矮牵牛组织培养体系的建立和ACO基因cDNA的克隆-硕士论文

b y 。 W A N G H o n g b o At h e s i ss u b m i t t e di np a r t i a ls a t i s f a c t i o no ft h e R e q u i r e m e n t sf o r t h ed e g r e eo f M a s t e ro f A g r i c u l t u r e F o r e s tT r e eG e n e t i cB r e e d i n g lS2 772 o fP e t u n i a Ao f A C C C e n t r a lS o u t h U n i v e r s i t yo fF o r e s t r ya n dT e c h n o l o g y 4 9 8S h a o s h a nS o u t hR o a d ，T i a n x i nD i s t r i c t C h a n g s h aH u n a n 410 0 0 4 ，E R C H I N A S u p e r v i s o r P r o f e s s o rJ I NX i a o l i n g J u n e ，2 0 1 0 I I II II III I I I III I I IIIl Y 18 4 8 14 6 科技大学 创性声明 指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了 含任何其他个人或集体己经发表或撰写的成果 他教育机构的学位或证书所使用过的材料。对 在文中以明确方式表明。本人完全意识到本声 作者签名：玉红夕絮 2 。f D 年乡一月7 旷 中南林业科技大学 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关 部门或机构送交论文的复印件或电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权中南林业科技大 学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于： l 、 保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、 不保密口。 ( 请您在以上相应方框打“”) 作者签名：至髫Z 波 导师签名： 叫。年6 弱F B 厶 乙 2 声t 夕年舌只日 矮牵牛组织培养体系的建立和A C O 基因e D N A 的克隆 摘要 矮牵牛( P e t u n i ah y b r i d aV i l m ) 花大色艳，花色丰富，广泛应用于花坛布置， 景点摆设，窗台点缀，家庭装饰中，深受各国人民喜爱。在我国，随着人们生活水平 的提高，对矮牵牛需求量日益增加。矮牵牛是一个杂交种，通过播种繁殖，发芽率很 低，且不易保持亲本优良性状。矮牵牛和其他鲜切花一样，随着花朵的开放而迅速衰 老，如何延缓花卉的衰老，延长花卉的观赏期已成为近年来专家们研究的主要课题之 一。本研究通过克隆矮牵牛A C C 氧化酶基因c D N A 片段，拟构建其R N A i 表达载体，转 入到矮牵牛愈伤组织中，通过组织培养再生体系，获得完整的再生植株。 本研究以矮牵牛子叶为材料，筛选出了矮牵牛组织培养各阶段的适宜培养基，成 功地获得了矮牵牛组织培养再生植株，建立了矮牵牛组织培养植株再生体系；以矮牵 牛衰老花瓣为材料，提取了花瓣组织总R N A ，通过特异引物R T - P C R ，克隆到矮牵牛 A C C 氧化酶基因c D N A 片段，为进一步研究奠定了基础，本研究取得的主要成果如下： 1 建立了矮牵牛组织培养再生体系 ( 1 ) 矮牵牛种子消毒本研究采用了二次化学试剂消毒法，7 5 乙醇和0 1 升汞组 合使用，这两种试剂最适消毒消毒时间分别为3 0 s 与8 m i n ； ( 2 ) 矮牵牛子叶诱导愈伤组织发生和增殖的最适培养基都为M S + I O m g L6 - B A + O 5 m g LN 从： ? - _ 一 ( 3 ) 矮牵牛子叶愈伤组织诱导不定芽发生的最适培养基为M S + O 5 m g L6 一B A + 0 2 m g LN 从： ( 4 ) 不定芽增殖和生根的最适培养基都为1 2 M S ； ( 5 ) 矮牵牛苗移栽最适基质为泥炭土：珍珠岩= 1 ：1 ，移栽存活率可达6 6 7 ； ( 6 ) 矮牵牛愈伤组织H y g 抗性筛选最适浓度为l O m g L 。 