小麦根系中4个水分胁迫诱导基因的克隆及功能分析-硕士论文

分类号 河南农业大学硕士学位论文 密级 英文题目：! Q 旦i 里g 塑鱼坠坠血Q 塾垒! 丛鱼! Y 出Q 亘Q 竖盥坐! S 照竖 日 I n d u c e dG e n e si nW h e a tR o o t s 论文提交 日 学位授予 导专 l U lI I II I II ItI I II III II Y 17 2 8 7 9 8 河南农业大学学位论文独创性声明、使用授权及知识产权归属承诺书 学位论小麦根系中4 个水分胁迫诱导基因的克 学位 硕士 文题目隆及功能分析级别 学生学科导师 姓名 陈雷作物遗传育种李永春 专业姓名 学位论文 是否保密雹 如需保密，解密时间年月日 独创性声明 本人呈交的论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特 别加以标注和致谢的地方外，文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不 包括为获得河南农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，指导教师对 此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确 的说明，并表示了谢意。 研究生繇话智翩虢掀 日期：弘l 。年5 月f 6 日 日期：州笋月“日 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 妊7 2 ； 、一带埴导签糊 日期浏。年月形日日期：一年石月必日 日期：秽解钼凋 致谢 本论文是在导师李永春副教授的亲切关怀和悉心指导下完成的，在硕士研究生期 间，李老师严谨的治学态度和精益求精的工作作风深深地感染和激励着我，从论文 选题到科研工作的最终完成，李老师都给予了我细心的指导和不懈的支持。三年来， 李老师还在思想上和生活上给我以无微不至的关怀和帮助，在此谨向他致以崇高的 敬意和诚挚的谢意。 国家小麦工程技术研究中心的尹钧教授、牛吉山、任江萍、牛洪斌、王翔及生 命科学院的孟凡荣老师都为我提供了热情的指导和帮助，在此表示感谢。 衷心感谢师姐王潇、刘吴英、师兄司志飞、师妹李金花、张春燕、凌娜、贾海 英、刘浩、张艳霞、同届闰延涛、张问、冉彩华、沈丙权在生活和学习上的关心j 实验上的支持。在此，我还要感谢在一起愉快的度过研究生生活的4 号楼1 0 1 各位室 友，正是由于你们的帮助和支持，我才能克服一个个的困难和疑惑，直至硕士学位 论文的顺利完成。 特别感谢我的父母和我的朋友倪永静，他们的无私奉献、关心、支持和爱护， 是我顺利完成学业的坚强后盾和有力保障。 在论文即将完成之际，我的心情无法平静，从开始进入课题到论文的顺利完成， 有多少可敬的师长、同学、朋友给了我无言的帮助，在这里请接受我诚挚的谢意! 最后我还要感谢培养我长大含辛茹苦的父母，谢谢你们! 陈雷 2 0 1 0 年6 月于郑州 摘要1 l 文献综述一2 1 1 植物形态结构与抗旱性的关系2 1 1 1 根系结构对抗早性的影响2 1 1 2 叶片结构对抗旱性的影响 一2 1 2 渗透调节与抗旱性的关系3 1 2 1 无机离子3 1 2 2 脯氨酸3 1 2 3 甜菜碱4 1 2 4 可溶性糖4 l - 3 脱水保护蛋白在干旱胁迫反应过程中的功能4 1 3 1 水通道蛋白4 1 3 2 渗调蛋白5 1 3 3 胚胎后期丰富蛋白5 1 4 抗氧化防御与植物的抗旱性8 1 5 干旱胁迫信号的传导与基因表达调控8 2 引言ll 3 材料与实验方法1 2 3 1 实验材料1 2 3 1 1 植物材料和菌株一1 2 3 1 1 1 植物材料1 2 3 1 1 2 菌株一1 2 3 1 2 质粒载体1 2 3 1 3 工具酶及试剂盒1 2 3 1 4 主要仪器1 2 3 1 5P C R 引物1 2 3 1 6 培养基1 2 3 2 实验方法1 4 3 2 1 总R N A 提取及质量鉴定1 4 3 2 1 1 试剂和器皿的准备1 4 3 2 1 2 试验准备1 4 3 2 1 3 总R N A 提取操作步骤( T r i z o l 法) 1 4 3 2 1 4 热酚法1 5 3 2 1 5 总R N A 质量及浓度测定1 5 3 2 2 总R N A 的纯化1 5 3 2 3 目的基因的克隆1 6 3 2 3 1 反转录：e D N A 第一链的合成一1 6 3 2 3 2 基因克隆的P C R 反应1 6 3 2 3 3 克隆基因的基因组结构分析1 7 3 2 3 4P C R 产物的回收和连接测序1 7 3 2 3 5 重组质粒的提取、鉴定及序列分析1 9 3 2 4c D N A 的获得及基因表达特性分析2 