沙门菌检验.ppt

GB4789.42010食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验,沙门菌概况,沙门菌是1885年由Salmon氏等在猪霍乱流行时，分离出的猪霍乱沙门菌，由于Salmon氏对本属细菌的发现贡献卓越，故定名为沙门菌属。沙门菌属是肠杆菌科中最重要的病原菌。它是一群抗原结构、生化特性相似的革兰氏阴性杆菌。血清型繁多，目前已发现的沙氏菌有2500多个血清型和变种。我国自1911年至90年代初已有255个血清型。,虽然沙门菌的血清型很多，但多数国家从人体、动物和食品中分离出沙门菌仅约4050个血清型。而在一个国家中的一定时期只约有10个血清型是比较常见的。分类：伤寒沙门菌(伤寒、副伤寒)-传染病防治法中规定报告的乙类传染病。非伤寒沙门菌-食品卫生标准的检测的主要对象。,沙门菌的生物学特性,形态与染色性：革兰氏阴性杆菌，无芽胞,一般无荚膜。除鸡瘟沙门菌（S.pullorum)和鸡沙门菌(S.gallinarum)外均有动力。为周身鞭毛，并多数有菌毛。大小：13um0.51um。,营养需求不高，需氧或兼性厌氧。普通营养培养基上均能生长，能够利用柠檬酸盐作为碳源。在普通肠道选择性平板上基本上形成无色菌落。菌落中等大小，半透明，表面光滑，边缘整齐或呈锯齿状。不分解乳糖，大部分菌株产H2S，发酵葡萄糖产酸不产气。,培养与生化特性,最适培养温度为37，最适pH7.27.6。耐受胆盐，在粪便、土壤、食品、水中可生存5个月至二年之久。,沙门菌的分布,沙门菌广泛存在于自然环境中。通过沙门菌病患者或健康带菌的人和动物的排泄物污染环境和食品。易于污染的高危食物：畜禽肉类、蛋、奶及其制品。沙门菌在肉类中不分解蛋白质，不产生靛基质，所以当食品污染了沙门菌后，通常没有感官性状的改变。,沙门氏菌检验程序,目的：修复损伤的细菌细胞；方法：25g（mL）样品225mLBPW的无菌均质杯中，以8000r/min10000r/min均质1min2min，或置于盛有225mLBPW的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min2min。若样品为液态，不需要均质，振荡混匀。如使用均质袋，可直接进行培养。于361培养8h18h。,前增菌,无菌均质袋,轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1mL,转种于10mLTTB内,于421培养1824h。同时,另取1mL,转种于10mLSC内,于361培养1824h。分别用接种环取增菌液1环,划线接种于一个BS琼脂平板和一个XLD琼脂平板（或HE琼脂平板或显色培养基平板）。于361分别培养1824h(XLD琼脂平板、HE琼脂平板、显色培养基平板)或40h48h(BS琼脂平板)，观察各个平板上生长的菌落。为了最大可能的检出沙门氏菌，原则上必须使用两种以上选择性分离培养基。,选择性增菌与分离,分离培养基回收率测定（%）,典型菌落-BS,菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色,菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色的菌落,周围培养基不变。,国产BS,进口BS,典型菌落-HE,国产HE,进口HE,蓝绿色或蓝色,多数菌落中心黑色或几乎全黑色；有些菌株为黄色,中心黑色或几乎全黑色。,典型菌落-XLD,进口XLD,国产XLD,菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，或呈现全部黑色的菌落；有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心,典型菌落-CHRO,菌落为紫红色,(铜绿假单胞菌也呈紫红色，可以通过前增菌排除。所以推荐在检测中的前增菌用TTB。粉红色、深红色、干燥菌落、边缘锯齿状等均非沙门氏菌菌落。）,生化试验,自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，分别接种三糖铁（TSI）琼脂、赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板；取菌落一部分于斜面划线后穿刺底层。