2 建立了适合矮牵牛衰老花瓣总R N A 提取的改良T r i z o l 试剂法 在传统T r i z o l 试剂法基础上，对其进行改良。结果表明，改良的T r i z o l 试剂法 能有效去除矮牵牛衰老花瓣中色素等物质，2 8 S 和1 8 S r R N A 条带清晰可见，亮度比在 1 0 - 2 0 之间，o D 渤o D 细平均值为1 7 5 ，o D 卿o D 瑚平均值为1 9 1 。 3 矮牵牛A C C 氧化酶基因c D N A 片段的获得 以矮牵牛衰老花瓣为材料，提取矮牵牛衰老花瓣总R N A ；经R T 反转录合成了第 一链c D N A ；根据A C C 氧化酶的保守序列，设计合成了一对特异引物；经P C R 扩增和 克隆，得到矮牵牛A C C 氧化酶基因c D N A 特异片段；在N C B I 网站上进行B l a s t 比较， 中南林业科技大学硕士学位论文 该片段具有高度保守性，与矮牵牛A C C 氧化酶基因家族同源性最高达到1 0 0 ，最低 也超过8 0 ，将该片段的互补序列编码的17 3 个氨基酸序列在N C B I 网站上进行B l a s t 比较，结果发现，该片段互补序列编码的氨基酸序列与显示的1 0 0 条A C C 氧化酶氨基 酸序列同源性为1 0 0 的有9 8 个，9 9 的有1 个，9 1 的有1 个。 关键词：矮牵牛；A C C 氧化酶；c D N A ；组织培养 H c h a r a c t e r i s t i c so ft h ep a r e n t sf o rah y b r i ds p e c i e s L i k eo t h e rf r e s hc u tf l o w e r s ，P e t u n i a h y b r i d a 1 mw i l ld e c a yr a p i d l yw h i l eb l o o m i n g H o wt op r o l o n gt h ef l o r e s c e n c eo ff l o w e r h a sb e c o m eo n eo ft h em a i ns u b j e c t sf o rs t u d ) ，i n gr e c e n t l y I nt h i ss t u d yA C Co x i d a s eg e n e e D N A 厅a g m e n tw a sc l o n e df r o mt h ep e t a l ss e n e s c e n c eo fP e t u n i ah y b r i d a 1 m ，i n t e n dt o c o n s t r u c tA C Co X i d a s eg e n eR N A ie x p r e s s i o nv e c t o ro fP e t u n i ah y b r i d aV i l m ，a n d t r a n s f e r r e dt ot h ep e t u n i ac a l l u s ，t h r o u g ht h et i s s u ec u l t u r er e g e n e r a t i o ns y s t e r n ，o b t a i na c o m p l e t er e g e n e r a t i o n 1 1 1 i sr e s e a r c hh a st a k e nt h ec o t y ! e d o n so fP e t u n i ah y b r i d a 1 m 鹊t h em a t e r i a l A sa r e s u l t ，t h eo p t i m u mm e d i u m so fP e t u n i ah y b r i d a l n lo ft i s s u ec u l t u r eo fe v e r ys t e pa r e s c r e e n e d ，t h ep l a n tr e g e n e r a t i o ns y s t c mo fP e t u n i ah y b r i d aV i l mW a Se s t a b l i s h e di nt h i s r e s e a r c h ；T 1 1 i sr e s e a r c hc h o s et h ep e t a ls e n e s c e n c eo fP e t u n i ah y b r i d aV i l mt 0b et h e m a t e r i a l s ，a n dt h et o t a lR N Ao ft h ef