紫肉甘薯(Ipomoea batatas(L)Lam.)花色素苷生物合成的分子调控研究-硕士论文

S t u d i e so nt h em o l e c u l a rr e g u l a t i o no ft h ea n t h o c y a n i n b i o s y n t h e s i so fp u r p l e - - f l e s h e ds w e e t p o t a t o ( I p o m o e ab a t a t a s ( L ) L a m ) D i s s e r t a t i o nS u b m i t t e dt o S o u t h w e s tU n i v e r s i t y i np a r t i a lf u l f i l l m e n to ft h er e q u i r e m e n t f o r t h ed e g r e eo f D o c t o ro fP h i l o s o p h yi nA g r o n o m y B y X i a o q i a n gL i u D i s s e r t a t i o nS u p e r v i s o r s ：P r o f e s s o rM i n g y a n gL ia n dZ h i h u aL i a o C h o n g q i n g C h i n a N o v e m b e r , 2 0 1 0 1 _ 本研究受国家8 6 3 计划项目 “甘薯花色素苷和1 3 一胡萝卜素植物代谢产物生物反应 器研制和重庆市重点科技攻关项目“转基因甘薯新品 种培育关键技术研究与应用 资助 7 、一 产 I - 独创性声明 学位论文题目：苤囟盐蔓逝垒丝望丝垒垡丝丝苎( L 】L 垒婴：) 蕉鱼盍董生堑佥盛 数金壬迥控珏究 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加了 特别标注。对本研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、同仁 在文中作了明确说明并表示衷心感谢。 学位论文作者：么降签字魄咖年厂明夕日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院( 筹) 可以将学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：凹不保密， 口保密期限至年月止) 。 辜位论文作者签名：确夥哩 签寒毛蒋j “每l 、舞 B 导师张苦磊移 签字嘲：圳碑位月7 日 一 _ 入 、7 - 目录 摘曼要I A b s t r a c t I V 第一部分绪论1 第一章文献综述1 l 甘薯的生产现状与应用2 1 1 甘薯生产利用现状2 1 2 甘薯的营养价值2 1 3 甘薯与食品加工3 1 4 甘薯与工业加工4 1 5 甘薯开发利用存在问题及建议5 2 花色素苷与其生理保健功能。6 2 1 清除自由基抗氧化作用9 2 2 抗肿瘤、降血压等其它功效9 3 花色素苷生物合成的分子生物学1 0 3 1 生物合成途径的结构基因10 3 1 1 查尔酮合成酶( C h a l c o n es y n t h a s e ，C H S ) 1 2 3 1 2 查尔酮异构酶( C h a l c o n ei s o m e r a s e ，C H I ) 1 3 3 1 3 黄烷酮3 羟化酶( F l a v a n o n e3 - h y d r o x y l a s e ，F 3 H ) 1 3 3 1 4 二氢黄酮醇4 还原酶( D i h y d r o f l a v o n o l4 r e d u c t a s e ，D F R ) 1 4 3 1 5 花色素合成酶( A n t h o c y a n i d i ns y n t h a s e ，A N S ) 一1 5 3 1 63 一O - 葡萄糖转移酶( 3 - O - g l u c o s y l t r a n s f e r a s e ，3 G T ) 1 6 3 2 参与花色素合成调控的转录因子1 7 3 3 花色素苷生物合成途径的基因工程1 8 第二章引言2 1 第二部分紫肉甘薯花色素苷生物合成途径关键酶基因的克隆、功能分析及表达特 性研究_ 2 3 第一章紫肉甘薯二氢黄酮醇4 还原酶基因( I b D F R ) 的克隆、功能分析及表达特性 研究2 3 1 1 材料与方法2 3 1 1 1 植物材料2 3 1 1 2 菌株与载体2 3 1 1 3 主要仪器和设备。2 3 1 1 4 试剂盒及试剂2 4 1 1 5 自配的试剂。2 4 1 1 6 常规方法介绍。