芜菁胚发育相关基因BcNAC2的功能分析-硕士论文

分类号：盟 胁夕Z 掌 硕士学位论文 单位代码：量垒三丝 学号：2 壁墨! 墨Q 鱼窆 _ ! 芜菁胚发育相关基因男卸阴凹的功能分析 F u n c t i o na n a l y s i so fe m b r y o g e n e s i sr e l a t e dg e n e 占删( 2i nt u r n i p 名 教师 专业 方向 学院 交日期 中国杭州 导科究在媲 姓指学研所论 分类号： U D C ： S 6 3单位代码： 研究生学号： J | I J | I | | | I I | l I f I l I | i f f | I l | i I I | l I I I l | Y 18 5 3 6 3 4 1 0 3 3 9 2 0 8 l 6 0 4 9 芜菁胚发育相关基因B 删a 的功能分析 论文作者签名： 1 一 J 1n1 量。U n C t l o na n a I V S l S0 te m D r V 0 9 e n e S l S r e l a t e d g e n eB c 八一C 2i nt u r n i p A u t h o r ss i g n a t u r e ： ，、 o o S U p e r V l S 0 r7 SS l g n a t U r e ： E x t e m a l I 沁V i e w e r s ：里! Q 鱼墨墨Q ! 圣塾Q 塾gX i ! ! m i 旦( 圣h 自i 垒望g 殳垒亟星! 卫YQ f 笪! g ! i 鱼堕! 鱼竖垒! S 殳i 曼堕Q 曼墨1 ! Q 鱼曼墨Q ! h 曼nL i p i 坠g 【圣h 星j 垂匹g ! 也i 曼! 墨i 垃) E x a m i n i n gC o m m i t t e eC h a i 印e r s o n ： 里! Q 鱼墨墨Q ! 圣h 丛圣! 画! 坐( 圣h 自i 垫gg ! i 堡坠! 墼丛星i 堕亟 Q 堡墨! ! & 堕垒i Y 曼堕i 鲤 E x a m i n i n gC o m m i t t e eM e m b e r s ： ! Q 鱼墨墨Q !g 堕i 垒墨h 坠( 兰h 自i 垦坠g ! 也i Y 星! 墨i 鲤) ! Q 鱼墨墨Q ! L 坠i 垦坠g ( 圣h 自i 堑g ! 地i y 星! 曼i 垃】 墨墨Q 鱼i 塾星里! Q 鱼竖Q ! 堑墨丕i 箜! i 里( 圣h 自i 垫g 型坠i Y 曼曼i 垃) D a t eo f0 r a ld e f e n s e ：2 01 1 3 8 本学位论文受 国家自然科学基金项目 “芜菁雌蕊发育过程中相关基因的分离、功能分析及其验证” ( 项目批准号3 0 7 7 13 7 7 ) 资助 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或 撰写过的研究成果，也不包含为获得逝望盘堂或其他教育机构的学位或证书而 使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：签字日期：年月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解逝姿太堂有权保留并向国家有关部门或机构 送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权堑望盘堂可以 将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：导师签名： 签字日期：年 月日签字日期：年月日 致谢 行文至此，我的硕士论文已接近尾声；岁月如梭，我的研究生生涯也即将敲响结束的 钟声离另I j 在即，站在人生的又一个转折点上，心中难免思绪万千，一种感恩之情油然而 生，尽管依依不舍，却很珍惜，因为在我的生命中有那么多可亲可敬可爱的人值得感激。 值此论文完成之际，谨把深深的谢意献给老师和兄弟姐妹们，愿你们工作顺利，笑口常开! 首先，我要感谢我敬爱的导师一一余小林副教授。从本论文的论文选题、实验设计、 实验操作以及论文写作、论文校对等环节上，无不凝聚着导师的聪明智慧和辛勤汗水。虽 然我不是您最出色的学生，而您却是我最尊敬的老师。