l o w e r sW a Se x t r a c t e d ，t h ec D N Af r a g m e n t so fA C C o x i d a s eg e n e so fP e t u n i ah y b r i d a l mw e r eo b t a i n e db yR T - P C R ，S Ot h a tas o l i d f o u n d a t i o nf o rt h er 懿e a r c ho fg e n et r a n s f e r r i n gC a nb em a d e 1 1 1 em a i nr e s u l t sa l e 鹪 f o l l o w s ： 1 E s t a b l i s h m e n to fr e g e n e r a t i o ns y s t e mo f P e t u n i ah y b r i d a l mo ft i s s u ec u l t u r e ( 1 ) T h es e e do fP e t u n i ah y b r i d a l n ls t e r i l i z a t i o no ft h i ss t u d yW a Sb a s e do n s e c o n d a r yd i s i n f e c t i o nc h e m i c a lr e a g e n t , 7 5 e t h a n o la n d0 1 m e r c u r i cc h l o r i d eu s e di n c o m b i n a t i o n ，t h e s et w or e a g e n t so p t i m u md i s i n f e c t i o ns t e r i l i z a t i o nt i m eW a s3 0 sa n d8 m i n ； ( 2 ) n eo p t i m u mm e d i u mo fc a l l u so c c u r r e n c ea n dp r o l i f e r a t i o no fP e t u n i ah y b r i d a V i h nW a sM S + 1 0m e g t , 6 - B A + O 5m g L N A A ； ( 3 ) T h eo p t i m a lm e d i u mo ft h ec a l l u so fP e t u n i ah y b r i d a l mi n d u c t i o no f a d v e n t i t i o u sb u d so c c u r r e dW a sM S + O 5m e g L6 - B A + 0 2m g LN A A ； ( 4 ) T h eo p t i m u mm e d i u mo fa d v e n t i t i o u sb u dp r o l i f e r a t i o na n dr o o t i n gW a S1 2 M S ； ( 5 ) T h eo p t i m u mm e d i u mf o rt r a n s p l a n t i n gi sp e a t 、j l ，i t l lp e r l i t e ( 1 ：1 ) ，t h es u r v i v a lr a t i o m w a se x t r a c t e d T h e nt h ef i r s t - s t r a n dc D N AW a ss y n t h e s i z e db yR T T h ed o u b l ed e g e n e r a t e p r i m e r sw e r ed e s i g n e db yt h eh o m o l o g o u ss e q u e n c eo ft h eA C C o x i d a s eg e n e s T h r o u g h P C R ，t h ee D N Af r a g m e n t so fA C Co x i d a s eg e n e so fP e t u n i ah y b r i d aV i l mh a db e e n o b t a i n e d B l a s ta tt h eN C B lw e bs i t e ，a sar e s u l t ，t h ef x a g m e n ti sh i g h l yc o n s e r v e d ，a