，全球各大洲范围内有多达六十多个国家和地区报道过蓝藻水华的发生，存在于蓝藻细胞中的微囊藻毒素，随着细胞的衰老、死亡或溶解会释放到水体中，因此全世界很多地区、国家的天然水体，甚至饮用水中都检测到了微囊藻毒素。自然界中水华暴发时，若无外来影响使其迅速溶解，水体中的毒素含量至多只有0.110 g/L，而细胞内的毒素则会高出几个数量级26。大型湖泊、河流中蓝藻释放的藻毒素可被大量水体稀释，但大规模蓝藻水华溶解时，就会使毒素达到较高浓度，造成潜在危害。1.6.2 天然及水库水体的微囊藻毒素污染我国是一个湖泊众多的国家，20世纪90年代以来，蓝藻水华暴发的面积、强度以及藻毒素含量均在大幅度增长，由此带来的环境和生物安全问题日益引起关注。这其中，以云南滇池、江苏太湖、安徽巢湖的蓝藻水华污染最为严重。此外，长江、黄河、松花江中下游等主要河流以及鄱阳湖、武汉东湖、上海淀山湖等几大淡水湖泊、水库中也都相继发生了不同程度的蓝藻水华污染并检测到了MC的存在，目前对我国南北几个省市各水体都有不同程度的MC污染，其中以沟塘水、河水和水库水最为严重。Song等27于2005年在太湖五里湖和梅梁湾检测的表层水最大胞外MC含量分别为2.71和6.66 g/L。Shen等28报道太湖梅梁湾的微囊藻毒素随时间和营养盐水平的不同有很大差异，胞内毒素最高可达97.32 g/g干藻。徐海滨等对江西鄱阳湖的调查显示，水体微囊藻毒素最大为1036.9 pg/mL，同时发现鱼体内有素积累。王红兵等曾检测到上海淀山湖水体中MC浓度最高可达55.4 ng/mL。2005年对北京市重要饮用水水源地官厅水库、密云水库和怀柔水库水源水样进行藻毒素调查发现，在藻类的高发季节，3个水库水体中均检出MC，其中官厅水库7月份MC最高值达到20 g/L。广东省典型供水水库和淡水湖泊微囊藻毒素分布广泛，毒素组成以MC-RR为主，水库微囊藻毒素含量在00.919 g/L。陈刚等在原发性肝癌高发地区江苏海门等地的许多沟塘中检出大量的微囊藻毒素，河水和沟塘水中检出的MC最高分别达1558 pg/mL和300 pg/mL。1.6.3 饮用水的微囊藻毒素污染除天然水体及水库源水中普遍检测出MC外，饮用水也存在MC污染。澳大利亚某清澈湖水处理的自来水样品检测出MC(123 pg/mL)，加拿大Alberta地区某湖来源的自来水样品MC-LR含量在1001000 pg/mL之间。国内相关研究表明，包括上海、厦门、无锡及昆山在内的部分城市自来水厂出水样品中能检测出MC，部分样品最大浓度接近甚至超过安全限值（1g/L）。刘天富等测得三门峡市饮用水调蓄池中微囊藻毒素在0.82957.9 ng/L之间，出水厂为2.7101.33 ng/L。二次供水的污染情况要大于管网水，重庆涪陵区城乡用水的二次供水中检测出MC最大浓度为0.53 g/L（2006年9月），8、9、10月份农村井水中MC平均含量为0.48 g/L。1.7 课题研究的意义和目的无论是抗生素还是铜绿微囊藻水华引起的水体污染都是当今水生态环境面临的重要问题，而两者普遍存在于水体中，共存的可能性很大。而关于四环素的急性毒性效应的研究还非常有限，四环素对生态系统的初级生产者藻类的毒性的研究尚不够多。因此研究四环素类抗生素对铜绿微囊藻的毒性、以及铜绿微囊藻对四环素的降解作用，不仅有助于我们进一步了解四环素类抗生素和铜绿微囊藻的特性，也旨进一步了解并掌握四环素的化学性质及生物有效性，化合物的染毒及抗生素残留分析的方法。这对四环素类抗生素的应用，评价生态风险，减少毒害是十分重要的。因此，选用淡水藻铜绿微囊藻为研究对象，研究四环素对铜绿微囊藻的急性毒性是具有现实意义的。1.8 课题研究的内容急性毒性是指机体（人或实验动物）一次（或24小时内多次）接触外来化合物之后所引起的中毒效应，甚至引起死亡。藻类是最简单的光合营养有机体，种类繁多，分布很广，是水生生态系统的初级生产者。藻类生长因子包括光照、二氧化碳、适宜的温度、pH值及氮、磷、微量元素等其他营养成分，这些因子的变化会刺激或抑制藻类的生长。