苎麻茎皮差减文库的构建及纤维发育相关基因的筛选-硕士论文

分类号 密级 华中农业大学硕士学位论文 苎麻茎皮差减文库的构建及纤维发育相关基因的筛选 C o n s t r u c t i o no fR a m i eS t e mS u b t r a c t e dL i b r a r ya n dS e l e c t i o n o fF i b e rD e v e l o p m e n t - R e l a t e dG e n e s 研究生：罗蓓蓓 指导教师：彭定祥教授 指导小组：曹凑贵教授 胡立勇教授 靳德明教授 杨国正副教授 周广生副教授 专业：作物遗传育种 获得学位名称：农学硕士 研究方向：苎麻基因工程 获得学位时间：2 0 1 0 年6 月 华中农业大学植物科学与技术学院 二。一。年六月 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 雹 如需保密，解密时间年月日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究X - 作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位 或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究 所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 班始酽 帆劢年日 学位论文使用授权书 注：保密学位论文( 印涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的 磁毖形锄叛却汐q 签名日期：劲年易月占日签名日期：幽。年占月多日 注：请将本襄直接装订在学位论文的扉页和目录之间 苎麻茎皮差减文库的构建及纤维发育相关基因的筛选 目录 摘要I A b s t r a c t ，I I I 缩略语表V 第一章文献综述l 1 1 差减文库的构建及研究进展1 1 1 1 差减文库的基本原理1 1 1 2 差减杂交的方法1 1 1 3 抑制性差减杂交( S S H ) 技术的应用5 1 2 表达序列标签( E S T ) 技术的研究进展5 1 2 1 表达序列标签( E S T ) 的概念5 1 2 2 表达序列标签( E S T ) 技术的应用5 1 2 3 苎麻属植物E S T 的研究概况7 1 3 苎麻韧皮纤维的发育过程7 1 3 1 韧皮纤维细胞分化7 1 3 2 韧皮纤维细胞生长7 1 3 3 韧皮纤维细胞发育成熟8 1 4 苎麻分子水平上的研究8 1 5 本研究的目的与意义8 第二章苎麻茎皮差减文库的构建1 0 2 1 试验材料1 0 2 1 1 植物材料1 0 2 1 2 器皿准备1 0 2 1 3 主要试剂和仪器1 0 2 2 试验方法1 1 2 2 1 总R N A 的提取1 1 2 2 2m R N A 的分离和纯化1 2 2 2 3 差减文库的构建1 2 2 3 试验结果与分析1 2 2 3 1 茎皮总R N A 的提取1 2 2 3 2m R N A 的分离一1 4 2 3 3 差减文库的质量1 4 2 4 讨论一1 6 2 4 1 总R N A 的提取1 6 2 4 2m R N A 的分离1 6 2 4 3 差减文库的构建1 7 第三章苎麻茎皮差减文库的筛选及E S T 序列的分析1 8 3 1 试验材料l8 3 1 1 材料18 3 1 2 仪器设备18 3 1 3 载体和菌株1 8 3 2 试验方法1 8 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 3 2 1P C R 产物的纯化1 8 3 2 2P C R 产物的连接与转化1 9 3 2 3 阳性克隆的保存1 9 3 2 4P C R 扩增检测插入片段1 9 3 2 5E S T 序列的测序与分析2 0 3 3 试验结果与分析2 0 3 3 1P C R 产物的纯化与文库质量2 0 3 3 2 差减文库插入片段的P C R 检测一2 1 3 3 3 差减文库的E S T 序列测序2 3 3 4 讨论2 9 3 4 1 差减文库的连接转化2 9 3 4 2E S T 序列分析一3 0 3 4 3 纤维发育相关基因的筛选3 0 第四章结论3 2 参考文献3 4 附蜀毛4 l 致谢4 8 苎麻茎皮差减文库的构建及纤维发育相关基因的筛选 摘要 苎麻( B o e h m e r i an i v e a ( L ) G a u d ) ，为荨麻科苎麻属多年生韧皮纤维作物。苎麻是 最长的纤维作物之一，素有“天然纤维之王”的美誉。苎麻茎皮是由韧皮纤维细胞构 成的，是纤维的主要来源。本研究利用组织生长的阶段性，利用苎麻茎皮地上茎 的不同部位，以茎顶端为T e s t e r ，茎基部为D r i v e r 进行差减杂交，构建了两个 苎麻茎皮差减文库P 和U 。