您治学严谨，学识渊博，思想深邃， 视野雄阔，为我营造了一种良好的精神氛围。授人以鱼不如授人以渔，置身其问，耳濡目 染，潜移默化，使我不仅接受了全新的思想观念，树立了宏伟的学术目标，领会了基本的 思考方式，经由您悉心的点拨，再经思考后的领悟，常常让我有“山重水复疑无路，柳暗 花日月又一村”的感觉。没有余老师的帮助也就没有今天的这篇论文。在这两年半的研究生 生涯中，很幸运得到老师的抬爱，师恩如父，永刻于心。难忘老师的平易近人的工作作风 和对科学执着的追求；难忘老师给予国家自然科学基金项目研究的机会，难忘老师坚强的 性格与不屈的意志。作为我的导师，感谢您对我学习上的严厉与教诲；作为我的长辈，感 谢您给予我父亲般的关怀；作为我的朋友，感谢您对我知心好友般的促膝而谈以及耐心地 倾听我的心声此刻，似乎无法用言语来形容我的感激之情，惟愿师生情谊一生延续。祝 愿老师及家人健康快乐，永远幸福! 其次，感谢实验室曹家树教授，卢钢教授，向殉老师，黄鹂老师、张爱红博士，蒋晶 晶博士、李怡斐博士、程琳博士、刘金龙博士、郁有健博士、刘松瑜博士、刘颖、卢海字、 林苏娥、邱琳、江建霞、吴健、孔福苓、彭真、胡帅、王芳展、董衡、马俊平、王洁、 朱翔飞、梁颖、刘振宁、刘亚培等师兄弟师姐妹们，不仅在学习和工作过程中给予我真 诚的帮助，而且在生活中也给我鼓励给我关怀，让我有了家庭般的温暖。在此，向所有关 心、帮助、支持过的老师、同学和朋友表示衷心的感谢。感谢同届的好朋友陈起震、张志 仙、孙溶溶、王飞燕、昊剑锋，正是因为你们的陪伴，在一起开心玩闹，互相倾听，规划 未来，从此我的生活变得多姿多彩，愿我们的友谊地久天长；感谢和我朝夕相处，同寝室 的叶小敏、周剑和徐蝉，能与你们共处一室也是缘分，谢谢你们在学习上对我的帮助，还 有生活上对我的关心，我们相知相惜，毕业也不会使得我们因为分隔两地而显得那么的遥 远；感谢我的大学好友张鑫、赵善芹、王福敏，在我心情低落的时候，是你们鼓励我关心 我，让我重拾信心。为了理想和爱情，我们每个人做出了不同的抉择，祝福我们每个人都 能快乐，今后相聚，我们再干杯! 再次，我要把深深的谢意献给我的父母及其家人，感谢你们竭尽所能地为我提供良好 的学习环境，给予了我健康的体魄，诚朴正直的品质，这些都是我受益终身的财富。感谢 你们的厚爱和呵护、理解和鼓励，让我有了前行的动力。没有你们的支持，就没有今天的 我。谢谢你们，我亲爱的爸爸妈妈! 感谢我的男朋友朱广鑫，在我读研期间给予我的鼓励 和支持，让我信心十足的走完了研究生生涯。 最后再一次感谢所有在毕业设计中曾经帮助过我的良师益友和同学，以及在设计中被 我引用或参考的论著的作者。 c t 路漫漫其修远兮，吾将上下而求索”，这句屈原在离骚中的名句，一直是我 的座右铭。本文的完成既为我硕士研究生学习画上了圆满的句号，又是新的人生历程的开 始。漫漫前途，我将脚踏实地，上下求索，尽自己最大的努力作出应有的贡献和成就，不 辜负大家的厚望! 愿把我的幸福和快乐都送给关心和支持过我的人，也愿他们一切如意。 张海娟 2 0 1 1 年3 月8 日 杭州华家池 目录 缩写诃( A b b r e v i a t i o n ) I 氨基酸简写符号( A m i n 0a c i da b b r e v i a t i o n ) I I l 摘要I V A b s t r a c t V 1 0 弓 言1 l 文献综述3 1 I 植物雌蕊发育的分子遗传研究进展3 1 1 1 雌配子体的发育4 1 1 大孢子囊及大孢子的发生：4 1 1 1 2 雌配子体的形成5 1 1 2 植物雌蕊发育分子遗传机制的研究。5 1 1 2 1 花器官发育的A B C D E 模型5 I 1 2 2 心皮的个体发生学说5 1 1 3 与植物雌蕊发育相关的基因6 1 1 3 1 W ( 卫一6 1 1 3 2K i 口6 1 1 3 3 Z J S 6 1 1 3 4C L 4 么? ：6 1 1 3 5 z G D “。：一7 1 1 3 6 ( 盈C 。：7 1 1 3 7 朋2 口7 1 1 4 植物雌蕊发生的基因网络7 1 2 植物胚珠发育8 1 2 1 胚珠的发育9 1 2 2 胚珠特征基因1 0 1 2 3 珠被发育相关基因1 2 1 2 4 胚囊发育相关基因1 2 1 2 5 胚珠发育模式1 3 1 3N A C 转录因子的研究进展1 3 1 3 1 与植物生长及发育相关的 阴C 1 3 1 3 1 1 参与顶端分生组织发生及花器官发育1 3 1 3 1 2 参与植物器官的衰老1 4 ：_ 2 1 1 实验材料与主要试剂。