n dt h e A C Co x i d a s eg e n ef a m i l yh o m o l o g yo fP e t u n i ah y b r i d aV i l mo fu pt o10 0 ，t h el o w e s t c o s tf o rm o r et h a n8 0 T h ef r a g m e n to ft h ec o m p l e m e n t a r ys e q u e n c ee n c o d i n g17 3 a m i n oa c i d ，i nt h eN C B lw e b s i t et ob l a s t ，f i n a l l yf o u n dt h a tt h ea m i n oa c i ds e q u e n c ea n d d i s p l a yt h e10 0A C C o x i d a s ea m i n oa c i ds e q u e n c e s ，9 8h a v et h e10 0 h o m o l o g y , o n eh a s 9 9 h o m o l o g y , a n do n eh a s9 1 h o m o l o g y 。 K e y w o r d s ：P e t u n i ah y b r i d aV i l m ；A C CO x i d a s e ；e D N A ；t i s s u ec u l t u r e I V 织培养体系的建立和A C O 基因c D N A 的克隆 缩略词 A C C A C O A C S A m p b p c D N A C T A B D E P C P C R X - g a l I P T G d N 邗 H y g O D R p m R N a s e L B R N A i A O A 划G G A 英文名中文名 6 - B e n z y l a d e n i n e 6 苄基腺嘌嘌呤 1 - N p h t h y l e t i ca c i d萘乙酸 M u r a s h i g eT a n dS k o o gF M S 培养基 n e t i n激动素 Z e a t i n玉米素 3 - i n d o l e - b y t y t i ca c i d 3 一吲哚丁酸 i n d o l y l a c e t i ca c i d吲哚乙酸 ，4 - D i c h o r o p h e n o x y a c e i ca c i d2 ，4 - 二氯苯氧乙酸 1 - a m i n o c y c l o p r o p a n e - 1 一e a r b o x y l a t e 1 - 氨基环丙烷- 1 一羧酸 A C Co x i d a s e 1 氨基环丙烷1 羧酸氧化酶 A C C s y n t h a s e 1 氨基环丙烷1 羧酸合成酶 A m p i n i c l i n氨苄青霉素 B a s ep a i r碱基对 C o m l e r n e i l t a r yD N A互补D N A C e t y l t r i m e t h y l a m m o n i u mB r o m i d e十六烷基三甲基溴化铵 D i e t h y l p y r o c a r o n a t e 焦碳酸二乙酯 P o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n聚合酶链式反应 5 - b r o m o - 1 - c h l o r o 一3 一i n d o l y l D - g a l a c5 一溴一1 - 氯- 3 - 吲哚一D 一半乳糖 t o s i d e 苷 I s o p r o p h y t h i o - p D g l u c u r o n i d a s e 异丙基硫代- p D - 半乳糖苷 D e o x y r i b o n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e脱氧核糖核苷三磷酸 H y g r o m y c i nB潮霉素 O p t i c a ld e n s i t y光密度 R o u I l dp e rm i n u t e 转分钟 R i b o n u c l e a s eR N A 酶 L u r i a - B e r t a n i ( m e d i u m ) L B 培养基 R N A i n t e r f e r i n