在一定环境条件下，如果某种有毒有害的化学物质及其复合污染物进入水体，藻类的生命活动就会受到影响，生物量就会发生改变。所以，通过测定藻类的数量就可以评价有毒有害污染物对藻类生长的影响及对整个水生生态系统的综合环境效应。本课题将研究：铜绿微囊藻细胞密度与吸光度的关系、铜绿微囊藻生长曲线及抑制率、铜绿微囊藻pH变化规律、考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量、高效液相色谱检测四环素在铜绿微囊藻液中的降解。2. 实验条件及预实验2.1 实验条件2.1.1 实验仪器BXM-30R立式压力蒸汽灭菌锅（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）JY96-2N超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）RJ-TGL-16B高速离心机（无锡瑞江分析仪器有限公司）FA1004电子天平（上海海康电子仪器厂）PHS-3CpH计（上海佑科仪器仪表有限公司）超声仪（上海宁商超声仪器有限公司）TU-1810紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）SPX-GB-150光照培养箱（上海博泰实验设备有限公司）BCD-108S（康佳冷藏冷冻箱）电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）Dragonlab TopPette移液枪1000 L、200 LLabTech高效液相色谱仪-UV600紫外可见检测器（北京莱伯泰科仪器有限公司）0.45m针头过滤器（郭店桃园医疗化工仪器厂，海宁市）2.1.2 实验材料10 mL、25 mL容量瓶各1个50 mL、100 mL三角烧瓶各15个250 mL、500 mL三角烧瓶各2个10 mL试管20支100 mL烧杯4个、250 mL、500 ml烧杯各一个50 mL、100 mL、250 mL量筒各1个4 L培养液储备瓶1个石英比色皿2对100 L微量进样针1支200 L、1000 L移液枪头若干1.5 mL、4.0 mL离心管若干一次性无菌注射器若干称量纸、擦镜纸若干图2-1 实验室部分仪器设备2.1.3 实验药品纯水、无水乙醇（分析纯）、甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）。NaNO3、K2HPO43H2O、MgSO47H2O、CaCl22H2O、C6H8O7H2O、C12H22FeN3O14、C10H14N2O8Na22H2O、Na2CO3、H3BO3、MnCl24H2O、ZnSO47H2O、Na2MoO42H2O、CuSO45H2O、Co(NO3)26H2O。以上实验药品均为上海展云化工有限公司的分析纯药品。2.2 预实验2.2.1 BG11培养液的配置本实验所配培养液为BG11培养液，每次配制1瓶（4 L）。表2-1 配置BG11培养液编号成分化学式单位含量含量1硝酸钠NaNO31.5 g/L6.0g2磷酸氢二钾K2HPO43H2O0.04 g/L0.160g3硫酸镁MgSO47H2O0.075 g/L0.300g4二水合氯化钙CaCl22H2O0.036 g/L0.144g5柠檬酸C6H8O7H2O0.006 g/L0.024g6柠檬酸铁铵C12H22FeN3O140.006 g/L0.024g7乙二胺四乙酸二钠C10H14N2O8Na22H2O0.005 g/L0.02g8无水碳酸钠Na2CO30.02 g/L0.08g9A51 ml/L4ml9-1硼酸H3BO32.86 g/L2.86g9-2氯化锰MnCl24H2O1.86 g/L1.86g9-3硫酸锌ZnSO47H2O0.22 g/L0.22g9-4钼酸钠Na2MoO42H2O0.39 g/L0.39g9-5硫酸铜CuSO45H2O0.08 g/L0.08g9-6硝酸钴Co(NO3)26H2O0.05 g/L0.05g上表为BG11培养基配置的具体方法。