18 2 1 2 植物基因组D N A 的提取1 8 2 1 3 植物总R N A 的提取1 9 2 1 3 1 植物总附、A 的提取1 9 2 1 3 2 总R N A 的检测2 0 2 1 ：4c D N A 的合成2 0 2 1 4 1 采用C l o n e t e c h 公司试剂盒方法合成c D N A 2 0 2 1 4 2 采用T a K 水a 试剂盒的方法合成c D N A 一链2 2 2 1 5 大肠杆菌感受态细胞的制备2 2 。 2 1 5 1 大肠杆菌D H5 a 感受态细胞的制备。2 2 2 1 5 2 大肠杆菌1 G l 感受态细胞的制备。一2 3 2 1 6L B 培养基的配制2 3 2 1 7c D N A 和D N A 测序2 3 2 1 8B c N A C 2 基因c D N A 序列全长的扩增2 5 2 1 8 1c D N A 编码区的获得一2 5 2 1 8 2c D N A 非编码区的获得2 5 2 1 9B c N A C 2 基因D N A 序列全长的扩增2 6 2 1 1 0 芜菁删c 2 全长序列的特征分析2 9 2 1 1 1 芜菁B c N A C 2 蛋白结构域与拟南芥N A C 2 蛋白结构域的比较2 9 2 2 结果与分析2 9 2 2 1 总R N A 的提取与c D N A 的合成2 9 2 2 2删C 2c D N A 全长的获得2 9 2 2 3 删C 2D N A 全长的获得3 3 2 2 4删C 2 核苷酸序列分析。3 3 2 2 5 N A C 基因同源比对及进化树分析4 2 2 2 6B c N A C 2 与A l N A C 2 结构域的比较4 2 2 3 讨论4 5 2 3 1 芜菁删c 2 全长序列的结构特征分析4 5 2 3 2 芜菁删C 2 的功能预测4 5 3 芜菁删C 2 基因的表达分析4 7 3 1 材料与方法4 8 3 1 1 半定量R 1 - P C R 分析的实验材料与方法4 8 3 1 1 1 半定量阡P C R 的实验材料4 8 3 1 - 1 2 半定量R T P C R 的引物设计。4 8 3 1 1 3 半定量熙P c R 的体系及程序。4 8 3 1 2 组织原位杂交分析的实验材料与方法4 8 3 1 2 1 实验材料o 4 8 3 1 2 2 试剂及溶液配制4 9 3 1 2 3 材料固定、包埋和制片5 0 3 1 2 4 地高辛标记刚A 探针5 2 3 1 2 5 原位杂交步骤5 2 3 2 结果与分析5 3 3 2 1R T - P C R 分析5 3 3 2 2 组织原位杂交分析：5 3 3 3 讨论：5 4 3 3 1R T - P C R 分析& 纠凹在胚或种子发育中起作用。5 4 3 3 2 组织原位杂交分析删c 2 在胚珠发育过程中起作用5 4 4 芜菁曰o A “口的反义载体构建及对菜心的遗传转化5 6 4 1 芜菁B e 翻c 2 的反义载体构建5 6 4 1 1 材料。5 6 4 1 2 反义片段的获得5 6 4 1 3 质粒的提取5 8 4 1 4 芜菁鼬 阴c 2 反义表达载体的构建。6 0 4 1 4 1 反义片段及p B I l 2 l 的制备6 0 4 1 A 2 表达质粒的构建。5 9 4 1 5 农杆菌感受态的制备及转化。5 9 4 1 5 1 农杆菌感受态的制备5 9 4 1 5 2 冻融法转化农杆菌6 0 4 I 5 3 农杆菌中质粒鉴定6 0 4 2 反义表达载体对菜心的遗传转化6 0 4 2 1 构建载体用菜心作为材料的依据6 0 4 2 2 植物材料、菌株及抗生素6 l 4 2 3 菜心的遗传转化体系：6 l 4 2 4 反义表达载体对菜心的遗传转化步骤6 2 4 2 5 菜心转删C 2 反义基因芽系的分子检测6 4 4 2 5 1 菜心转删C r 2 反义基因芽系基因组D N A 的提取6 4 4 2 5 2 菜心转删C 2 反义基因芽系的P C R 检测6 4 4 3 结果与分析6 4 4 3 1 芜菁B c M 4 c 2 基因反义片段的获得6 4 4 3 2 反义表达载体的构建6 5 4 3 3 反义表达载体农杆菌中质粒的鉴定6 7 4 3 4 菜心可以取代芜菁进行遗传转化6 8 4 3 5 菜心转删c 2 反义基因芽系的获得7 0 4 3 6 菜心转B t 阴C 2 反义基因芽系的分子检测7 0 4 4 讨论j 。