gR N A 干扰 A m i n o - o x y a c e t i ca c i d氨氧乙酸 A m i n o e t h o x y v i n y l g l y c i n e氨氧乙烯基甘氨酸 G i b b e r e l l i ca c i d赤霉素 V 林业科技大学硕士学位论文 目录 1 I I I 、f 1 1 1 1 矮牵牛1 1 2 乙烯与矮牵牛花器官衰老的关系2 1 2 1 植物中乙烯生物合成途径2 1 2 2 植物中乙烯生物合成调节2 1 2 3 乙烯与植物切花衰老生理3 2A C C 氧化酶基因工程研究进展3 2 1A C C 氧化酶3 2 2A C C 氧化酶基因表达4 2 3A C C 氧化酶基因工程研究进展4 3R N A i 技术的研究5 3 1R N A i 的概念与特点5 3 2R N A i 的作用机制一：。+ 5 3 3R N A i 技术在植物中的应用6 4 矮牵牛组织培养研究进展6 4 1 矮牵牛外植体选取6 4 2 矮牵牛培养基选取7 4 3 培养条件8 4 4 矮牵牛组织培养激素选取及不同激素组合与比例9 4 4 1 矮牵牛组织培养激素选取9 4 4 2 矮牵牛组织培养不同激素组合与比例9 4 5 矮牵牛组培苗移栽1 l 5 本课题研究的目的与意义、主要研究内容和技术路线1 2 5 1 目的与意义1 2 5 2 主要研究内容1 2 5 3 主要技术路线1 3 矮牵牛组织培养体系的建立和A C O 基因c D N A 的克隆 5 3 1 组织培养技术路线1 3 5 3 2 矮牵牛A C O 基因c D N A 克隆技术路线1 4 第1 章矮牵牛组织培养体系的建立：1 5 l 材料与方法1 5 1 1 材料与试剂1 5 1 2 方法1 5 I 2 1 外植体消毒1 5 1 2 2 初代培养1 6 1 2 3 愈伤组织增殖培养1 7 1 2 4 愈伤组织诱导芽的分化1 7 1 2 5 不定芽的增殖培养1 8 1 2 6 不定芽诱导生根1 8 1 2 7 炼苗与移栽。1 9 1 2 8 矮牵牛愈伤组织对潮霉素( H y g ) 浓度的敏感性实验1 9 1 2 9 培养基和培养条件2 0 2 结果与分析2 0 2 1 种子灭菌对发芽的影响2 0 2 2 初代培养愈伤组织的发生2 0 2 3 愈伤组织继代培养- ：j ：2 1 2 4 不定芽的诱导2 1 2 5 不定芽的增殖培养2 3 2 6 不定芽诱导根的分化，2 3 2 7 炼苗与移栽2 3 2 8 矮牵牛愈伤组织对潮霉素浓度( H y g ) 的敏感性实验2 4 3 讨论2 4 3 1 种子灭菌2 4 3 2 植物生长调节剂2 5 3 3 褐化问题2 6 第2 章矮牵牛A G O 氧化酶基因e D N A 片段的克隆2 9 1 材料与方法2 9 1 1 供试材料2 9 1 1 1 植物材料2 9 V I I 士学位论文 1 2 4P C R 产物的克隆3 3 1 2 5 重组质粒的筛选与鉴定3 4 1 2 6 测序与生物信息学分析? 3 5 2 结果与分析3 5 2 1 矮牵牛R N A 的提取3 5 2 1 1 用不同方法提取的总R N A 质量3 5 2 1 2 用不同方法提取的总R N A 纯度和含量3 6 2 2 矮牵牛总R N A 的R T - P C R 及特异性条带的获得3 6 2 3 重组质粒的鉴定一3 7 2 3 1 菌落P C R 鉴定重组质粒3 7 2 3 2 重组质粒双酶切鉴定3 8 2 4 阳性重组质粒测序及同源性分析3 9 3 讨论4 0 3 1 矮牵牛衰老花瓣总R N A 提取方法4 0 3 2 矮牵牛A C C 氧化酶基因保守片段扩增和克隆4 1 结论4 3 l 矮牵牛组织培养再生体系4 3 2 矮牵牛A C C 氧化酶基因c D N A 片段的克隆4 3 2 1 建立了适合矮牵牛衰老花瓣总R N A 提取的改良T r i z o l 试剂法4 3 2 2 矮牵牛A C C 氧化酶基因c D N A 片段的获得4 4 本研究主要创新点4 5 对下一步工作建议4 5 参考文献4 7 附录A 5 7 附录B 5 9 9 9 O 0 O l l 2 2 3 3 3 3 3 ， 6 1 6 3 e D N A 的克隆 矮牵牛( P e t u n i ah y b r i d av i l m ) 另l J 名又叫撞羽朝颜、灵芝牡丹等，茄科，矮牵牛属， 为多年生草本花卉，英文名为c o m m o ng a r d e np e t u n i a 1 1 。通常作一二年生草花栽培。 茎稍直立或匍匐，全身披短毛，上部叶对生，中下部叶互生，叶卵形，全缘，近无柄。 花单生叶腋或枝端，花冠漏斗形，直径5 1 2 c m ，尖端有波状浅裂。