0 3 2 4 1 反转录：c D N A 第一链的合成2 0 3 2 4 2 内标基因A c t i n 循环数的确定2 0 3 2 4 3 克隆基因表达特性分析及模板量的确定2 0 3 2 4 4 克隆基因表达特性分析2 1 3 2 5T a L E A 4 正义植物表达植物表达载体的构建2 l 3 2 5 1 植物表达载体号载体小量提取及质量检测一2 1 3 2 5 2 特异片段的扩增2 l 3 2 5 3B a m H I P s t I 酶切号载体2 l 3 2 5 4 号载体和扩增片段的连接、转化及质粒提取2 l 4 结果和分析2 2 4 1 小麦根系中受水分胁诱导基因的克隆2 2 4 I 1T a D H R 的克隆及序列分析2 2 4 1 2T a L E A 4 和T a L E A 5 基因的克隆及序列分析2 3 4 1 3T a R A B 9 1 0 的克隆及序列分析2 7 4 2 克隆基因的表达特性分析3 1 4 2 1A B A 处理条件下的表达分析3 1 4 _ 2 - 2N a C I 处理条件下的表达分析3 2 4 2 3 水分胁迫条件下的表达分析3 3 4 2 5 水分胁迫相关基因在种子形成过程中的表达特性分析3 5 4 3T a L E A 4 植物表达载的体构建及遗传转化3 5 4 3 1T a L E A 4 基因植物过表达和反义载体的构建3 5 4 3 2 水稻的遗传转化和鉴定3 7 5 讨论3 7 5 1 在胁迫条件下水分胁迫基因的表达特性分析3 7 5 2 水分胁迫基因的时空表达特性分析3 8 参考文献3 9 A b s t r a c t I i 6 2 0 1 0 年河南农业人学硕士毕业论文 捅要 干旱是影响小麦稳产高产的的主要逆境因子，开展小麦抗旱分子机理研究及发掘抗旱相关 基因对小麦抗旱分子育种具有重要意义。本文在分析干旱胁迫条件下小麦品种洛早2 号根系 基因表达谱的基础上，通过R T - P C R 克隆了小麦根系中4 个水分胁迫诱导基因，分析了它们在干 旱、高盐胁迫和A B A 处理条件下的表达特性，构建T a L E 4 A 基凶的正义和反义植物表达载体，并 进行了遗传转化。主要结果如下： 利用R T - P C R 方法克隆了4 个小麦水分胁迫诱导基因：T a D H R 、T a L E A 5 、T a L E A 4 和 T a R A B 9 1 0 。T a D H R 基因克隆片段长度为9 8 5b p ，其中编码区6 9 6 b p ，推测编码蛋白由2 3 1 个氨 基酸组成，分子量为2 3 1 4 k D ，等电点理论值为9 4 2 ，其中包含有典型的脱水素保守域；T a L E A 4 基因的克隆片段为7 6 4 b p ，其中编码区5 1 0b p ，5 非翻译区有9 4 b p ，3 非翻译区有1 6 0b p ， 推测编码蛋白由1 6 9 个氨基酸组成，分子量为1 7 5 3 k D ，等电点理论值为6 0 5 。T a L E A 5 基因克 隆片段长度为6 1 3 b p ，其中编码区为4 9 2 b p ，5 非翻译区有4 7 b p ，3 - 非翻译区有7 4 b p ，在编码 区有一个1 0 0 b p 的内含子，推测该基因编码蛋白由1 6 3 个氨基酸组成，分子量为1 6 9 3k D ，等 电点理论值为7 1 5 。T a R A B 9 1 0 基冈克隆片段为9 5 0 b p ，其中编码区为5 4 9 b p ，推测编码蛋白由 1 8 2 个氨基酸组成，分子量为1 9 0 1 k D ，等电点理论值为9 9 7 ，与A B A 诱导的膜蛋白基因 U 8 0 0 3 7 仅有两个核苷酸位点的差异，未发现内含子。 在干旱和高盐( N a C I ) 胁迫及A B A 处理条件下的表达特性分析显示：在洛早2 号中， 模拟干旱胁迫条件下，T a D H R 基因在根系中随着胁迫时间的推移表达有所增强，但在叶片中未 检测到其表达，其它3 个基因在根系和叶片中均受干旱胁迫的诱导而表达增强；在N a C I 处理条 件下，只有T a D H R 基因和T a L E A 4 在根系中诱导表达，但在其它基因在根系和叶片中均未检测 到表达。A B A 处理下，4 个基冈在根系中均有诱导表达的特性，但在叶片中均未检测到表达。 在中国春小麦中，模拟于旱胁迫下，4 个基因在根系和叶片中的诱导表达特性均不明显，但 T a D H R 、T a L E A 4 和T a R A B 9 1 0 在胁迫后期也检测到表达：高盐( N a C I ) 胁迫下，T a D H R 基因在 根系中表现出先诱导表达由强到弱的趋势，而在叶片中出现了诱导表达的波动；T a R A B 9 1 0 基因 在根系中也表现出诱导表达由强到弱的趋势，但在叶片中却随着胁迫时间的推移诱导逐渐增强。 