7 0 4 4 1 反义技术在基因功能研究中的高效性7 0 4 4 2 & m 4 口反义转化抗性芽的分子检测7 1 结论：。7 2 参考文献- j 7 3 攻读硕士学位期间发表的文章。8l 浙江大学硕士学位论文芜菩胚发育相关基因B c 伪C 2 的功能分析 缩写词( A b b r e v i a t i o n ) A A m p b p B A P B L A S T B S A C a d e n i 】1 e A m p i c i l i n b a S ep a i r b e n z y l 锄i n op 且l r i n e b a s i c1 0 c a la l i 印m e n ts e a r c ht 0 0 l b o v i n es e n 肛na l b u m i I l c y t o s i n e 腺嘌呤 氨苄青霉素 碱基对 苄氨基呤 基因局部连配搜索工具 牛血清蛋白 胞嘧啶 C a M V 3 5 Sc a u l 讯o w e rm o s a i cv i m s3 5 S 花椰菜花叶病毒3 5 S 启动子 c D N A d D E P C D N A d N T P d s R N A E B E D T A G G A G U S h J A K a n K b c o m p l e m e n t a 够d e o x ) r r i b o m l c l e i ca c i d 互补脱氧核糖核酸 d a y 天 d i e t h y rp y r o c a r b o n a t e 焦磷酸二乙酯 d e o x 如b o m 聆1 e i ca c i d d e o x y r i b o n u c l e o s i d et r i p o s p h a t e 。 d o u b l e s t r a I l dR N A e t I l i d u mb r o m i d e 脱氧核糖核酸 脱氧核糖核苷三磷酸 双链R N A 溴化乙锭 e t h y l e n ed i 锄i n e t e 仃a a c c e t i ca c i d 乙二胺四乙酸 g u a n i n e g i b b e r e l l i n p - g l u c u r o l l i d a s e h o u r j a s m a o n i ca C i d k a n 锄y c i n k i l o b a s e 鸟嘌呤 赤霉素 p - 葡萄糖醛酸酶 小时 茉莉酸 卡那霉素 千碱基对 L Bl u r i a - B e r t a I l im e d i 啪 L B 培养基 一。一 ； 。 N B T 4 N i 仃ob l u et e t r a z o l i 岫c h l o r i d e 氮蓝I 四唑 O I 理 P B S P C R p o l y A R A C E r R N A I U - P C R R i f S S D S S t r T T A E B E T D F T r i s t R N A o p e nr e a d i n g 丘锄e p h o s p h a t eb u 船rs o l u t i o n 开放阅读框 磷酸盐酸缓冲液 p o l y m e r a S ec h a i l lr e a c t i o n 聚合酶链式反应 p o l y a d e n y l a t e ， 多聚腺苷酸 r a p i d 锄p l i f i c a t i o no fc D N A e n d sc D N A 末端快速扩增 r i b o s o m a lR N A r e v e r s e 咖s c 邱t a S eP C R r i 胁l p i c i n s e c o 矗d s o d i 啪d o d e c y ls u l f a t e s t r e p t o m y c m t h y n l i n e T r i s H C I ，A c e t i ea