花色丰富，花形 多变。按颜色分：有白、粉、红、紫、斑纹等；按花型分：有单瓣，重瓣、瓣缘皱褶 等；按花瓣大小分：有大、中、小三种【2 】。 矮牵牛原产南美洲，由野生种杂交而来，现今世界各地均有栽培。喜温暖、向阳 及通风良好的生长条件，畏寒但可耐一定的暑热，适生于疏松、湿润、排水良好、富 含腐殖质的沙壤土中。在光照充裕，温度适宜等条件下，其可常年开花，并具有抗二 氧化硫，氧化氢等优点。在美国、法国、德国、日本等园林绿化中倍受推崇，一直被 喻为“世界花坛花卉之王 ，有花卉园艺代名词之美誉【3 】。并培育出许多新品种，其 中杂种F 1 代最受欢迎【4 1 。2 0 年前，我国沿海地区分别从美国、日本和荷兰等国大量 引进栽培，现在遍布全国各地，作为花坛新星，市场对矮牵牛需求量日益增加【l 】。 矮牵牛繁殖方式主要有三种：播种，扦插，组织培养繁殖。播种，虽然不受材料 限制，但矮牵牛是一个杂交种，种子极小，通过播种繁殖，发芽率很低，且不易保持 亲本优良性状【5 】。另外，矮牵牛的种子多是从国外进E 1 的杂交种，价格昂贵；扦插又 受材料限制【6 】，组织培养是无性繁殖，通过矮牵牛组织培养，即可以快速繁殖矮牵牛 又可以保持亲本优良性状【引。 矮牵牛是世界著名的切花之一，广泛应用于插花，花束，花篮等，装饰效果很好， 在园林应用中，因其花色品种齐全，色彩丰富亮丽，花型变化颇多常用于各种颜色配 置成花坛，花镜，或分品种种植在草坪、林内和道路两旁等。 矮牵牛市场需求很大，国内外从常规育种、基因工程育种、体细胞育种和单倍体 育种等方面对其展开了深入的研究，并取得了一定的成就【l J 。这为矮牵牛的育种和生 产应用提供了理论与技术基础。 中南林业科技大学硕士学位论文 1 2 乙烯与矮牵牛花器官衰老的关系 乙烯( C 2 H 2 ) 是一种植物气体激素，在植物生长发育过程中，如性别确定、果实成 熟、叶和花的衰老等方面起着重要的调控作用【7 】。因此控制乙烯的生物合成就可以延 缓植物的花、果实及其它器官的衰老或腐烂【8 】。随着植物生理生化及植物基因工程技 术研究的深入，近些年来对乙烯生物合成的相关酶及相关酶基因的研究，特别是A C C 合成酶和A C C 氧化酶反义基因的研究已经取得了一系列令人鼓舞的成果，并成为现 代植物科学研究的热点之一p j 。 1 2 1 植物中乙烯生物合成途径 1 9 6 6 年L i b c m a n 首次在苹果上证实了乙烯的生物合成途径【1 们，2 0 世纪7 0 年代 末，Y a n g 和H o f f m a n 研究发现，在高等植物体内乙烯的生物合成主要是由前提物质 S A M ( S 腺苷甲硫铵酸) 在A C S ( A C C 合成酶) 和A C O ( A C C 氧化酶) 的催化下形成的。 并通过三个反应形成乙烯【l l 】，乙烯合成反应如下所示。乙烯生物合成相关酶有 A C S ( A C C 合成酶) 、A C O ( A C C 氧化酶) 、A C C 脱氨酶和S A M 水解醪1 2 】，其中A C C 合成酶和A C C 氧化酶是乙烯生物合成中的两个主要的限制性酶，乙烯生物合成是由 这两种酶基因的表达所决定的。 1 2 2 植物中乙烯生物合成调节 在植物发育过程中，乙烯的生物合成是严格受到基因调控的。乙烯的生物合成不 仅受到各种发育因子的调控，而且受到环境因子的调。乙烯对自身生物合成也有调节， 即可促进，又可抑制。前者是呼吸跃变型果实和花卉的重要特征。M a y a k 等【1 3 】用乙 烯激活类似物处理香石竹，乙烯产量增加，用乙烯生物抑制剂A V A ，A O A 以及乙烯 作用抑制剂S T S 1 4 1 、N B D 15 1 、P P O H 1 6 】等处理香石竹、满天星、月季、金鱼草等呼吸 跃变型植物切花时，乙烯生物合成减少了【1 7 1 。J a n e 等【1 8 】研究康乃馨时发现机械损伤 2 ，4 D 和L i C l 等可以促进叶中A C S 的转录，诱导乙烯生物合成。根据果实成熟过程 中乙烯生成量的变化，M c M u r c h i e 等【1 9 】首次提出第l 系统乙烯和第2 系统乙烯的概念， 2 矮牵牛组织培养体系的建立和A C O 基因e D N A 的克隆 第1 系统乙烯指具有呼吸跃变的果实在呼吸跃变前产生的乙烯量是很少的，但随着果 实的成熟，通过呼吸跃变逐渐产生大量的乙烯；第2 系统调节伴随着成熟过程中乙烯 自我催化的大量生成。这两个系统都经过A C C 途径【2 0 】。 1 2 3 乙烯与植物切花衰老生理 花器官衰老是一种程序性死亡，外源乙烯只有加速切花衰老的作用，内源乙烯释 放能力的强弱与花的自然寿命密切相关【2 I 】。