T a L E A 5 和T a L E A 4 在叶片中未检测到表达，而在根系中有诱导表达的趋势。A B A 处理条件下， 叶片中T a D H R 基因只在1 2 h 和2 4 h 检测到表达，其它三个基因均检测不到表达。在根系中，除 T a R A B g l O 基因外，其它3 个基因都均表现出A B A 诱导表达特性。 分析了T a D H R ，T a L E A 5 ，T a L E A 4 、T a R A B 9 1 0 的组织特异表达及其种子形成过程中的的表 达，结果显示：只有T a D H R 在小麦茎秆中有痕量表达，其它基因在花药、胚珠、茎秆、旗叶、 三叶期叶、三叶期根中均检测不到表达。T a D H R 在花后1 5 天、花后2 0 天、花后3 0 天有表达增 加的趋势，T a R A B 9 1 0 在花后1 5 天、花后2 0 天、花后3 0 天有明显表达。构建了T a L E A 4 基因 的正义载体构建，获得了转反义T a L E A 4 基因的水稻6 株，并开展了小麦转基因研究，为该基因 在小麦抗旱育种中的应用奠定了基础。 关键词：小麦；水分胁迫；基凶克隆；表达模式 小麦根系中4 个水分胁迫诱导基因的克隆及功能分析 1 文献综述 干旱是作物生产中重要的逆境因子，世界范围内由于干旱而导致的作物减产相当于其它各 种自然灾害导致的减产总和。因此，有关植物抗旱机理及调控技术方面的研究一直是人们关注 的焦点，也是目前农业生物技术领域的研究热点。植物的抗旱性包括系统抗性和细胞抗性，系 统抗旱性主要是指植物在干旱条件下，通过形态结构的改变来维持植物的正常生长发育的能力， 如株形变小、根系发达、根冠比高、气孔下陷、气孔关闭、蒸腾面积减少等都具有防止植物脱 水的作用。细胞抗旱性主要指植物在干旱条件下，通过细胞内的生理生化变化而表现出抵御环境 干旱胁迫的能力，如产生渗透调节物质脯氨酸、甜菜碱、渗调素以及增加抗氧化能力等，都具 有提高植物抗旱能力的作用无论系统抗旱性，抑或细胞抗旱性，都是由于植物体内相关基因表 达的结果。研究植物抗旱过程中胁迫信号响应传递以及表达调控机理，进一步阐明抗旱作用的 分子机理，通过分子生物学方法获得植物优良抗旱基因，已成为农业生产中非常重要和迫切需 要解决的基础研究课题，也是近年来分子生物学、分子遗传学、细胞生物学和植物生理学的研 究热点。 1 1 植物形态结构与抗旱性的关系 1 1 1 根系结构对抗旱性的影响 植物不能脱离环境而生存，它们不断地从环境中取得生活必需的物质，受到环境的深刻影 响。在长期适应过程中，植物体各种器官的形态结构和理功能不断趋于完善。植物根系的重要 作用就是从土壤中吸收水分和矿质营养，它对植物抵抗外部不利环境具有至关重要的作用。在 干旱胁迫条件下，强壮发达的根系有利于植株充分吸收深层土壤的水分从而使其减小受伤害的 程度。反之，柔弱纤细的根系则不利于植株度过干旱的环境。土壤的干旱首先影响根系的生理 活动和代谢，进而影响整个植株的生命活动能力( 杨敏生等，2 0 0 2 ) 。H s i a 等( 2 0 0 0 ) 研究认为， 当植物受到干旱胁迫时，根系生物量在整个植物生物量中所占比重的变化，是鉴定植物抗旱性 的重要指标之一。高建社等( 2 0 0 5 ) 研究也表明在水分胁迫下，根系的生物量是植物适应干旱 的重要标志。在土壤水分胁迫条件下，供试各白杨树( P o p u l u st o m e n t o s a ) 无性系苗术根系生物量 均呈下降趋势，但下降幅度不同，平均降幅3 0 5 6 。同样杨风云( 杨风云等，2 0 0 4 ) 研究也发 现，土壤水分含量对梨树( P y 兀巧s o r o t i n a ) 生理特性有一定的影响，随着土壤含水量( 7 5 以下) 的 下降，梨树根系活力和数量下降。裴冬等( 2 0 0 2 ) 通过研究高粱和谷子充分供水与干旱处理的 根长密度在土壤中分布的差异，发现干早条件下高粱、谷子深层根系生长增加，以利于根系吸 收贮存于深层土壤的水分，减轻干旱的威胁。 1 1 2 叶片结构对抗旱性的影响 叶片是植物进行光合和蒸腾作用的重要器官，对植物进行正常的生命活动具有重要的意义。 在干旱条件下，叶片的外部形态特征会发生明显的演变，其叶片的结构特点主要是朝着降低蒸 腾和贮藏水分两个方面发展。叶片的旱生结构特征，基本能反映植物的抗旱性大小( 林艳等， 2 0 0 0 ) 。在抗性育种和生产中，邓艳等( 2 0 0 6 ) 研究指出叶片大小、叶着生姿态、叶片的蜡、角 2 2 0 1 0 年河南农业人学硕士毕业论文 质层厚度可作为筛选抗旱品种的指标。黎祜琛等( 2 0 0 3 ) 研究表明：叶片厚度大、栅栏组织发达、 栅栏组织与海绵组织比值高角质层及上皮层厚、气孔下陷、表皮毛发达等都是抗旱性强的标志。 