得到以下结果： 1 P C R 产物进行纯化的差减文库P 挑取保存了1 1 0 2 个阳性克隆，获得了 1 3 个阳性克隆的测序结果，并进行了B l a s t X 和B l a s t N 比对分析；P C R 产物未 经过纯化的差减文库U 挑取保存了1 1 5 2 个阳性克隆，获得了1 8 5 个阳性克隆 的测序结果，并进行了B l a s t 分析和生物信息学分析。 2 库U 中的E S T 序列除去小片段和载体序列后获得1 7 1 条有效序列，分 为1 4 类功能基因：能量相关的序列数量最多，有5 2 条，占3 0 ；未分类序列 有3 9 条，占2 3 ；蛋白质合成、细胞结构相关序列各有1 4 条，各占8 ；未 明确分类序列有1 3 条，约占8 ；代谢相关序列1 0 条，占6 ；蛋白质降解及 贮藏相关序列有8 条，占5 ；转录、抗病及防御相关序列各有4 条，各占2 ； 细胞生长及分化、胞内运输、次生代谢相关序列各有3 条，各占2 ；转运、 信号转导各有2 条，各占l 。 3 库U 中的E S T 序列除去低质量序列和载体序列后获得1 6 6 条有效序列， 拼接后得到3 7 条u n i s e c q u e n c e s ，包括1 9 个c o n t i g 和1 8 个s i n g l e t 。并从分子 功能、细胞组成和生物学过程三个方面对其分类和分析： 在分子功能水平2 上，与结合功能相关的序列有6 7 ；与催化活性相关的 序列有4 5 ；与抗氧化活性相关的序列有1 8 ；与分子结构活性相关的序列有 8 ；与翻译调节活性相关的序列有2 ；与转运活性相关的序列有2 。 在细胞组成水平2 上，与组成细胞和部分细胞相关的序列有4 3 ；与组成 细胞器相关的序列有3 7 ；与组成大分子复合体相关的序列有3 2 ；与组成部 分细胞器相关的序列有8 ；与组成胞外结构相关的序列有2 。 在生物学过程水平2 上，与代谢过程相关的序列有6 2 ；与细胞生理过程 相关的序列有5 4 ；与应激反应过程相关的序列有2 1 ；与生物调控相关的序 列有5 ；与发育过程相关的序列有5 ；与建立定位过程相关的序列有5 ； 与定位过程相关的序列有5 ；与多细胞有机体过程相关的序列有2 ；与生物 过程的正调控与负调控相关序列分别有2 。 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 4 B l a s t 筛选出9 条与纤维发育相关基因，它们分别是a 微管蛋白基因家 4 条，D 微管蛋白基因家族l 条，钙调蛋白基因1 条，几丁质酶基因纤维 基水解酶基因1 条，果胶酯酶基因1 条，过氧化物酶基因1 条。 5 G O 注释筛选出5 条推测为与纤维发育相关基因，它们分别是：微管蛋 a 链基因，肌动蛋白基因，木葡聚糖转葡糖苷酶水解酶蛋白2 2 基因，V 型 子A T P 酶11 6 k D a 亚基的异构体4 基因，细胞程序性死亡蛋白4 基因。 键词：苎麻茎皮差减文库纤维发育 苎麻茎皮差减文库的构建及纤维发育相关基因的筛选 A b s t r a c t R a m i e ( B o e h m e r i an i v e a 仁JG a u d ) i sap e r e n n i a lb a s tf i b e rc r o po ft h eU r t i c a c e a e B o e h m e r i a R a m i ef i b e ri sk n o w na st h e ”k i n go fn a t u r a lf i b e r s ”，o n eo ft h el o n g e s t n a t u r a lf i b e ri nt h ew o r l d S t e mi sc o m p o s e do f b a s tf i b e rc e l l s ，w h i c hi st h em a j o rs o u r c e o ff i b e r I nt h i ss t u d y , r a m i es t e m so nt h et o pw a su s e da st h eT e s t e r , s t e mb a s ew a su s e d a st h eD r i v e rf o rs u b t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o nt oc o n s t r u c tt w os u b t r a c t i v eL i b r a r yPa n d L i b r a r yU T h er e s u l t sw e r es h o w n a s ： 1 L i b r a r yPp