c i d ，E D T Ab u 髓r 1 s H C I ，B r o i ea c i d ，E D T Ab u 丘e r t r a n s c r i p t - d e r i V e d 丘a g m e n t 核糖体R N A 反转录聚合酶链式反应 利福平 秒 十二烷基磺酸钠 链霉素 胸腺嘧啶 T r i s H C I ，乙酸，E D l I A 缓冲液 T r i s H C I ，硼酸，E D l A 缓冲液 转录片段 T r i s ( h y d r o x y m h y l ) 锄i n o m e m a n e 三( 羟甲基) 氨基甲烷 t r a n s f e rR N A 转运R N A I I 浙江大学硕：b 学位论文芜菁胚发育相关基因B c 堵C 2 的功能分析 氨基酸简写符号( A m i n oa c i da b b r e v i a t i o n ) 单字母符号三字母符号 英文中文 o n e s y m b o l a I p h a b e t t h r e e s y m b o l a l p h a b e t +E n g U s h C h i n e A A l aa l a n i n e 丙氨酸 R N A I ：g A s n a 唱1 n m e 雒p a r a g m e 精氨酸 天冬氨酰胺 摘要 摘要 花的发育是植物发育过程中最引人注目的事件，花芽的形成意味生殖生长的开始( 卢海宇等， 2 0 0 9 ) 。C o e n 和M e y e r o w i t z ( 1 9 9 1 ) 提出了花器官发育的A B C 模型，这是植物发育分子生物学研究领 域里程碑式的重大突破，也为人们打开了一扇通向花器官多样性研究的大门。在芸薹属作物中，雄性 不育现象普遍存在，并且应用芸薹属作物的雄性不育性，利用杂种优势，提高产量，但雌性不育现象 在芸薹属作物中却鲜有报道。本研究以芜菁( B 删妇c 口聍妒甜f ，妇L s s p ，印咖，口( M 如猖) s i n s k ，s y n B 心阳L ) 雌蕊退化突变体宝尬( f z 删勿p 括川口6 D r 砌，z ) 及其野生型( 可育株) 雌蕊和胚发育转录组分析中 发现的基因删C 2 为研究对象，通过P C R 扩增方法对芜菁眈 M C 2 的c D N A 全长和D N A 全长进行 了分离、鉴定及蛋白质结构和功能的预测；从N C B I 上搜索到相关的N A C 蛋白进行同源比对，在此基 础上构建分子进化树；采用半定量R T P C R ( R e v e r S et r a J l s c r i p t a s ep o l y m e r 鹊ec h a i nr e a c t i o n ) 技术分析该 基因在芜菁不同发育阶段的营养组织与生殖组织中的表达状况；通过组织原位杂交的方法检测授粉受 精后该基因的表达部位；构建了芜菁反义B 删c 2 的植物表达载体，用中国白菜的变种菜心( 口删s 纪口 c 册z p 嚣f ，括L s s p 如加P 瑚括v 缸“打凰T S e ne tL e e ) 为材料进行遗传转化，通过遗传转化获得转基因植株， 从分子生物学方面对转基因植株进行检测和分析。研究结果如下： ( 1 ) 在已有的c D N A A F L P 差异片段的基础上，采用同源序列克隆技术获得与雌蕊发育相关的芜 菁N A C 转录因子8 c 阴c 2 的c D N A 和D N A 序列全长。序列分析表明，删C 2 的c D N A 序列全 长为2 0 8 0b p ，最大O R F 框为1 6 8 3b p ，编码5 6 0 个氨基酸序列。其D N A 序列全长中包含6 个外显予 和5 个内含子，外显子内含子交接处序列遵循G T - A G 的普遍规律，属于的剪接体识别序列。其中内 含子的长度依次为6 7b p 、1 0 2b p 、2 6 9b p 、8 1b p 和8 3b p 。对推导的氨基酸序列分析发现，该序列第 9 1 5 9 个氨基酸编码N A C 结构域。利用s M A R T 数据库进一步分析发现，其为N A M 亚家族蛋白。B c M C 2 的二级结构包含1 9 “的洳螺旋，1 5 o o 的B 折叠和6 5 3 6 的无规则卷曲结构，三级结构呈马鞍形。 