盂庆杰等( 2 0 0 5 ) 研究表明：叶厚、气孔分布密度高、抗旱性强；上表皮细胞大小，也呈现出 一定的规律性，即抗旱性强的桃( P r u n u sp e r s i c a ) 品种细胞小于抗旱性弱的品种。说明栽培桃品 种叶片上表皮细胞的大小亦可作为鉴定抗旱性的一个指标。同时叶相对含水量( L R W C ) 也是反映 植物抗旱性强弱的一项重要指标，L R W C 越大，下降速率越小，则抗旱性越强。 1 2 渗透调节与抗旱性的关系 渗透调节作用是植物适应水分胁迫的重要途径，也是植物抗旱生理研究最活跃的领域 ( H s i a o 等，2 0 0 0 ) 。渗透调节是指在水分胁迫条件下，植物体内积累各种有机物质和无机物质， 提高细胞液浓度，降低其渗透势，保持一定的压力势，使植物保持体内水分，以适应水分胁迫 环境的现象( 萧浪涛等，2 0 0 4 ) 。在细胞水平上进行的，植物适应水分胁迫的重要生理机制渗透 调节物质的种类很多，除了外界进入细胞的无机离子外，其它均为细胞内合成的小分子细胞相 容性物质。干旱条件下积累的这些小分子物质，一方面本身作为渗压剂进行渗透调节，增加细 胞溶质浓度，降低渗透势，保持膨压，缓和脱水胁迫，有利于保持水分和细胞各种生理过程的 正常进行( 赵九洲等，2 0 0 5 ；陈颖等，2 0 0 2 ：宋爱琴等，2 0 0 6 ) 。另一方面，能够维持细胞组分 的损伤与修复的动态平衡，从而能缓解植物的受伤程度( N i s h iy a m aY 等，2 0 0 1 ) ，提高植物的 抗性。近年研究认为细胞相容性物质在脱水胁迫时具有稳定蛋白质结构和膜高度( H i n c h a 等， 2 0 0 4 ) 有序性的作用。目前，研究较为深入的渗透调节物有以下几种。 1 2 1 无机离子 逆境下细胞内常常累积各种无机离子如：C a 2 + 、1 0 、N a + 用以调节渗透势。植物具有不同的 K + 积累调节细胞渗透压的机制，以适应干早胁迫条件。现已发现低亲和性C 吸收通道、高亲 和性K + 转运蛋白、A T P 酶系、氨基酸和糖转运蛋白等体系参与植物主动吸收C 的过程( 梁慧敏 等，2 0 0 3 ) 。一般认为，在渗透胁迫下，植物体内K + 的高水平有助于脯氨酸的积累。另外，植 物在水分胁迫条件下主动积累N a + 。一方面参与渗透调节；另一方面，一些盐生植物在干旱胁 迫下，吸收的多余N a + 不排出体外，而是在细胞内积累并贮存于液泡中，这样可免除或者降低 干旱对植物造成的危害。干旱胁迫可以导致植物细胞液中游离C a 2 + 的快速积累，钙信号被认为 是在植物环境胁迫信号传导中，感受干旱等逆境胁迫，钙能够增强植物细胞防御系统功能，减 弱或抑制破坏系统的功能( Z h uJ K 等，2 0 0 2 ) 。 1 2 2 脯氨酸 脯氨酸( p r a l i n e ) 是一种渗透调节物质，它能增加植物的耐旱胁迫能力和延缓缺水胁迫的加 剧。在正常情况下游离脯氨酸含量仅为0 2 o 6 m g g 干重，占总游离氨基酸的百分之几。脯氨酸 合成酶基因的研究较为深入，至今已从水稻、黑麦、绿豆、大豆、拟南芥、蒺藜、苜蓿、榆钱、 菠菜等植物中克隆出了多个与脯氨酸合成酶相关的基因，其中包括P 5 C S 、P S C R 、O A T 和P r o T ( Y USW 等，2 0 0 2 ；季孔庶等，2 0 0 6 ) 。K i s h o r 等( 2 0 0 5 ) 将P 5 C S 基冈导入烟草，转基因植 小麦根系中4 个水分胁迫诱导基因的克隆及功能分析 株脯氨酸含量比对照高1 0 - 一1 8 倍；鸟氨酸循环中6 0 A T 而在干旱条件下则可成1 0 倍地增加， 相对量可达到3 0 ( 刘国花等，2 0 0 3 ) 。李岩等( 2 0 0 0 ) 在中、轻度土壤水分胁迫时，随着土壤 水分胁迫时间的延长，苹果( M a l u sp u m i l a ) 叶片脯氨酸含量增加直至最大值；土壤水分胁迫严重 时，脯氨酸含量有所下降。另在金银花( L o n i c e r aj a p o n i c a ) 、扶芳藤( E u o n y m u s f o r t u n e i ) 、迷迭香 ( R o s m a r i n u so f f w i n a l i s ) 叶片中的脯氨酸含量也因干旱而升高( 徐迎春等，2 0 0 6 ：赵黎芳等，2 0 0 3 ： 吴晓红等，2 0 0 6 ) 。它主要通过三种途径进行积累( 陈善福等，1 9 9 9 ) ：( 1 ) 失去了脯氨酸合成 的反馈抑制作用，如在正常的大麦和烟草中脯氨酸合成受到本身的抑制，但在萎蔫叶中脯氨酸 合成对脯氨酸抑制的敏感性下降；( 2 ) 脯氨酸氧化受到抑制；( 3 ) 蛋白质合成受到抑制；这样 抑制了脯氨酸向蛋白质的参入。