r e s e r v e d110 2c l o n e s ，i nw h i c h13p o s i t i v ec l o n e sw e r eo b t a i n e da n d s e q u e n c e d A n dB l a s t Xa n dB l a s t Nc o m p a r i s o na n a l y s i sw e r ec o n d u c t e di nL i b r a r yE L i b r a r yUp r e s e r v e d 115 2c l o n e s ，i nw h i c h18 5p o s i t i v ec l o n e sw e r eo b t a i n e da n d s e q u e n c e d A n dB l a s ta n a l y s i sa n db i o i n f o r m a t i c sa n a l y s i sw e r ec o n d u c t e d i nL i b r a r yU 2 T h e r ew e r e171e f f e c t i v eE S Ts e q u e n c e so fL i b r a r yU ，i nw h i c hs m a l lf r a g m e n t s a n dv e c t o rs e q u e n c e sw e r er e m o v e d T h e171s e q u e n c e sw e r ed i v i d e di n t o14f u n c t i o n a l g e n e s ：t h e r ew e r e5 2e n e r g ys e q u e n c e s ，w h i c hw a sa b o u t3 0 ；t h e r ew e r e3 9u n c l a s s i f i e d s e q u e n c e s ，a b o u t2 3 ；t h e r ew e r eb o t h14p r o t e i ns y n t h e s i sa n dc e l ls t r u c t u r es e q u e n c e s ， e a c ha b o u t8 ；t h e r ew e r e13u n c l e a rc l a s s i f i e ds e q u e n c e s ，a b o u t8 ；t h e r ew e r e10 m e t a b o l i s mr e l a t e ds e q u e n c e s ，w h i c hw a sa b o u t6 ；t h e r ew e r e8p r o t e i nd e g r a d a t i o n a n ds t o r a g er e l a t e ds e q u e n c e s ，w h i c hw a sa b o u t5 ；t h e r ew e r e4p i e c e so ft r a n s c r i p t i o n ， d i s e a s er e s i s t a n c ea n dd e f e n s er e l a t e ds e q u e n c e sr e s p c t i V e l y ，e a c ha b o u t2 ；t h e r ew e r e3 p i e c e so fc e l lg r o w t ha n dd i f f e r e n t i a t i o n ，i n t r a c e l l u l a rt r a n s p o r t ，s e c o n d a r ym e t a b o l i s m r e l a t e ds e q u e n c e sr e s p e c t i v e l y , e a c ha b o u t2 ；t h e r e2p i e c e so ft r a n s p o r t ，s i g n a l t r a n s d u c t i o nr e l a t e ds e q u e n c e sr e s p e c t i v e l y , e a c ha b o u t1 3 I nt h eG e n eO n t o l o g ya n a l y s i s ，16 6v a l i ds e q u e n c e sw e r eo b t a i n e df r o mt h e L i b r a r yU w i t h18 5E S Ts e q u e n c e s 3 7u n i s e c q u e n c e sw