2 5 两南大学博十学何论文 1 1 6 1I A 的提取2 5 1 1 6 2R N A 的质量检测2 6 1 1 6 3 植物基因组D N A 的提取2 7 1 1 6 4D N A 的琼脂糖凝胶电泳2 7 1 1 6 5 琼脂糖凝胶电泳后目标D N A 片断的回收2 7 1 1 6 6 质粒D N A 的提取2 8 1 1 6 7 连接反应2 8 1 1 6 8 大肠杆菌D H 5 a B L 2 1 感受态细胞的制备( C a C l 2 法) 2 9 1 1 6 9 连接产物或重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞2 9 1 1 6 1 0 重组子的鉴定、测序2 9 1 1 7 方法与步骤3 0 1 1 7 1 从紫肉甘薯块根R N A 合成第一链c D N A 3 0 1 1 7 2 紫肉甘薯l b D F R 基因的克隆3 1 1 1 7 2 1I b D F R 基因核心片段的获得一3 1 1 1 7 2 2I b D F R 基因3 端片段的获得3 2 1 1 7 2 3I b D F R 基因5 端片段的获得。3 3 1 1 7 2 4l b D F R 基因全长c D N A 的克隆3 3 1 1 7 2 5I b D F R 基因的生物信息学分析3 4 1 1 7 3I b D F R 基因的功能分析3 5 1 1 7 3 1I b D F R 基因转化烟草的功能验证3 5 1 1 7 3 1 1p C A M B I A l 3 0 4 + 的构建3 5 1 1 7 3 1 2I b D F R 植物表达载体的设计3 6 1 1 7 3 1 3p 1 3 0 4 + - I b D F R 载体构建过程3 8 1 1 7 3 1 4 植物表达载体对农杆菌的转化。3 9 1 1 7 3 1 5 农杆菌E H A l 0 5 介导p 1 3 0 4 + - P o D F R 遗传转化烟草4 0 1 1 7 3 1 5 1 烟草无菌苗的培养4 0 1 1 7 3 1 5 2 农杆菌的培养4 0 1 1 7 3 1 5 3 共培养一j 4 0 1 1 7 3 1 5 4 转基因烟草的诱导和再生4 1 1 1 7 3 1 6 转基因烟草的P C R 和荧光定量P C R 检测4 1 1 1 7 3 1 7 转基因烟草花色素苷含量检测一4 3 1 1 7 3 2l b D F R 基因在大肠杆菌中的表达及功能验证4 3 1 1 7 3 2 1l b D F R 基因原核表达载体的构建4 3 1 1 7 3 2 2I b D F R 重组蛋白的诱导表达与纯化4 5 1 1 7 3 2 3I b D F R 重组蛋白的检测和含量测定4 7 1 1 7 3 2 4I b D F R 重组蛋白的活性测定4 8 1 1 7 3 2 5I b D F R 重组蛋白的圆二色谱分析4 9 1 2 结果与分析4 9 A 、一 - ? 、 - 1 2 1I b D F R 基因的克隆：4 9 1 2 1 1 紫肉甘薯块根总R N A 的提取。4 9 1 2 1 3 ，6 D 职基因的生物信息学分析5 1 1 2 1 3 1I b D F R 蛋白的同源比对与系统进化分析5 l 1 2 1 3 1I b D F R 蛋白的二级结构和三级结构分析5 4 1 2 3 乃D 职基因的功能分析5 5 1 2 3 1I b D F R 基因植物表达载体构建与工程菌的获得5 5 1 2 3 2l b D F R 基因导入烟草及转化植株的获得5 6 1 2 - 3 3 转乃舾R 基因烟草的P C R 鉴定5 8 1 2 3 4 转l b D F R 基因烟草花色素苷的测定5 9 1 2 3 5 乃朋R 基因在烟草中荧光定量表达分析5 9 1 2 3 6I b D F R 基因原核表达载体及表达工程菌的构建6 0 1 2 3 7I b D F R 重组蛋白的获得和纯化6 1 1 2 3 8I b D F R 重组蛋白的酶活测定6 2 1 2 3 9I b D F R 重组蛋白的圆二色谱分析6 4 1 3 小结与讨论。6 4 1 4 结论与展望6 6 第二章紫肉甘薯黄烷酮3 羟化酶( I b F 3 H ) 和花色素合成酶( I b A N S ) 基因的克隆与特 征分析。6 7 ： 2 1 材料与方法6 7 2 1 1 植物材料一6 7 2 1 2 试剂6 7t ： 2 1 3 材料的准备、甘薯总R N A 的提取、质量检测；D N A 连接、转化和测序6 7 2 1 4 从紫肉甘薯块根R N A 合成第一链e D N A 6 7 2 1 5 紫肉甘薯I b F 3 H 基因的克隆一6 7 2 1 5 1 脑乃日基因核心片段的获得6 7 2 1 5 2 乃乃日基因3 端片段的获得6 8 2 1 5 3I b F 3 H 基因5 端片段的获得6 9 2 1 5 4 乃丹日基因全长e D N A 的克隆7 0 2 1 6 紫肉甘薯删 心基因的克隆7 0 2 1 6 1 删 俗基因核心片段的获得7 0 2 1 6 2 删 岱基因3 