在这三个途径中尤以途径( 1 ) 最为主要。径中尤以途径( 1 ) 最为主要。水分胁迫下脯氨酸的积累一方面增强了植物的渗透调节作用，使组织的抗脱水力加 大；另一方面脯氨酸的偶极性保护了膜蛋白结构的完整性，同时增强了膜的柔韧性。因此为提 高植物的抗旱性，可以采用转基因技术使其在干旱条件下产生更多的渗透调节保护物质。 1 2 3 甜菜碱 甜菜碱( b e t a i n e ) 是一种重要的植物渗透调节物质，特别是藜科和禾本科植物，在受到水分胁 迫时积累大量甜菜碱( 杜栋等，2 0 0 4 ) ，以维持细胞的正常膨压。施甜菜碱也能提高植物抗盐、耐 旱能力( L op e zCML 等，2 0 0 2 ) 。刘瑞冬等( 刘瑞冬等，2 0 0 4 ) 试验表明：甜菜碱能使杏 ( P r u n u s a r m e n i a c a ) 叶片在干旱时维持较高的净光合速率，提高水分胁迫对杏叶片的光合能力 有明显效果，而且低浓度的甜菜碱比较高浓度的甜菜碱效果更好。甜菜碱在植物中以胆碱为底 物经两步合成，即胆碱加单氧酶( C M 0 ) 催化胆碱氧化成甜菜碱醛，然后，甜菜碱醛脱氢酶 ( B A D H ) 催化甜菜碱醛形成甜菜碱。 1 2 4 可溶性糖 可溶性糖是另一类渗透调节物质，包括蔗糖、葡萄糖、果糖、海藻糖等。果聚糖是果糖的 多聚分子，由于其高可溶性使植物的渗透调节能力提高。S a c B 是从细菌中分离出的果聚糖合酶 基因，是合成果聚糖的关键酶编码基因。P i l o n S m i t 等( 1 9 9 5 ) 将s a c B 导入烟草，在非胁迫条 件下果聚糖积累对植株生长和产量无影响；在P E G 介导的渗透胁迫下转基因植株的耐受性明显 提高，耐逆性强弱与果聚糖积累量呈正相关。可溶性糖的积累主要是由于淀粉等大分子碳水化 合物的分解，光合产物形成过程中直接转向低分子量的物质如蔗糖、葡萄糖、果糖、海藻糖等。 1 3 脱水保护蛋白在干旱胁迫反应过程中的功能 1 3 1 水通道蛋白 作为跨膜通道的主嵌入蛋白( M I P ) 家族中具有运输水分功能的一类蛋白质，能够促进和调 节水分跨膜的被动交换，包括植物体内的跨细胞和胞内水分流动，是水分跨膜运输的重要途径 之一。最早在哺乳动物的某些特殊的细胞类型里发现的如红细胞肾小管细胞等。在植物体内， 水通道蛋白分布于液泡膜上的液泡膜嵌入蛋E I ( T I P ) ，分布于细胞质膜上的胞质膜嵌入蛋白( P I P ) 和根瘤细胞中。大多数水通道蛋白在维管组织和幼嫩组织的细胞中表达显著。A Q P 在生物膜上 4 内在蛋I 刍( t o n o p l a s ti n t r i n s i cp r o t e i n sT I P s ) 、N L M 蛋白( N o d u l i n2 6l i k eM I P S ，N L M s ) 和S I P ( U r b a n J o h a n s o n 等，2 0 0 1 ) 。其中S I P 序列与P I P 和N I P 相似，但在细胞中的定位和功能了解较少。在 干旱、寒冷、高盐、A B A 处理等条件下，A Q P 基因在各种植物中的表达已进行了研究( H i l l A E 等，2 0 0 4 ；S a k u r a iJ 等，2 0 0 5 ：J a n g J Y 等，2 0 0 4 ) ，但目前对编码水通道蛋白的基因仍待研究。 M a r i a u x 等( 1 9 9 8 ) 研究发现：耐旱植物C r a t e r o s t ig r n ap l a n t a g i n e u m 中的一种水通道蛋白 C p 2 P I P a 在干旱胁迫的响应中起到信号传导的作用。随后研究发现A Q P 表达的变化能引起植株 宏观水平上的变化，比如生长速率、生物量、光合等。说明A Q P 可能作为一种信号分子( 朱珠 等，2 0 0 5 ) ，目前A Q P 信号转导途径还有待深入研究。 1 3 2 渗调蛋白 在高盐浓度下，培养的烟草细胞中多种蛋白质的含量发生了变化，其中一种分子量2 6 K D 的 蛋白质的增加尤为显著，高达细胞总蛋白量的1 2 以上，该蛋白的秋累则要求氯化钠或低水势 的存在( 李燕等，2 0 0 7 ) 。B r e s s a n 等( 1 9 8 7 ) 根据此蛋白的合成和积累发生在细胞对高盐和干 旱胁迫进行逐级渗透调整的过程中，将其定名为渗调蛋I 兰l ( O s m o t m ) 。1 9 8 3 年S i n g h 等发现此蛋 白其含量与细胞抗逆性呈正相关。后来渗调蛋白又在番茄、马铃薯、矮牵牛等多种植物中发现。 许多环境因素和激素信号，如损伤、紫外光、A B A 等都能增强渗调蛋白基因表达( R ag h o t h a m a K G 等，1 9 9 7 ) 。 