此外，与拟南芥的N A C 2 蛋白的功能结构域中的m o t i f 进行比较发现，芜菁B c N A C 2 与拟南芥A t N A C 2 功能结构域内的特征序列有显著的差异，主要区别在磷酸化位点上。在芜菁B c N A c 2 蛋白的N A c 结 构域内，发现有2 个N 糖基化位点( 7 9 8 2 ，1 0 3 一1 0 6 氨基酸) ，4 个蛋白激酶C 磷酸化位点( 8 3 8 5 ， 8 7 8 9 ，9 5 9 7 ，l l o 1 1 2 氨基酸) ，5 个酪蛋白激酶I I 磷酸化位点( 1 8 2 1 ，4 2 4 5 ，7 l 7 4 ，9 5 9 8 ，1 3 7 1 4 0 氨基酸) ，2 个N 酰基化位点( 8 0 8 5 ，1 0 9 1 1 4 氨基酸) 。而在拟南芥N A c 2 蛋白的结构域中共发现 有2 个N 糖基化位点( 5 7 “O 。7 9 8 2 氨基酸) ，1 个环腺苷酸和鸟苷酸依赖的蛋白磷酸化激酶( 5 3 5 6 氨基酸) ，3 个蛋白激酶C 磷酸化位点( 4 2 4 4 ，6 l “3 ，7 2 7 4 氨基酸) ，3 个酪蛋白激酶I I 磷酸化位点 ( 3 0 3 3 ，3 7 4 0 ，7 2 7 5 氨基酸) ，2 个酪氨酸激酶磷酸化位点( 1 l 1 7 ，1 1 1 8 氨基酸) ，3 个N - 酰基化 位点( ，5 8 6 3 ，8 5 9 0 氨基酸) 。由此可知，芜菁B c N A C 2 蛋白和拟南芥N A C 2 蛋白结构域内的特 征序列差异较为明显，序列的差异是否会导致基因功能的不同，还需要后续进一步的研究。 ( 2 ) 从N C B I 上搜索下载相关的3 0 个N A C 蛋白与芜菁B c N A C 2 进行同源比对，构建了分子进化 I V 浙江大学硕二E 学位论文芫菁胚发育相关基因凰 “C 2 的功能分析 树。结果表明，B c N A C 2 与拟南芥的A t N A C 2 、烟草的T E R N 和大豆的G m N A C 6 的亲缘关系较近，可 以归为一类，均属于N A M 距家族。其中B c N A C 2 与A 小f A C 2 的亲缘关系更近，说明同科植物的亲缘 关系较近。通过对N A M 亚家族的蛋白进行序列比对发现，在N 端的N A c 保守结构域处相似性较高， 而在c 端序列呈现多样性，同源性较低，表明不同的N A C 转录因子可能通过不同的C 端序列调控转 录活性，符合N A C 转录因子的结构特点。 ( 3 ) 采用半定量胙P C R 分析和组织原位杂交等两种方法分析删c ? 的表达特性。半定量R P C R 分析了芜菁8 孙阴C 2 在芜菁不同发育阶段中的表达动态，发现该基因有组成型表达特点，其中在小蕾、 中蕾中的表达量较高，而在授粉受精后的嫩角果中，授粉后8 天的嫩角果表达量最高。该基因不仅在前 期营养器官中能正常表达，而且在后期的种子或胚的形成过程中也有较高丰度的表达，暗示该基因在 植物整个生长发育过程中都可能发挥着重要的作用。组织原位杂交分析结果表明，删a 在授粉后4 天胚珠的胚囊部位有较高的表达，而授粉8 天的胚珠内部也有较高丰度的表达，上述结果与半定量的分 析结果基本一致，由此推测，鼢M c 2 参与了种子或胚的发育形成过程。 ( 4 ) 在正确分离反义删C 2 片段的基础上，构建了含有组成型启动子C 口 ，船的反义R N A 植 物表达载体p B l 3 5 s 目纠谢C 2 。并通过“冻融法将其导入农杆菌，根据已建立的高效菜心遗传转化体系， 利用农杆菌介导的方法将反义删C 2 表达载体导入菜心中，目前已成功获得了6 株K a n R 芽系，正对 其可能的生物学功能进行进一步的研究。 关键词：芜菁；N A C 转录因子；基因；同源克隆；序列分析；半定量R T - P C R ：组织原位杂交；反义 R N A 表达载体；遗传转化 二 V A b s 仃a c t A b s t r a c t F l o w e r Sd e V e l o p m e n ti so n eo ft h em o S ta t m l c t i V ee V e n t sd u r i n gt h ep l 锄td e V e l o p m e n t a lp r o c e s s ，a n d b u df o 册a t i o nm e