端片段的获得7 1 2 1 6 - 3 删 俗基因5 端片段的获得7 2 2 1 6 4I b A N S 基因全长e D N A 的克隆7 3 2 1 7I b F 3 H 、删 丐基因的生物信息学分析7 4 2 2 结果与分析7 4 2 2 1 乃乃日基因的克隆7 4 2 2 1 1I b F 3 H 基因全长c D N A 序列分析7 4 两南大学博十学位论文 2 2 1 2I b F 3 H 基因的生物信息学分析7 6 2 2 1 2 1I b F 3 H 蛋白的同源比对与系统进化分析一7 6 2 2 1 2 1I b F 3 H 基因的二级结构预测一7 9 2 2 2 删船基因的克隆8 0 2 2 2 1I b A N S 基因全长e D N A 序列分析8 0 2 2 2 2I b A N S 基因的生物信息学分析8 2 2 2 2 2 1I b A N S 蛋白的同源比对与系统进化分析8 2 2 2 2 2 2I b A N S 蛋白二级和三级结构分析一8 4 2 3 小结与讨论一8 5 2 4 结论与展望8 6 第三章紫肉甘薯花色素苷的生物合成与黄烷酮3 羟化酶( I b V 3 I - 1 ) 、二氢黄酮醇4 还原酶基医 ( I b D F R ) 和花色素合成酶( I b A N S ) 基因的组织表达特征分析。8 7 3 1 材料与方法8 7 3 1 1 植物材料8 7 3 1 2 试剂8 7 3 1 3 材料的准备、甘薯总R N A 的提取、质量检测；D N A 连接、转化和测序8 7 3 1 4 甘薯嫁接与管理8 7 3 1 5 甘薯花色苷含量检测8 7 3 1 6 甘薯I b F 3 H ，I b D F R 、I b A N S 等基因在各部位组织表达的荧光定量P C R 检测 8 7 3 2 结果与分析8 9 3 2 1 渝紫2 6 3 各部位组织总R N A 的提取8 9 3 2 2 甘薯嫁接试验花色素苷含量的分析9 0 3 2 3 乃乃日、I b D F R 、I b A N S 等基因在渝紫2 6 3 各部位组织表达的荧光定量分析 9 l 3 3 小结与讨论9 3 3 4 结论与展望9 4 第三部分总结9 5 1 主要结论9 5 2 主要创新点9 6 参考文献9 7 附录1 缩略词10 7 附录2 学习期间发表的论文和参加的科研项目一1 0 8 致谢10 9 A 。 摘要 紫肉甘薯( I p o m o e ab a t a t a s ( L ) L a m ) 花色素苷生物合成 的分子调控研究 作物遗传育种专业博士研究生：刘小强 指导教师：李名扬教授 廖志华教授 摘要 甘薯( 1 p o m o e ab a t a t a s ( L ) L a m ) 在分类学上属于旋花科甘薯属甘薯种，为一年生或多年 生蔓生草本，在热带、亚热带和温带广泛种植，是重要的粮食、饲料和工业原料作物。花色 素苷( a n t h o c y a n i n ) 广泛存在于开花植物中，是一类重要的水溶性的类黄酮化合物，是花色素 ( a n t h o e y a n i d i n ) 与各种单糖通过糖苷键结合形成的糖基化衍生物的总称。紫肉甘薯是指薯肉 颜色为紫色的甘薯，由于富含花色素苷而在近年被认定为特用品种，有较高的食用和药用价 值，紫肉甘薯含有的天然花色素苷具有广泛的生理活性，如抗氧化、降血糖、抑制遗传因子 突变等作用。虽然紫肉甘薯保健功能已经开始为大众知晓，但对紫肉甘薯花色素苷生物合成i 的分子调控机理却研究甚少，培育高花色素苷含量的紫肉甘薯品种难以实现。本论文旨在通 过对紫肉甘薯花色素苷生物合成途径中重要基因的克隆和功能研究阐明紫肉甘薯花色素苷生 ， 物合成的分子调控机理，为培育高花色素苷含量紫肉甘薯打下理论基础，也为以紫肉甘薯为 植物代谢生物反应器生产花色素苷提供理论依据。主要结果如下： 1 紫肉甘薯二氢黄酮醇4 - 还原酶基因( 乃胝R ) 的克隆及其功能研究 采用同源克隆的策略和R A C E 方法，从紫肉甘薯渝紫2 6 3 中克隆了二氢黄酮醇- 4 还原酶基 因I b D F R 的全长e D N A 序列( G e n b a n k 登录号为H Q 4 4 11 6 7 ) 。序列分析表明，历腑足基因e D N A 全长为1 3 9 2b p ，含有一个1 1 8 2b p 的O R F ，编码一个3 9 4 个a a 的蛋白。N C B I 的b l a s m 和b l a s t p 表明， I b D F R 基因的核酸与已知的D F R 基因核酸序列有高度的同源性，尤其与牵牛花D 职基因最相 似，达9 6 ；I b D F R 蛋白氨基酸序列与许多已知的植物D F R 蛋白具有很高的相似性，其中与同 为旋花科的牵牛花I n D F R 同源性最高，相似性达9 4 。聚类分析表明，甘薯I b D F R 与同属旋花 科的牵牛花I n D F R 同聚为一小枝。