H a l a v y 2 2 】建议，参照果蔬呼吸跃变与否将 果实分为两种类型，根据切花衰老过程中花瓣乙烯的大量生成与否，将花划分为乙烯 敏感型( 如康乃馨、牵牛、矮牵牛、兰花等) 和乙烯非敏感型( 如菊花、唐营蒲、百合等) 两大类。花器官的衰败都与植物生物合成的乙烯量有关，抑制乙烯的产生和作用可抑 制乙烯敏感型花的衰老【2 3 1 。抑制乙烯生物合成的方法很多，近些年来，随着对乙烯生 物合成的研究的深入，使人们认识到有多种途径，多方位，多方法的控制获抑制乙烯 的生物合成。主要有五种不同的途径 9 1 ：第一种是利用A C C 脱氨酶将A C C 分解成为 a - 酮丁酸和氨；第二种途径是用反义A C S 抑制A C C 产生，或者用正义A C S 通过同 源抑制而抑制内源的A C S 基因的表达；第三种途径是用反义A C O ，抑制A C C 产生， 或者用正义A C S 通过同源抑制而抑制内源的A C O 基因的表达；第四种途径通过S A M 水解酶分解S 朋；第五种途径就是乙烯受体突变体的利用。大多数研究者采用前3 种途径。A n h a n e 等人【2 4 】将A C C 合成酶基因反向导入香石竹，转基因的香石竹比正常 香石竹的观赏寿命延长两倍；O e l l e r t 等【2 5 】1 9 9 1 年成功地将A C S 基因e D N A 反义 系统导入番茄，获得成熟受阻的转基因番茄植株，在A C O 基因方面，H a m i l t o n 等 2 6 1 1 9 9 0 年利用反义R N A 技术抑制转基因番茄果实中A C O 活性，首次获得了减少 乙烯生成的转基因植。A 矿竞争性的结合乙烯受体的作用位点可抑制乙烯产生【2 7 】； 1 - M C P ( 甲基环丙烯) ，是乙烯受体强烈竞争物，可抑制乙烯的作用【1 4 1 1 2 引，1 - M C P 可使 康乃馨货架寿命延长l - 4 倍【2 9 1 。 2A C C 氧化酶基因工程研究进展 2 1A C C 氧化酶 A C C 氧化酶，又称乙烯合成酶( E F E ) ，是乙烯合成途径中的最后一个酶【l l 】。它直 接催化A C C 氧化成乙烯，因为此酶需要抗坏血酸和氧作为辅助底物，而且还需要F e 2 + 和C O 作为辅助因子，因此称为A C C 氧化酶。在乙烯的反应过程中，A C C 氧化酶的 活性是先于A C C 合成酶的活性增强的。 3 中南林业科技大学硕士学位论文 2 2A C C 氧化酶基因表达 A C C 氧化酶是多基因家族，但在不同的植物甚至同一植物不同的组织中A C C 氧化 酶基因却主要一单体形式存在【1 2 1 。另外不同来源的基因及同一来源的基因家族不同成 员在序列上差异较小，尤其编码区高度同源，但3 非翻译区序列有一定程度的不同 【3 0 1 。在矮牵牛植物中，至少有四个A C C 氧化酶基因：在G e n B a n k 中的序号分别为L 2 1 9 7 6 ( A C 0 1 ) 、L 2 1 9 7 7 ( A C 0 2 ) 、L 2 1 9 7 8 ( A C 0 3 ) 、L 2 1 9 7 9 ( A C 0 4 ) 彼此间同源性高【3 1 1 。从甜 瓜【3 2 】、桃3 3 1 、苹梨3 4 1 、哈密瓜【3 5 】等果实中分离至I J A C O 基因。A C C 氧化酶基因表达受 众多因子的诱导，例如乙烯，脱落酸( A a A ) 和生长激素( t A A ) ，其它制剂主要有A C C 、 L i C L 、C H L 、C H X 等【3 6 】。这样的研究报告有许多。例如用乙烯处理拟南芥、蝴蝶兰、 网纹甜瓜、矮牵牛、青花菜等。它们A C c 氧化酶基因就会表达；A B A 贝J J 诱导青花菜 A C C 氧化酶基因的表达【”】。另外，A C C 氧化酶基因的表达具有一定的时空特异性。 金勇丰等研究发现【3 8 】，随着果实成熟度的增加，A C C 氧化酶基因的表达也相应的增 强。 2 3A C C 氧化酶基因工程研究进展 乙烯在植物花、果实等器官的衰老起着十分重要的作用，乙烯生物合成相关酶基 因如A C C 氧化酶基因克隆，使科学家能充分利用植物基因工程技术来减少乙烯的形 成。目前，大多研究者采用反义乙烯生物合成相关酶基因技术抑制乙烯的生物合成， 反义基因技术主要是设计一类能有效抑制某一目的基因表达的反义R N A ( a n t i s e n s e R N A ，a s R N A ) 、反义D N A ( a n t i s e n s e D N A ，a s D N A ) 及核酶( r i b o z y m e ) ， 将它导入细胞中，达到封闭该基因的表达或者造成新的突变表型的技术【3 9 】。