e r eo b t a i n e da f t e rs p l i c i n g ， i n c l u d i n g19c o n t i g sa n d18s i n g l e t s ，w h i c hw e r ea n a l y s i s e da n dc l a s s i f i e df r o mt h r e e a s p e c t s ： F u n c t i o na tt h em o l e c u l a rl e v e l2 ：t h eb i n d i n gr e l a t e ds e q u e n c e s w h i c hw a sa b o u t 6 7 ：t h ec a t a l y t i ca c t i v i t yr e l a t e ds e q u e n c e s ，w h i c hw a sa b o u t4 5 ；a n t i o x i d a n tr e l a t e d s e q u e n c e s ，w h i c hw a sa b o u tl8 ；m o l e c u l a rs t r u c t u r ea c t i v i t yr e l a t e ds e q u e n c e s ，w h i c h W a sa b o u t8 ；t r a n s l a t i o n a lr e g u l a t i o na c t i v i t yr e l a t e ds e q u e n c e s ，w h i c hw a sa b o u t2 ； t r a n s p o r ta c t i v i t ya s s o c i a t e ds e q u e n c e s w h i c hw a sa b o u t2 ， F u n c t i o na tt h ec e l l u l a rc o m p o n e n tl e v e l2 ：c o m p o s i t i o no fc e l l ss e q u e n c e s ，w h i c h I I I K e yw o r d s ：R a m i es t e m 、S u b t r a c t e dl i b r a r y 、f i b e rd e v e l o p m e n t 二N 苎麻茎皮差减文库的构建及纤维发育相关基因的筛选 缩略语表 简写符号英文全称 中文全称 A I P A m p i c i l l i n 氨苄青霉素 B L A S T B a s i cL o c a lA l i g n m e n tS e a r c hT o o l 基本局部相似性比对搜索工具 b p D E P C d N T P B a s ep a i r D i e t h y l p y r o c a r b o n a t e 碱基对 焦炭酸二乙酯 D e o x y n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e 脱氧核苷三磷酸 d s c D N AD o u b l es t r a n dc o m p l e m e n t a r yD N A双链互补D N A E c o l iE s c h e r i c h i ac o l i大肠杆菌 E D T A E t h y l e n ed i a m i n e t e t r a c e t i ca c i d 乙二胺四乙酸 E S T E x p r e s s e ds e q u e n c et a g 表达序列标签 I P T G I s o p r o p y l t h i o 1 3 一D g a l a c t o s i d e 异丙基硫代一1 3 一D - 半乳糖苷 L B L u r i a b e r t a n i基本培养基 O D 2 6 0A b s o r b t i o na t2 6 0 n m2 6 0 n m 处吸光值 O D 2 8 0A b s o r b t i o na t2 8 0 n m2 8 0 n m 处吸光值 P C R P o l y m e r a s ec h a i n r e a c t i o n聚合酶链式反应 R A C E R a p i dA m p l i f i c a t i o no fe D N A E n de D N A 末端快速扩增技术 S S H S u p p r e s s i o ns u b t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o n 抑制性差减杂交 X g a l 5 - b r o m o - 4 - c h l o r o - 3 - i n d o l y l - 1 3 一D - g a l a c t o s i d e 5 - 溴4 集c - 3 一p ；l O & - 1 3 - D - 半乳糖苷 V 苎麻茎皮差减文库的构建及纤维发育相关基因的筛选 第一章文献综述 苎麻( B o e h m e r i an i v e a ( L ) G a u d ) ，为荨麻科苎麻属多年生韧皮纤维作物。