1 3 3 胚胎后期丰富蛋白 在长期的进化过程中，植物已形成了特定的抵御这些环境胁迫的复杂调控体系( B o h n e r tH J 等，1 9 9 5 ) 。比如，在胁迫过程中植物体会诱导合成一系列的功能蛋白，以保护植物体细胞在胁 迫条件下免受伤害( S h i n o z a k iK 等，2 0 0 7 ；王静英等，2 0 0 8 ) 。在受非生物胁迫诱导的植物细胞 保护蛋白中，有关L E A 蛋白( 1 a t ee m b r y o g e n e s i sa b u n d a n tp r o t e i n ) 的研究倍受关注( H u n d e r t m a r k M 等，2 0 0 8 ) 。L E A 蛋白是一类在种子胚胎发育后期富集的脱水保护蛋白，该类蛋白首先发现 于棉花子叶中( D u r eL 等，1 9 8 1 ) ，之后在小麦( R i e d 几等，1 9 9 3 ) 、大豆( H s i n g Y C 等，1 9 9 5 ) 、 玉米( C a m p b e l lS A 等，1 9 9 8 ) 等多种作物的种子中被发现。值得注意的是，在于旱等非生物胁 迫条件下L E A 蛋白也可在许多植物的营养器官中被诱导而表达( T h o m a s h o wM F 等，1 9 9 9 ； I n g r a i nJ ，B a r r e l sD ，1 9 9 6 ：王静英等，2 0 0 8 ) 。大量研究表明，L E A 蛋白在植物抵御干旱和高盐 等非生物胁迫的过程中发挥着重要作用，但关于L E A 在植物体内的具体生物学功能仍知之甚少 ( H u n d e r t m a r kM 等，2 0 0 4 ) 。 自1 9 8 1 年首次报道植物L E A 蛋白以来，已从各种植物中发现了许多新的L E A 蛋白。根据 蛋白中氨基酸序列的同源性及一些特殊基元序列，可将L E A 蛋白分为6 组( B r a yE A ，1 9 9 3 ； W i s eM J ，2 0 0 4 ；张改娜等，2 0 0 5 ) 。第l 组( D 1 9 ) L E A 蛋白具有多拷贝的由2 0 个氨基组成 5 小麦根系中4 个水分胁迫诱导基因的克隆及功能分析 的高度保守基元序列，而且这些基元序列中富含带电荷氨基酸，具有较强的亲水性( E s p e l u n d M 等，1 9 9 2 ) 。如，棉花的L E AD 1 9 、小麦的E m 、玉米的历鲋、大麦的B 1 9 等都属于这一组， 在生理条件下，7 0 的L E A 多肽可形成随机螺旋( E s p e l u n d M 等，1 9 9 2 ) 。第2 组( D - 1 1 ) L E A 也称为脱水素( d e h y d r i n ) ，其氨基酸序列由K 片段、S 片段、Y - 片段和甲片段组成。K - 片段在 C 端或附近，由1 5 个氨基酸组成基元序列( E K KG I MD K IK E KL P C ) ，在单个多肽内可包含l 1 1 个拷贝K 片段，并可形成双亲水性昏螺旋结构，其疏水面可与一些大分子表面暴露的疏水区 结合，起到分子伴侣的作用( K o a gM C 等，2 0 0 9 ) 。S 片段是可磷酸化的丝氨酸残基片段，它位 于K 片段之间，或紧跟K 片段。Y 片段是N 末端的一些保守序列，通常有1 3 个串联拷贝。甲- 片段一般在K - 片段之间重复出现，通过氢键与生物大分子的极性头部相互作用，覆盖暴露的大 分子疏水表面，防止其凝结( R o r a t T 等，2 0 0 6 ) 。例如，棉花D l l 就属于第2 组L E A 蛋白( D u r e I I IL 等，1 9 8 9 ) 。第3 组( D 7 ) L E A 蛋白中一般含多拷贝的由1 1 个氨基酸组成的基元序列( T A Q A A KE K AG E ) ，这些多拷贝基元序列呈串联结构，长度可占L E A 蛋白的4 0 6 0 ( B a k e r J d e n g ，1 9 8 8 ) 。该组L E A 蛋白大小差异很大，基元序列的拷贝数少为5 个，多则可达几十个( L i u Y 等，2 0 0 5 ) 。基元序列可形成兼性a 螺旋结构，提供一个具疏水条区的亲水表面。此外，组成 该蛋白的大多数氨基酸残基为碱性、亲水性氨基酸，无半胱氨酸和色氨酸。例如，大麦的H F A I 、 小麦的P M A 2 0 0 5 、胡萝卜的D C 3 、棉花的D 7 和大豆的p G m P M 2 等均属于这一组L E A 蛋白( 刘 昀等，2 0 0 9 ；W a n g L 等，2 0 0 9 ；H s i n g Y I 等，1 9 9 2 ) 。