对I b D F R 保守结构域搜索表明，l b D F R 基因编码蛋白含有高 度保守的与N A D P H 结合和底物特异结合的保守基序，与已知结构和功能的D F R 蛋白的活性位 点和高级结构基本相同，因而推断I b D F R 蛋白具有生物学功能。 构建了l b D F R 基因的植物表达载体，并对烟草W 3 8 进行了转化，获得了转基因烟草植株， 两南大学博十学何论文 对转基因烟草花期I b D F R 基因的表达情况进行了分析。将所获得的再生植株炼苗后移栽到试验 地种植，都能正常生长发育，在生长期观察，与野生型烟草比较，转基因烟草植株在生长势、 株型等性状没有明显区别。在开花期明显地观察到，转基因植株中有花色明显加深的单株( 9 号) 出现，花器官中花色素苷含量显著提高，与野生型比较增量为5 0 左右，证实历嬲R 基 因在强启动子作用下能够对烟草的花色素苷含量起到上调作用。在随后的荧光定量P C R 检测 中，9 号单株l b D F R 基因的高表达进一步证实转基因烟草中花色素苷含量的提高与转入的 l b D F R 在对花色素苷合成途径起上调作用的一致性。在所获得的转基因烟草l 号和7 号植株，虽 经P c R 检测为阳性，但却未能表现乃嬲R 基因的功能，这很可能是由于转入的I b D F R 基因沉默 所致，从荧光定量P C R 检测结果也可以看出l 号相对表达量很微弱，7 号相对表达量也很低。 构建了I b D F R 基因原核表达载体，并在大肠杆菌B L 2 1 ( D E 3 ) d 尸表达了I b D F R 蛋白，通过N i 柱离子交换层析的方法纯化了目标蛋白。用圆二色谱对重组蛋白分析二级结构的组成分别为： a 螺旋1 3 9 ，B 折叠4 1 2 ，转角1 0 1 ，无规卷曲3 4 7 ，即重组蛋白中主要以p 折叠和无 规卷曲为主。但是通过氨基酸序列在E x p a s y l 网站利用S O P M A 预钡H b D F R 蛋白的二级结构发现 其包含1 5 3Q 螺旋，4 9B 折叠，2 5 转角和1 6 7 无规卷曲，即分别占3 8 8 3 、1 2 4 4 、6 3 5 和 4 2 3 9 ，即以a 螺旋和无规卷曲为主。以( + ) t a x i f o l i n 为底物进行了酶活实验，重组蛋白酶活测 定结果表明，原核表达的I b D F R 重组蛋白在辅因子N A D P H 的作用下能够催化底物( + ) t a x i f o l i n 转变为下游物质，说明重组蛋白具有酶的活性。圆二色谱测定结果和预测结果的不一致，说 明原核表达的重组蛋白和植物体内的蛋白在折叠上可能存在不一致，同时也说明原核表达的 蛋白在折叠时能形成与N A D P H 以及底物结合的保守结构域。酶活测定结果也充分说明该酶在 花色素苷生物合成途径中的关键作用。 2 紫肉甘薯黄烷酮3 羟化酶( I b F 3 H ) 和花色素合成酶( J 矗删S ) 基因克隆与特征分析 采用同源克隆的策略和R A C E 方法，从紫肉甘薯渝紫2 6 3 中克隆了紫肉甘薯黄烷酮3 斑化 酶( I b F 3 H ) 和花色素合成酶( b A N S ) 基因的全长e D N A 序列( G e n b a n k 登录号分别为H Q 4 4 1 1 6 8 和G U 5 9 8 2 1 2 ) 。紫肉甘薯l b F 3 厦基因e D N A 物理全长为1 2 8 0b p ，包括5 端U T R 、3 端U T R 和 p o l y A 尾巴以及包括一个编码3 6 8 个氨基酸残基的编码区，I b F 3 H 蛋白具有结合亚铁离子的保守 氨基酸H 2 1 9 、D 2 2 1 和H 2 7 7 ，结合酮戊二酸的R X S 基序R 2 8 7 $ 2 8 9 ，结构域位于蛋白的核心， H I F e 2 + 被包埋在酶的中心。紫肉甘薯尼4 朋王基因e D N A 物理全长为1 3 7 5b p ，包括5 端U T R 、3 端U T R 和p o l y A 尾巴以及包括一个编i 2 q 3 6 2 个氨基酸残基的编码区，N C B I 保守域搜索结果表明， I b A N S 蛋白也具有结合亚铁离子的保守氨基酸H 2 4 2 、D 2 4 4 、H 2 9 8 和结合酮戊二酸的R X S 基序 R 3 0 8 $ 3 1 0 ，和I b F 3 H 一样同属于类黄酮合成途径的2 O D D 酶家族。将乃乃且和枷的c D N A 序列与G e n B a n k 中其他乃卿刎晒绷U 比对发现，这两个基因与其他物种中该基因有很高的序 列相似性，蛋白的同源比对与系统进化分析结果表明，与近缘物种氨基酸相似性较高，并能 与同属旋花科的植物F 3 H 或A N S 聚为- - , J , 枝。生物信息学分析结果说明，从紫肉甘薯所克隆得 I T 摘要 到的尼乃日和尼4 穆e D N A 为植物普遍存在的乃硐姐4 燧因，并具有生物学活性。 