苎麻在 我国不仅有着悠久的种植历史，也有着悠久的开发利用历史。新石器时代遗址出 土的苎麻布和细麻绳，证明了很早以前我国古代劳动人民就开始种植和利用苎 麻( 李宗道，1 9 8 9 ) 。我国是目前世界上最大的苎麻生产国，有9 0 以上苎麻在中 国种植和生产。迄今为止，苎麻属种质资源2 0 0 0 多份都己完成收集和保存( 揭雨成， 2 0 0 0 ) 。 苎麻单纤维长度有6 0 m m - 2 5 0 m m ，是最长的纤维作物之一，素有“天然纤维之 王”的美誉。纺织利用的基本单位是苎麻的韧皮纤维细胞，纤维产量的构成也有赖 于苎麻韧皮纤维细胞，所以对纤维的产量和品质产生影响的最主要因素就是苎麻的 韧皮纤维细胞。 1 1 差减文库的构建及研究进展 1 1 1 差减文库的基本原理 差减文库的基本原理又称为减法原则：使用的是相同或相似的遗传背景，但具 有一些不同的功能或特性的材料。在提取两种材料的m R N A ( 或反转录后合成c D N A ) 后，在一定条件下将过量的不含目的基因的一方作为驱动方( D r i v e r ) ，将含有目的 基因的一方作为试验方( T e s t e r ) 进行杂交。选择性的祛除两部分共同基因杂交形成的 复合物，最后将含有相关目的基因的未杂交部分收集，然后连接到载体形成文库。 差减杂交是构建差减文库的核心，差减杂交的效率是构建差减文库成功与否的关键 f 骆蒙等，2 0 0 0 ) 。 1 1 2 差减杂交的方法 差减杂交的方法主要有：羟基磷灰石柱层析法( H A P ) 、生物素标记链亲和蛋白 结合排除法、磁珠介导的差减法( M A S T ) 和限制性内切酶与P C R 技术相结合的差减 方法( E D S ) 四类。 1 1 2 1 羟基磷灰石柱层析法( H A P ) 羟基磷灰石柱层析法( H y d r o x y a p a t i ec h r o m a t o g r a p h y , H A P ) ，出现在2 0 世纪8 0 年代初期，应用于差减杂交研究的早期( S a r g e n t e ta l ，1 9 8 3 ) 。这一方法的关键在 于羟基磷灰石对单链和双链的吸附能力不同。在杂交后的混合物通过羟基磷灰石层 析柱时，杂交形成的c D N A m R N A 复合物被层析柱吸附，而单链c D N A 被洗脱收 集。 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 1 1 2 2 生物素标记链亲和蛋白结合排除法 2 0 世纪8 0 年代后期，出现了另一种差减杂交的方法，即生物素标记链亲和蛋 白结合排除法( S i v ee ta l ，1 9 8 8 ) 。首先，将驱动方m R N A 或者e D N A 用生物素进 行标记；然后用标记的驱动方m R N A 与测试方m R N A 杂交；再将链亲和蛋白加入 杂交混合物中，链亲和蛋白与生物素结合形成链亲和蛋白生物素e D N A m R N A 复 合体；接着用酚氯仿进行抽提，除去其中混有的蛋白质；最后将上清收集后便可得 到目的核酸。 1 1 2 3 磁珠介导的差减法( M A S T ) 2 0 世纪9 0 年代初，磁珠介导的差减法( m a g n e ta s s i s t e ds u b t r a c t i v et e c h n i q u e ， M A S T ) 出现了( S c b r a m le ta l ，1 9 9 3 ) 。这种方法是将驱动方的总R N A 与结合有o l i g o ( d T ) 2 5 的链亲和素蛋白的磁珠在一定条件下杂交混合，这样就可以捕获到驱动方 总R N A 中的m R N A 。然后，用磁铁架吸附分离到的m R N A ，再反复清洗几次并进 行纯化。以捕获的驱动方m R N A 为模板，o l i g o ( d T ) 2 5 为引物进行第一链的合成， 合成后的驱动方e D N A 就牢牢地吸附在被磁珠上了。将带有驱动方e D N A 的磁珠与 测试方m R N A 杂交，就会形成磁珠c D N A m R N A 复合物，用磁铁架吸附磁珠，就 可以将目的核酸富集，用于构建文库。 1 1 2 4 限制性内切酶技术相结合的差减方法( E D S ) P C R 技术的产生和应用，使人们创造出更多的差异基因分离策略。