a n st h eb e 舀n n i n go fr e p m d u c t i v eg r o w t h ( L uH a i Y u 甜以，2 0 0 9 ) I nl9 9 1 ，f l o r a o 唱醐 d e V e l o p m e n to fA B Cm o d e lh 嬲b e e np r o p o s e db yC o e n 锄dM e y e r o w 眩、v h i c hw 硒ab r e a k t h r o u 曲o fp l a n t d e V e l 叩m e n tb i o I o g ya n dw h i c h u I de x p J a i nt h ei d e n t i 够o ft h e 仍u rw h o r I so ft t l et y p i c a Ie u d i c o tf I o w e r I n 局铘s 记口c r o p s ，m a l es t e r i l i 妙p h e n o m e n o no c c u r sg e n e r a l I y ，锄da v a i l a b l eh e t e r o s i st oi n c r e 瓠et h e i ry i e l da n d q u a l 时b y 印p l i c a t i o no f m a l eS t e r i l i 够T h ef e m a l es t e r i l 时p h e n o m 朗0 n ，h o w e v e r ，h 弱h a r d l yb e e nr e p o n e di n Z ，傩s 配口I nt h i sS t u d y an 0 V e lp r e f 色r e n t i a l l ye 珥M e s s e dc D N As e q u e n c e ，h 鹪b e e ni s o l a t e da n dc h a r a c t e r i z e d f 如mt u m i p ( 胁f ( 口c 口w ，卯伊函L s s p 脚归，口( M 她) S i l l s k ，s y n 召印口L ) T h ef u l l - l e n g t hc D N Aa n d g e n o m eD Mw 笛s u b s e q u e n t l y 锄p J i f i e db yh 鲫o l o g y b a S e dc 1 0 n i n gm e t h o d ，n 锄e d 眈M 口M o r e o V e r ， t h eg e n es e q u e n c ew 嬲锄a l y z e d 绷dp r o t e i n 如n c t i o n sw e r ep r e d i c t e d B yu s i n gN C B Id a t a b a s e ，w e d o w n l o a d e d3 0N A Cs e q u e n c e so fp l a n t s ，s u b s e q u e n t I y t h eh o m o I o g ya I l a l y s i sw a Sp e 响m e da n dt h e p h y l o g e n e t i c 吮ew a Sc o n s t m c t e d I na d d i t i o n ，t h ee x p r e s s i o np a 仳e mo f 删C 2w 笛加a I y z e db yR T - P C R ( R e V e r s et r a n s c r i p t a S ep o l y m e r 够ec h a i nr e a c t i o n ) d u r i n gt h ed i f f e r e n ts t a g e so fp l a n td e V e l o p m e n t T h e e x p r e s s i o no f 且：M C 2a f k rf e r t i l i 捌i o np r o c e s sw a Sd e S c r i b e db y 伽s f mh y b r i d i z a t