3 紫肉甘薯花色素苷的生物合成与黄烷酮3 羟化酶( I b F 3 H ) 、二氢黄酮醇4 还原酶基 因( I b D F R ) 和花色素合成酶( I M N S ) 基因的组织表达特征分析 采用嫁接的方法分析了甘薯花色素合成的特点，并通过已克隆到的紫肉甘薯花色素苷合 成途径中的三个关键基因l b F 3 H ，l b D F R ，1 b A N S ，利用荧光定量分析方法对渝紫2 6 3 各部位组 织( 须根、0 5c m 块根、3 0c m 块根、外周皮、茎节、茎中部、叶柄、叶片、幼茎尖) 结构基 因的表达状况进行了分析：( 1 ) p s 5 3 和p s 5 3 + 2 6 3 包括块根( T R ) 和须根( F R ) 在内的各个组 织花色素苷相对含量都很低；渝紫2 6 3 和2 6 3 + p s 5 3 的块根( T R ) 及须根( F R ) 的花色素苷相 对含量明显高于其他类型组织；2 6 3 + p s 5 3 嫁接苗的块根( T R ) 及须根( F R ) 中花色素苷相对 含量高于渝紫2 6 3 相应组织，嫁接后花色素苷得到累积。可以推测：紫肉甘薯渝紫2 6 3 花色素 菅的生物合成主要在块根中完成，之后再运输到须根及茎、叶等其他组织器官。( 2 ) 对渝紫 2 6 3 各部位组织中I b F 3 H 、I b D F R 、尼孙隧因的荧光定量分析和这些组织中花色素苷的相对含 量测定结果说明，l b F 3 H ，l b D F R ，历雠0 5c m 块根、3 0c m 块根、外周皮中表达量明显高 于在茎节、茎中部、叶柄、叶片、幼茎尖等组织中的表达量；在0 5c m 块根、3 0e m 块根、外 周皮中花色素苷含量较高是由于结构基因高效表达的结果。紫肉甘薯花色素苷含量与花色素 苷合成途径中结构基因的表达密切相关。基因在甘薯块根的组织特异表达，是紫肉甘薯块根 花色素苷含量高的主要原因，这也解释了嫁接实验中紫肉甘薯的形成只和地下部分品种有关 而和地上部分薯苗品种无关。 关键词：紫肉甘薯黄烷酮3 羟化酶基因二氢黄酮醇- 4 还原酶基因花色素合成酶基因 花色素苷生物合成分子调控 I I I 两南大学博十学何论文 S t u d i e so nt h em o l e c u l a rr e g u l a t i o no f t h ea n t h o c y a n i nb i o s y n t h e s i so f p u r p l e f l e s h e ds w e e t p o t a t o ( I p o m o e ab a t a t a s ( L ) L a m ) P h DC a n d i d a t e ：X i a o q i a n gL i u S u p e r v i s o r s ：P r o f M i n g y a n gL ia n dZ h i h u aL i a o A b s t r a c t S w e e t p o t a t o ( I p o m o e ab a 细t a s ( L ) L a m ) b e l o n g st ot h ef a m i l yo fc o n v o l v u l a e e a e ，g e n u sI p o m o e a a n ds p e c i e sLb a t a t a s ，i sak i n do fh e r b a c e o u sa n n u a lo rp e r e n n i a lc r o p ，w h i c hi sa l li m p o r t a n ts o u r c e f o rf o o d , f e e da n di n d u s t r i a lm a t e r i a lb e i n gw i d e l yc u l t i v a t e di nt r o p i c a l ，s u b t r o p i c a la n dw a r m r e g i o n s A n t h o c y a n i n , ak i n do fi m p o r t a n ts o l u b l ef l a v o n o i dc o m p o u n di n c l u d i n gg l y c o s y l a t i o n d e r i v a t e so fa n t h o c y a n i d i nt h r o u g hc o m b i n i n gd i f f e r e n tm o n o s a c c h a r i d ew i t hg l u c o s i d i cb o n d ，C a n b ep r o d u c e db yaw i d er a n g eo ff l o w e r i n gp l a n t s P u r p l e - f l e s h e ds w e e t p o t a t om e a n ss