第4 组( D 1 1 3 ) L E A 蛋白缺乏重复的基元 序列，但是具有N 端保守的a 一螺旋，该区域在细胞膜脱水保护方面发挥重要功能；例如，棉花 的L E A l 4 、D l l 3 就属于这一组( h a g r a mJ 等，1 9 9 6 ；B r a yE A ，1 9 9 3 ) 。第5 组( D 2 9 ) L E A 蛋白 在结构和功能上与第3 组L E A 蛋白相似，有一个l l 氨基酸重复序列，具有中和离子的功能， 但缺乏高度的残基专一性。如，棉花的L E A D 2 9 、L E A D 3 4 ，胡萝卜的D C E C P 3 1 及拟南芥的 A t E C 3 1 等均属于这一组( B r a yE A ，1 9 9 3 ) 。第6 组( D - 9 5 ) ，L E A 蛋白的研究较少，比如棉花 的D 9 5 和辣椒的C a L E A 6 ( K i mH S 等，2 0 0 5 ) 。 在模式植物拟南芥基因组中，已经发现5 1 个编码L E A 蛋白的基因，H u n d e r t m a r k 等( 2 0 0 8 ) 将这些基因分为d e h y d r i n ，E 一，L E A 2 ，上E 爿一3 ，L E A 一4 ，L E A - J ，S M P ，P v L E A l 8 和A t M9 类( 表1 ) 。通过实时定量对这5 1 个L E A 基因在幼苗、叶片、芽、茎干、根、花和角果等组织 中的表达特性分析显示：在没有胁迫或激素处理的条件下，其中2 2 个L E A 基因( 4 3 ) 表现出 较高水平的表达，以幼苗中的表达水平最高，角果中最低：在干旱、冷和盐胁迫条件下，有1 2 个L E A 基因可被胁迫强烈诱导表达( 上调倍数在3 倍以上) 这和前人的研究结果相一致( W i l h e l m K S 等，1 9 9 3 ：K i mH S 等，2 0 0 5 ) ；在激素处理条件下，许多L E A 基冈的表达均受A B A 的诱导， 但它们对G A 3 却步敏感；值得注意的是，在拟南芥叶片中，S M P 和A t M 两组L E A 基因的表达 并不受受非生物胁迫或A B A 的诱导。 6 N O A t l 9 0 1 4 7 0 A t l 9 0 2 8 2 0 A t l 9 0 3 1 2 0 A t l9 2 0 4 4 0 A t l 9 2 0 4 5 0 A t l 9 3 2 5 6 0 A t l 9 5 2 6 9 0 A t l 9 5 4 4 1 0 A t l 9 7 2 1 0 0 A t l 9 7 6 18 0 A t 2 9 0 3 7 4 0 A t 2 9 0 3 8 5 0 A t 2 9 l8 3 4 0 A t 2 9 2 1 4 9 0 A t 2 9 2 31 1 0 A t 2 9 2 3 1 2 0 A t 2 e , 3 3 6 9 0 A t 2 9 3 5 3 0 0 A t 3 1 9 3 6 6 4 0 A t 2 9 4 0 1 7 0 A t 2 9 41 2 6 0 A t 2 9 4 1 2 8 0 A t 2 9 4 2 5 3 0 A t 2 9 4 2 5 4 0 A t 2 9 4 2 5 6 0 A t 2 9 4 4 0 6 0 厶巳42 L E A3 s M P d e h y d r i n d e h y d r i n L E Al L 巴44 d e h y d r i n L 巴44 d e h y d r i n L 巴44 L 巴44 Z 4 d e h y d r i n P v L E A l 8 P v L E A l 8 P v L E A l 8 L E Al L E 4 L E A5 A t M A t M 厶44 E 彳4 厶巴44 L 巴42 组成型表达 胁迫表达 种子中表达 非种子组织中表达 非种子组织中表达 种子中表达 芽、种子中表达 非种子组织中表达 种子中表达 非种子中表达 芽中表达 芽中表达 种子中表达 种子中表达 种子中表达 组成型表达 芽中表达 盐胁迫下表达 种子中表达 组成型表达 种子中表达 种子中表达 非种子组织中表达 非种子组织中表达 种子中表达 非种子组织中表达 A t 2 9 4 61 4 0 A t 3 9 0 2 4 8 0 A t 3 9 1 5 6 7 0 A t 3 9 l7 5 2 0 A t 3 9 2 2 4 9 0 A t 3 9 2 2 5 0 0 A t 3 9 5 0 9 7 0 A t 3 9 5 0 9 8 0 A t 3 9 5 1 8 1 0 A t 3 9 5 3 0 4 0 A t 3 9 ! ；3 7 7 0 A t 4 9 0 2 3 8 0 A t 4 9 13 2 3 0 A t 4 9 1 3 