首先取一洁净的4 L玻璃瓶，加入4 L纯净水（实验采用娃哈哈瓶装纯净水）。随后分别按上表所示在FA1004电子天平上称取硝酸钠6.0g、磷酸氢二钾0.160g、硫酸镁0.300g、二水合氯化钙0.144g、柠檬酸0.024g、柠檬酸铁铵0.024、乙二胺四乙酸二钠0.02、无水碳酸钠0.08g。随后领取一洁净1 L玻璃瓶，按上表9-19-6配置微量元素A5一瓶。配置后均需超声溶解并混合均匀。再取1000 L的Dragonlab TopPette移液枪移取A5液4 mL加入上述4 L的玻璃瓶中。2.2.2 高压蒸气灭菌灭菌是指用物理或化学的方法杀灭全部微生物，包括致病和非致病微生物以及芽孢，使之达到无菌保障水平。本实验采用高压蒸气灭菌法。高压蒸气灭菌法是利用适当温度和压力的饱和水蒸气加热杀灭微生物的一种方法。实验采用BXM-30R立式压力蒸汽灭菌锅，对实验所需的培养液（培养基）、以及洁净的容量瓶、三角烧瓶、烧杯、试管等进行灭菌。灭菌条件为在121C，0.11 MPa下灭菌30分钟，待灭菌锅压力指示为0 MPa时，将灭菌后的培养液取出置于避光处存放。将其余灭菌后的器皿放入电热鼓风干燥箱中，在70C的环境下鼓风干燥2小时。等到需要用时方才取出。本实验所有实验器皿均须灭菌操作。2.2.3 铜绿微囊藻的接种铜绿微囊藻FACHB 905购于中国科学院武汉水生所（武汉，中国）。接种时须满足以下条件：藻种的质量一般要求选取无敌害生物污染、生活力强、生长旺盛的藻种培养，藻液的外观应颜色正常、无大量沉淀和无明显附壁现象；接种的藻液容量和新配培养液量的比例为1:21:3；接种的时间最好是在上午的8时10时，不宜在晚上接种。上午接种可以吸取上浮的运动力强的藻细胞做藻种，弃去底部沉淀的藻细胞，起到择优的作用。接种时一般选250 mL三角烧瓶接种原藻液50 mL并加入新配培养液100150 mL或选取500 mL的三角烧瓶接种原藻液100 mL并加入新配培养液250 mL。2.2.4 铜绿微囊藻的培养培养环境为SPX-GB150人工智能气候箱。培养方法是使用上述250 mL或500 mL的经过藻液接种的三角烧瓶。三角烧瓶应用四层纱布封口以防污染和倾倒，培养前藻液应当为浅绿色，经过7天的培养，藻液颜色变化为翠绿色。藻液的培养环境为：温度为250.5C，光照在20004000 Lx连续静止培养。每天摇动3次。白天黑夜时间比为12h:12h。2.3 实验方案论证诸多文献阐明，四环素类抗生素能微生物、植物和动物都会产生影响。四环素类药物对微藻的毒性主要体现在抑制微藻蛋白质合成和叶绿体的生成最终造成对微藻生长的抑制。多项研究表明，四环素类抗生素可能通过抑制叶绿体合酶的活性，从而对植物生长产生抑制作用，影响植物发芽率和根的生长，这与四环素对微藻的毒性研究结果相似。四环素类抗生素能够抑制水生动物多种酶的活性，如乙氧基试卤灵-O-去乙基酶、-半乳糖苷酶等，并可能造成鱼类较严重的DNA损伤。我们的课题四环素对蓝藻的急性毒性研究在理论上是能够得到支持的。就技术而言，实验室对本项目开展了前期研究，结果表明本项目在科学上和技术上是可行的。项目采用的实验方法和分析测试技术，都是公开报道经过证实的实验方法与技术，能保证实验结果的准确性和可比性。在硬件上，学校测试中心拥有本项目所需的大型设备：紫外-可见分光光度计、细胞破碎仪、培养箱、离心机、电子显微镜、灭菌锅等。具备完成本课题所需的吸光度的测定以及生长曲线的绘制、毒理学实验的先进仪器设备和良好工作条件。这些条件为实验的顺利进行奠定了基础。3. 实验方案与方法3.1 四环素储备液的配置使用分析天平秤取0.0100g的四环素，加入经灭菌烘干过的10 mL容量瓶中，并使用1000 L的移液枪移取10 mL娃哈哈纯净水配置成为浓度为1000 mg/L的四环素储备液10 mL。3.2 铜绿微囊藻细胞数与吸光度的关系3.2.1 实验原理我们采用微生物的光学显微镜直接计数法。血球计数板是一