w e e t p o t a t o w i t hp u r p l et u b e rf l e s h ，i ti sd e e m e da sas p e c i a lv a r i e t yd u et oi t sh i g ha n t h o c y a n i nc o n t e n t A c c o r d i n g l y , p u r p l e - f l e s h e ds w e e t p o t a t oe n j o y sh i g he d i b l ea n dm e d i c i n a lv a l u es i n c en a t u r a l a n t h o e y a n i nc o n t a i n sav a r i e t yo fb i o l o g i c a la c t i v i t i e si n c l u d i n ga n t i o x i d a n t , a n t i d i a b e t i c sa n d c u r b i n gg e n em u t a t i o ne t c A l t h o u g hi t sh e a l t hf u n c t i o nb e g i n st ob ea c k n o w l e d g e d , m o l e c u l a r m e c h a n i s mo fa n t h o c y a n i nb i o s y n t h e s i si np u r p l e - f l e s h e ds w e e t p o t a t oi se x t r e m e l yl i m i t e d ，t h u si ti s d i f f i c u l tt ob r e e dv a r i e t i e sc o n t a i n i n gh i g ha n t h o c y a n i nc o n t e n t T h i st h e s i sa i m st oe l u c i d a t e b i o s y n t h e t i cp a t h w a yo fa n t h o c y a n i nt h r o u g hc l o n i n ga n dc h a r a c t e r i z i n gk e yg e n e s ，t h u sp r o v i d e s t h e o r yf o u n d a t i o nf o rb r e e d i n gv a r i e t i e sp r o d u c i n gh i g hl e v e lo fa n t h o c y a n i na sw e l la sp r o d u c i n g a n t h o c y a n i nw i t hp u r p l e f l e s h e ds w e e t p o t a t oa sp l a n tm e t a b o l i s mb i o r e a c t o r T h em a i nr e s u l t si nO u r r e s e a r c ha r ea sf o l l o w s ： 1 C l o n i n ga n df u n c t i o n a la n a l y s i so fd i h y d r o f l a v o n o l4 - r e d u e t a s e ( I b D F R ) g e n e f r o mp u r p l e f l e s h e ds w e e t p o t a t o B a s e do nh o m o g e n o u sc l o n es t r a t e g ya n dR A C Et e c h n i q u e ，t h ef u l ll e n g t hc D N Ao fd i h y d r o f l a v o n o l 4 - r e d u c t a s ed e s i g n e da SI b D F Rw a sc l o n e df r o mp u r p l e f l e s h e ds w e e t p o t a t a ov a r i e t y2 6 3 ( G e n b a n k a c c e s s i o nn u m b e r ：H Q 4 4116 7 ) T h es e q u e n c ea n a l y s i sr e v e a l e st h a tt h ef u l l l e n g t hc D N Ao fI b D F R i s13 9 2 - b pl o n gf r a g m e n tg