5 6 0 A t 4 9 1 5 9 1 0 A t 4 9 2 1 0 2 0 A t 4 9 3 6 6 0 0 A t 4 9 3 8 4 1 0 A t n 9 3 9 1 3 0 A t 5 9 0 6 7 6 0 A t 5 9 2 7 9 8 0 A t 5 9 4 4 3 1 0 A t 5 9 5 3 2 6 0 A t 5 9 5 3 2 7 0 A t S 9 6 6 4 0 0 厶E A2 L 巴44 L 已44 厶巳44 s M P s M P d e h y d r i n d e h y d r i n L E A5 工尉4 L E A3 L E A3 L 删4 厶翻4 厶巳43 厶巴44 L E A4 d e h y d r i n d e h y d r i n L E Al s M P L e l4 s M P S M P d e h y d r i n 种子和根中表达 生殖组织和种子中表达 种子中表达 种子中表达 种子中表达 盐胁迫下表达 组成型表达 种子中表达 种子中表达 种子中表达 种子内表达 组成型表达 芽中表达 生殖组织 组成型表达 种子中表达 种子中表达 根中表达 种子和芽中表达 种子中表达 芽中表达 种子中表达 种子中表达 种子中表达 种子中表达 大量研究表明，L E A 蛋白在植物耐受干旱和盐胁迫过程中发挥着熏要的功能。X u 等( 1 9 9 6 ) 将大麦的L E A 基因H V A l 导入水稻后，发现转基因水稻植株的抗旱和耐盐能力大大提高，该基 因的抗旱、耐盐功能在烟草( 李楠等，2 0 0 7 ) 和桑树( L a lS ，2 0 0 8 ) 中也得到了实验证实；张 妍等( 2 0 0 5 ) 将大麦三点3 基因转入水稻也获得了抗旱、耐盐的转基因水稻植株。W a n g 等( 2 0 0 9 ) 将小麦的T a L E A 3 基因转入了多年生的草本植物后，发现转基因植株在干旱环境下的叶片含水 量、平均生长速度等均明显高于对照：小麦第3 组L E A 基因T a L E A 2 在拟南芥中表达后，转基 因植株在1 0 P E G 及0 8 N a C I 培养基上也表现出显著的抗逆特性( 赵咏梅等，2 0 0 6 ) C h e n g 7 ”勰汐如孔记驺弘弱拍鲳剪乱铊躬钻铂钉铝钾卯钉 2 3 4 5 6 7 0 9 m n 他n M坫坫他侈加甜船罄M巧拍 小麦根系中4 个水分胁迫诱导基因的克隆及功能分析 等( 2 0 0 2 ) 将小麦的第一组L E A 基因尸 纠J 妨9 和第二组L E A 基因P M A 8 0 导入水稻后，也获 得了抗旱、耐盐能力显著增强的转基因水稻材料。另外，将来自柽柳和大豆的L E A 基因导入烟 草后，转基因后到也获得了较好的抗旱和耐盐碱能力( 刘甜甜等，2 0 0 6 ：蔡丹等，2 0 0 6 ) 。植物 在冷胁迫过程中也会诱导产生一些L E A 蛋白，例如拟南芥的C O R 4 7 蛋白、大麦的H V A I 蛋白 和小麦的巴4D - 1 1 在冷胁迫过程中均会被诱导而上调表达( D a l a iM 等，2 0 0 9 ：O h n oR 等，2 0 0 6 ) 。 Z h a n g 等( 2 0 0 7 ) 将来源于雪山离子芥( C h o r i s p o r ab u n g e a n a ) 的L E A 基因C b L E A 导入烟草后， 转基因烟草获得了很强的耐寒能力。 综上所述，L E A 蛋白是一类广泛存在于植物中具有很强的亲水性和热稳定性的保护蛋白， 在干旱、高盐、寒冷及高温等非生物胁迫条件下，能够保护细胞膜及生物大分子的稳定性( W a n g L 等，2 0 0 9 ；李永春等，2 0 0 8 ) 。目前，关于植物L E A 蛋白的具体生物学功能仍有待于进一步 深入研究，植物L E A 基冈将在作物抗逆分子育种中做出重要的贡献。 1 4 抗氧化防御与植物的抗旱性 植物在遭受干旱胁迫时通常伴随着活性氧的生成时，往往导致体内活性氧产生与清除机制 的失衡，造成活性氧的过量累积，引起膜系统损伤( 孙梅霞等，2 0 0 4 ) ，尤其是线粒体和叶绿 体的破坏，导致氧化胁迫。在生物系统进化过程中，细胞为保护自身免受伤害也形成了清除这 些自由基和活性氧的保护体系。酶类如超氧化物歧化酶( S O D ) 、过氧化物酶( P O D ) 、过氧化氢 酶( C A T ) 、抗坏血酸过氧化物酶( A P O D ) 、脱氢抗坏血酸还原酶( D H A R ) 、谷胱甘肽还原酶( G R ) 、 谷胱甘肽过氧化物酶( G P ) 等，他们能有效清除活性氧，提高植物的抗早性( H a r aM 等，2 0 0 4 ；张 成军等，2 0 0 5 ) 。一般来说，干旱胁迫下植物体内S O D 、P O D 、