以P C R 为 基础的分离差异表达基因的方法主要有m R N A 差异显示反转录P C R ( m R N A d i f f e r e n t i a ld i s p l a yr e v e r s et r a n s c r i p tP C R ，D D R T - P C R ) ，抑制性差减杂交技术 ( s u p p r e s s i o ns u b t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o n ，S S H ) ，代表性差异分析技术( r e p r e s e n t a t i o n a l d i f f e r e n c ea n a l y s i s ，R D A ) 。 1 1 2 4 1m R N A 差异显示反转录P C R ( D D R T - P C R ) L i a n g 和P a r d e e 等人于1 9 9 2 年创用出一种差异比较方法，即m R N A 差异显示 反转录P C R ( m R N Ad i f f e r e n t i a ld i s p l a yr e v e r s et r a n s c r i p tP C R ，D D R T - P C R ) ( L i a n ga n d P a r d e e ，1 9 9 2 ) 。该方法是一种快速简单，用于比较两个或者多个不同组织之间基因 表达的差异。其基本原理是利用m R N A 的3 端含有p o l y ( A ) n ，以p o l y ( A ) n 为模板合成的单链e D N A 分子的末端就含有p o l y ( T ) n ，并且与p o l y ( T ) n 前面的 2 个碱基形成1 2 种不同的组合。在合成一条e D N A 链的过程中，3 端的引物设计 为( T ) l l M N ，其中M 代表除了T 以外的3 种不同的碱基，而N 代表4 种不同碱 基，利用这个引物就可以将任何混合种类的m R N A 合成为1 2 种不同的e D N A 分子。 在此基础上，再在m R N A 的5 端合成1 0 个碱基的随机引物( 2 4 0 组) 与3 端的 苎麻茎皮差减文库的构建及纤维发育相关基因的筛选 1 2 个不l 司的引物就能够组成2 8 8 0 个不l 司的组合。利户甘这些组合以个I 司组织或看小 同发育阶段的m R N A 为模板进行扩增，就能够得到约2 0 0 0 0 条不同的带型，这些 不同的带型就代表了不同的特定的m R N A 种类。如果在P C R 产物中加入放射性的 3 2 P 以标记，在聚丙烯酰胺的凝胶上就能够分离所有带型。一般情况下每一对引物 利用D D R T - P C R 能够产生数百条1 0 0 5 0 0 b p 带型。经过放射自显影以后，在X 线片 上就能够将这些加以区分是不是差异表达的c D N A 分子( 张献龙，植物生物技术， 2 0 0 4 ) 。D D R T - P C R 差别显示技术路线图如下： 回回 1 | 1 互互亘亟寸上 回回 土上 上 区亟圃 土 匪四 J r 匝圃 l 回收为探针l 土 图1 1D D R T - P C R 差别显示技术路线图( 改自张献龙，植物生物技术，2 0 0 4 ) F i g 1 1T h es k e t c hm a po fd i f f e r e n t i a ld i s p l a yr e v e r s et r a n s c r i p tP C R ( D D R T - P C R ) ( a d a p t e df r o mX i a n l o n gZ h a n g ，P l a n tB i o t e c h n o l o g y , 2 0 0 4 ) 1 1 2 4 2 抑制性差减杂交技术( S S H ) D i a t c h e n k o 等人建立的一种特异地分离与表达差异有关的E S T 序列的一种方 法，即抑制性差减杂交技术( s u p p r e s s i o ns u b t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o n ，s s n ) 。该方法是利 用与扣除杂交相似的原理，只不过是将c D N A 分子进行了限制性的切割，这样就可 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 以分离基因家族中的不同成员。S S H 方法的基本流程可以分为五步，首先是驱动方 和测试方c D N A 的合成与限制性酶切；接着将测试方c D N A 分子连接上不同的接头； 然后将连接有不同接头的2 个测试方的c D N A 分别于过量的驱动方c D N A 进行第一 次杂交；第一次杂交中的部分组分合并以后再与过量的驱动方c D N A 进行第二次杂 交；最后将这些含有不同接头引物的组分经过2 次P C R 扩增后就能够获得特异性 差异表达的E S T 序列。 