c o n t a i n i n ga118 2 - b po p e nr e a d i n gf r a m e ( O R F ) e n c o d i n gap o l y p e p t i d e o f3 9 4 a m i n oa c i d s B l a s t na n db l a s t pa n a l y s i so nN C B Is h o w e st h a tn u c l e o t i d es e q u e n c eo fI b D F R s h a r e sah i g hs i m i l a r i t yw i t hD F R sf r o mo t h e rp l a n t s ，e s p e c i a l l yw i t hI p o m o e an i l ( 9 6 i d e n t i t y ) , l i k e w i s e ，a m i n oa c i ds e q u e n c eo fI b D F Rs h a r e sah i 。g hs i m i l a r i t yw i t ho t h e rr e p o r t e dD F Rp r o t e i n s ， e s p e c i a l l yw i t hLn i l ( 9 4 i d e n t i t y ) T h ep h y l o g e n e t i ca n a l y s i si n d i c a t e s t h a tI b D F Ra n dD F Rf r o m I V 户 一 、 ， o A b s t r a c t Ln i ld e v e l o pi n t oo n es m a l lg r o u p A n a l y s i so fc o n s e r v e dd o m a i ni n d i c a t e st h a tI b D F Rp r o t e i n c o n t a i n sh i g h l yc o n s e r v e dN A D P Hc o m b i n i n ga n ds u b s t r a t es p e c i f i cm o t i f s I na d d i t i o n , I b D F Ri s s i m i l a rw i t hk n o w nD F Rp r o t e i n si na c t i v es p o t sa n da d v a n c e ds t r u c t u r e T h u si ti sp r e d i c t e dt h a t I b D F Rp r o t e i np o s s e s s e sb i o l o g i c a lf u n c t i o n E x p r e s s i o np l a s m i do f I b D F R w a sc o n s t r u c t e da n dW a Su s e df o rt r a n s f o r m a t i o nt ot o b a c c o ( N i c o t i a n a t a b a c u m ) W 3 8 T r a n s g e n i ct o b a c c op l a n t s w e r eo b t a i n e da n de x p r e s s i o np a t t e no fl b D F Ri n t r a n s g e n i cp l a n t sW a Sa n a l y s e d T r a n s g e n i cp l a n t sg r e wa n dd e v e l o p e dn o r m a l l ya f t e rt r a n s p l a n t e dt o f i e l d O b s e r v a t i o nd u r i n gg r o w t hp e r i o ds u g g e s t e dt h a tt r a n s g e n i cp l a n t sd i dn o ts h o wo b v i o u s d i f f e r e n c ei ng r o w t ht r e n da n dp l a n tt y p ec o m p a r e dt ow i l dt y p ep l a n t s D u r i n gf l o w e r i n gp e r i o d ，i ti s o b s e r v e dt h a tt h ef l o w e rc o l o ri nt r a n s g e n i cp l a n tn u m b e r9W a Ss h a r