i o nm e t h o d I nt h i sp a p e r ， f i r s t l y a n t i s e n S eR N Ae x p r e s s i o nV e c t o rw 船c o n s t m c t e d ；s e c o n d l y 西饥站记dc 埘印P s 护括L s s p 幽加P ，坫括v a r p 口，口c 加P 瑚西( B a i l 9 y ) T e ne tL e ew 嬲呦s f o r m e db y 鲳阳b a c t e r i u m m e d i a t e dm e t h o dt oo b t a i nt h e i r l o s s o f 二如n c t i o nm u t a n t L 鹊t l y t h e i rf u n c t i o ni np i s t i ld e V e l o p m e n tp r o c e s sw 嬲a n a l y z e d T h em 萄o rs t u d y r e s u I t sa Sf o l l o w s ： ( 1 ) B a S e d - o nt h ec D N A - A F L Pd i 虢r e n t i a lf r a g I l l e 鹏，t h ec D N As e q u e n c eo f 丑c M C 2h 弱b e e ni S 0 l a t e d b yh o m o l o g y b 2 L s e dc l o n i n gm e t h o d S u b s e q u e n t l y ，g e n o m e i cD N As e q u e n c ew a sa l s oo b t a j n e d S e q u e n c e 卸a l y s i sr e s u I ti n d i c a t e dt h a tt h em l l l e n 酉ho fB c 似C 2w a s2 0 8 0b pa 1 1 dt h el a 唱e s to p e nr e a d i n gf r a m e ( O R F ) w a sc o m p o s e do fl6 8 3b pw i t had e d u c e d5 6 0 锄i n oa c i d s ，w h i c hc o m p o s e do fs i xe x t r o n sa n df i V ei n t r o n so f 6 7b p ，10 2b p ，2 6 9b p ，8lb pa n d8 3b p ，a n dt h e “G T - A G ”s p l i c i n gm l eo fB c M c 2a tt h ee x o n i n t r o n b o u n d a r i e s S e q u e n c e 锄a l y s i sr e s u l t Sr e V e a lt h a tB c - 啊( 2b e l o n g st 0N A Cg e n eb e c a u s eo n eN A Cd o m a i n h 签b e e np r e d i c a e di nt h e9 m 15 9 m 锄1 i n oa c i d so fd e d u c e d 删C 2p r o t e i n M o r e o V e r i ti saN A M p r o t e i n b yS M A R Td a t e b a S e T I l es e c o n d a r ys 仃u c t u r eo f M c 2p r o t e i nc o n 诅i n e dm a i n l y1 9 6 4 a - h e l i x ，15 o o p - s h e e ta n d6 5 3 6 c o i la n das a d d l e - s h a p e dw a St h et t l i r ds t m c t u r e M o r e o V e r c o m p a r e dw i t hf u n c t i o n d o m a i n so fN A C 2p r