S S H 流程示意图如下： 连接接头1 的连接接头2 的 毪娑挈2 巷黹驱赶组c D N A c 过量，笔娄：彗兰撒 w i t ha d a p t o r1D r i v e re D N A ( i ne x c e s s ) w i t ha d a p t o r2 【岛；囝岛 l 、I i 第一次杂交 J 曩【 n r s th y b r i d i z a t 沁n 囝二 b 【岛 c 口卜 r d L = 加 匹 岛 墨团一 h 口d 一口 c m 2 卜- - - - r dj L = 。口旧团 固团 加引物，P c R 扩增l A d dp r i m e r s 十四 A m p t L f “yb yP C R 暑o b a , t d 蒌J 茬J 攀：L - 菪增徽。n e 指数扩增E x p o n e n t i a la m p l i f i c a t i o n 图1 - 2 抑制性差减杂交( s s n ) 步骤示意图( D i a t c h e n k o c ta 1 ，1 9 9 6 ) F i g1 - 2T h e s k e t c hm a po f s u p p r c s s i o ns u b t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o n ( S S H ) ( D i a t c h e n k oe ta 1 ，1 9 9 6 ) 苎麻茎皮差减文库的构建及纤维发育相关基因的筛选 1 1 2 4 3 代表性差异分析技术( R D A ) 代表性差异分析技术( r e p r e s e n t a t i o n a ld i f f e r e n c ea n a l y s i s ，R D A ) ( 是在S S H 基础上 改良的一种方法，R D A 基本流程包括三个基本步骤：首先是驱动方和测试方双链 e D N A 的合成与接头的连接( 这里是驱动方和测试方都加接头) ，加有接头的e D N A 分子在进行末端补平后，加入引物进行P C R 扩增；接着扩增以后的c D N A 分子去除所 连接的接头引物，将去除接头以后的测试方c D N A i J n 上新的接头，而驱动方的e D N A 不与接头连接，利用过量的D r i v e re D N A 与T e s t e re D N A 进行液相杂交；最后这些杂 交产物再利用新的引物进行P C R 扩增后，就能够克隆到合适的载体中。 1 1 3 抑制性差减杂交( S S H ) 技术的应用 随着S S H 技术的不断成熟，S S H 方法已经成为研究差异表达的一种普遍的工具。 在植物上的应用主要包括两个方向：一是植物在各个生长发育阶段的组织特异性研 究；二是植物在逆境中的基因差异研究( 孙常青等，2 0 0 7 ) 。 1 1 3 1 应用S S H 技术分离植物组织特异性表达的基因 植物体生长发育过程中的任何一个阶段都是不同基因在不同时期表达的结果。 通过S S H 技术，在植物不同的发育阶段或同一植物的不同器官分别取样，建立抑制 性差减文库，就可以分离鉴定植物生长发育过程中特异基因的表达。 1 1 3 2 应用S S H 技术分离诱导型表达的抗性相关基因 植物在逆境胁迫条件下产生的环境适应性和抗性则多是诱导型基因表达的结 果。通过S S H 技术，将胁迫条件下的植物材料作为T e s t e r ，非胁迫条件下的植物材料 作为D r i v e r ，建立抑制性差减文库，通过筛选，就可以获得与抗性相关的差异表达基 因( 孙常青等，2 0 0 7 ) 。 1 2 表达序列标签( E S T ) 技术的研究进展 1 2 1 表达序列标签( E S T ) 的概念 E S T ( E x p r e s s e dS e q u e n c eT a g ，表达序列标签) 是一段e D N A 序列，长度一般为 3 0 0 b p 5 0 0 b p 是对e D N A 文库中的克隆进行测序所获得的。E S T 可以称之为基因的“窗 口 ，它代表了生物体基因在某一时空的表达，故称之为“表达序列标签”( B o u c h e z e ta l ，1 9 9 8 ；E w i n ge ta l ，1 9 9 9 ；A d a m se ta l ，1 9 9 2 ) 。 1 2 2 表达序列标签( E S T ) 技术的应用 E S T 技术是将e D N A 文库中的e D N A 克隆，进行测序后所获的E S T 序列与已知序 列的基因数据库进行比较，从而获得生物体在生长发育、繁殖分化、遗传变异、衰 _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ - 。 