H a m i l i t o n 等【删第一次把反义A C C 氧化酶基因转入番茄植株，获得了反义R N A 转化植株。用 反义A C C 氧化酶基因控制花果的成熟和衰老在许多植物上均有尝试，如在番茄【4 l 郴】、 香瓜【4 4 1 、椰梨4 5 1 、三角杨【蛔与康乃馨4 刀等植物均有应用，并取得了较为满意的效果。 熊爱生等【4 8 】利用T i 质粒介导反义A C S 和A C O 基因控制果实成熟，在转基因番茄中 反义A C S 或A C O 转录会与正义A C S 或A C O 转录配对结合并使正义A C S 或A C O 转录本失活，减少了正义A C S 或A C O 基因的表达，从而植物乙烯生物合成量相应的 也减少了，达到延长番茄储藏期的目的。另外，转反义A C O 基因以减少乙烯生物合 成量的方法也应用于延缓花卉衰老。进而减少采后损失，如康乃馨、矮牵牛、牡丹等 花卉，并取得成功。此外，反义A C O 基因在植物细胞内表达，除能抑制果实的成熟、 叶片和花瓣的衰老与脱落外，还能提高植物的抗逆性【3 7 1 ，C o o p e r 等发现转反义A C O 4 矮牵牛组织培养体系的建立和A C O 基因c D N A 的克隆 基因番茄的果实具有明显的抗病菌感染能力( 为对照植株的2 5 倍) 【4 9 】，M a 和S o n g 将 番茄的反义A C S 基因转入到烟草中，不仅成功的抑制了烟草体内乙烯的生物合成， 而且明显提高了烟草的组培过程中的芽再生能力【划。 近些年来，利用反义A C O 基因技术抑制乙烯生物合成已在多种植物中取得了很 大的成功。目前研究结果表明，通过抑制乙烯生物合成过程中相关酶基因的表达可以 减少内源性乙烯的合成量，进而达到果实保鲜，延缓花器官的衰老，延长花期的目的。 3R N Ai 技术的研究 3 1R N Ai 的概念与特点 I L N A 干涉( R N Ai n t e r f e r e n c e ，R N A i ) 是近年来发展起来的新技术，自从1 9 9 8 年 F i r e 等首次在线虫中发现并阐明以来【5 ，R N A i 已经在其它动物、植物和真菌中被证 樊5 2 。5 4 】，目前已成为分子生物学研究中最活跃的热点之一。R N A i 是指通过反义R N A 与正链R N A 形成双链R N A 特异性地抑制靶基因的现象，它通过人为地引入与内源 靶基因具有相同序列的双链R N A ( 有义R N A 和反义R N A ) ，从而诱导内源靶基因的 m R N A 降解，达到阻止基因表达的目的。R N A i 具有如下特点：高效性【5 5 。5 6 1 、需要 A T P 5 3 l 、特异性【5 5 】【5 7 巧扪、位置效应【5 6 1 、竞争效应【5 6 1 、可传播性【5 9 】。 3 2R N Ai 的作用机制 通过生化和遗传学研究，R N A d 的作用机制目前已有两种实验模式来解释，一种 为随机降解P C R 模式( R a n d o mD e g r a d a t i v eP C R ) ，另一种为核酸内切酶的切割模式 ( E n d on u c l e o l y t i cc l e a v a g e ) 随机降解P C R 模式是以s i R N A 作为引物，锚定于靶m R N A 上，通过R N A 依赖的R N A 多聚酶( R N A - d e p e n d e n tR N A p o l y m e r a s e ，R d R p ) 作用，从 而产生一个c R N A 与靶m R N A 杂合的双链R N A 。这样一个c R N A 靶m R N A 的杂合 体被D i c e r 酶降解，导致m R N A 的降解，同时又产生新的s i R N A 。这样一个过程必 须有R d R p 和D i c e r 酶的严格参与【删。核酸内切酶切割模式则认为：内源或外源的双 链R N A ( d o u b l es t r a n dI A ) ，d s R N A 导入细胞时，能够被R N 鹤e I I I 家族中一个能特 异识别d s R N A 的D i c e r 酶所识别，并以一种A T P 依赖的方式逐步切割成2 1 - - , 2 3 n t 的 小分子干扰R N A 片段( s m a l li n t e r f e r i n gR N A s ，s i R N A ) ；然后s i R N A 结合一个核酶复 合物形成R N A 诱导沉默复合物( R N A i n d u c e ds i l e n c i n gc o m p l e x ，m s c ) ，结合s i R N A 的R I S C 可以被A T P 活化，将s i