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 老死亡等一系列生命过程认识的技术( H a t e y e ta l ，1 9 9 8 ) 。 1 2 2 1 分离与鉴定新基因 由于在构建文库获得的E S T 序列，可以与各公共数据库中已知序列进行比较， 从而迅速准确地确定基因功能。当发现有价值E S T 序列时，可以在原文库中找到对 应的克隆。获得的全长c D N A 可以直接用于转基因等的研究。正是这种大规模测序 技术的广泛使用，新基因的发现数量也相应的呈现出明显的增长( V a s m a t z i se ta l ， 1 9 9 8 ) 。由于E S T 序列是来源于表达基因的一部分，以E S T 为基础的染色体物理图 谱的建立，可将基因确定在更狭小的染色体区段内，缩小了基因的候选范围，方便 了对候选基因的连锁分析。 1 2 2 2 基因的差异表达和表达谱研究 目前植物上利用E S T 技术研究的主流是基因差异表达，尤其是基因表达谱的研 究更是热点。植物体生长、发育、分化、衰老和抗逆等一系列生命现象都是基因的 时空差异表达造成的。而植物体在某一时期或某一阶段的基因表达数量通常只占全 部基因的一小部分。由于E S T 序列可以代表某一段m R N A 的信息，也就是某一个基 因的信息。那么，代表同一基因的E S T 序列数目越多，则表明该基因在某一特定时 期的表达量越多，反之，则表明该基因的表达丰度越低。 1 2 2 3 作为遗传标记和构建遗传学图谱 对染色体物理图的构建，需要大量单一的短序列( s e q u e n c et a g g e ds i t e ，S T S ) 作为 界标，因为大多数基因是单拷贝的，所以E S T 可以用来充当S T S ( G i l p i ne ta l ，1 9 9 7 ) ， 同样E S T 因为其高多态性片段可作为用来建立遗传连锁图谱( H a r u s h i m ae ta l ，1 9 9 8 ) 。 随着E S T 数量的迅速增长，E S T 逐步发展成为一个主要的寻找多态性分子标记的数据 来源，而且E S T 标记己成为动植物研究的基本工具。 1 2 2 4 作为外显子标签用于基因组诠释 给D N A 序列加上生物学信息就是基因组诠释。基因组诠释不仅可以识别D N A 序 列所编码的信息，还可以鉴定其所编码基因的特性。从某些基因的转录E S T 序列的 c D N A 文库和基因组序列的比较分析，可以准确地识别该基因外显子和内含子开始和 结束位置，大大加速了基因组功能注释的进程( S e k ie ta l ，2 0 0 2 ) 。 1 2 2 5D N A 芯片技术 芯片技术是近年来发展起来的一种研究功能基因组学的方法。核酸芯片主要有 基因组D N A 芯片和c D N A 芯片两类。现在E S T 已成为制备高密度e D N A 芯片微阵列研 究基因表达的主要材料来源( B e n t o ne ta l ，1 9 9 6 ；C a r u l l iJP e ta l ，1 9 9 8 ) 。基因芯片技 苎麻茎皮差减文库的构建及纤维发育相关摹因的筛选 术是在玻璃或硝酸纤维素膜上将D N A 克隆形成高密度阵列，然后与荧光标记探针杂 交，杂交信号经过自动处理后，就会反映出样品中基因的种类及丰度。制备D N A 芯 片很好的材料是己知功能的E S T ，随着更多基因组计划的开展和更多己知功能基因 的累积，将来只通过D N A 芯片技术而无需测序就可研究基因功能。 1 2 3 苎麻属植物E S T 的研究概况 至U 2 0 1 0 年3 月2 3 日N C B I 的d b E S T 数据库中己收录的来源于不同物种、不同组织 的E S T 序Y U 6 5 ，0 3 2 ，6 5 0 。其中最多的是人8 ，3 0 6 ，8 1 5 条和小鼠4 ，9 3 4 ，1 7 5 条的E S T 序列， 苎麻属植物只有4 1 8 条。 表1 1 苎麻属植物和一些重要生物的E S T 数量( 2 0 1 0 0 3 2 3 ) T a b l e1 1T h en u m b e ro fE S To fr a m i ea n do t h e ro r g a n i s m ( 2 010 0 3 2 3 ) 物种s p e c i e s E S T 数量 H o m os a p i e n s ( h u m a n ) M u sm u s c u l u s ( m o u s e ) Z e am a y s ( m a i z e ) A r a b i d o p s i st h a l i a n a ( t h a l e c r e s s ) G l y c i n em a x ( s o y b e a n ) O r