接种针在接种TSI后不要灭菌，直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于36培养1824h，必要时可延长至48h。,穿刺TSI方法,接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时，可直接接种蛋白胨水(供做靛基质试验)、尿素琼脂(pH7.2)、氰化钾(KCN)培养基，也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接种。于361培养18h24h,必要时可延长至48h。将已挑菌落的平板储存于25或室温至少保留24h，以备必要时复查。,沙门氏菌属的三糖铁和赖氨酸脱羧酶试验结果,该表显示：只有在三糖铁斜面产酸、底层产酸；同时赖氨酸阴性的菌株可排除。其他反应结果均有沙门菌属的可能，同时也均有不是沙门菌的可能。,TSI的反应赖氨酸脱羧酶试验,沙门氏菌属生化反应初步鉴别表,反应序号A1：为典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN和赖氨酸脱羧酶3项中有1项异常,按下表可判定为沙门氏菌。如有2项异常为非沙门氏菌。,沙门氏菌属生化反应初步鉴别表,反应序号2：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门菌靛基质阳性变体两项结果均为阳性；反应序号3：补做ONPG，ONPG阴性，同时赖氨酸脱羧酶阳性为沙门菌；但甲型副伤寒沙门菌赖氨酸脱羧酶为阴性。,2019/11/23,25,可编辑,沙门氏菌属各生化群的鉴别必要时按此表进行沙门菌生化群鉴定,沙门菌的增菌培养基,缓冲蛋白胨水(BPW)肉汤：是基础增菌培养基，不含任何抑制成分，有利于受损伤的沙门菌复苏。使受损伤的沙门菌细胞恢复到稳定的生理状态。一般用于加工食品或冷冻食品的前增菌。,沙门菌的增菌液,四硫磺酸钠煌绿增菌液(TTB)：含有胆盐，抑制革兰氏阳性球菌和部分大肠埃希氏菌的生长，而伤寒与付伤寒沙门菌仍能生长。亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC）：可对伤寒及其他沙门菌作选择性增菌，亚硒酸与蛋白胨中的含硫氨基酸结合，形成亚硒酸和硫的复合物，影响细菌硫代谢，从而抑制大肠埃希氏菌、肠球菌和变形杆菌的增殖。,沙门菌的分离培养基,亚硫酸铋琼脂（BS）：含有煌绿、亚硫酸铋能抑制大肠杆菌、变形杆菌和革兰氏阳性菌的生长，但对伤寒、副伤寒等沙门菌的生长无影响。伤寒杆菌及其他沙门菌能利用葡萄糖将亚硫酸铋还原成硫酸铋，形成黑色菌落周围绕有黑色和棕色的环，对光观察可见有金属光泽。该培养基制备过程不宜过分加热，以免降低其选择性，应在临用时配制，超过48h不宜使用。注：此培养基在制作过程中过分加热可使培养基的选择性降低，与TTB或SC合用可获得更高的检出率。,沙门菌的分离培养基,HE琼脂：在保证细菌所需营养的基础上，加入了一些抑制剂，如：胆盐、柠檬酸盐、去氧胆酸钠等，可抑制某些肠道致病菌和革兰氏阳性菌的生长，但对革兰氏阴性的肠道致病菌则无抑制作用。,沙门菌在HE琼脂上的菌落形态：蓝绿色或蓝色，多数菌株产H2S，中心呈黑色或几乎全黑色。,沙门菌的分离培养基,XLD琼脂：培养基中含有去氧胆酸钠作指示剂，在该浓度下的去氧胆酸钠也同时作为大肠埃希氏菌的抑制剂，而不影响沙门菌属和志贺菌属的生长。XLD培养基分离沙门菌和志贺菌的敏感性超过了传统的培养基，如：EMB、SS、BS。因这些培养基尚有抑制志贺菌属生长的潜在因素，故本培养基是分离鉴定沙门菌及志贺菌属的可靠培养基。在国外广泛使用。,分离培养中的注意要点,非典型的沙门氏菌菌落形态：不存在典型的或可疑的沙门氏菌菌落时，按如下步骤检验非典型的沙门氏菌菌落。HE和XLD琼脂：非典型的沙门氏菌在HE和XLD琼脂上呈黄色菌落，带或不带黑色中心。HE和XLD平板经242小时培养后，没有典型的沙门氏菌菌落，则挑取2个或更多个非典型的沙门氏菌菌落。,BS琼脂：某些非典型菌株产生绿色菌落，其周围培养基稍微或不呈暗色。如果BS平板培养242小时后，没有出现典型菌落，则不挑取任何菌落，让平板继续培养242小时。如果经482小时培养后，仍没有典型或可疑的菌落出现，则挑取2个或更多个非典型的菌落。,沙门菌显色培养基,沙门菌显色培养基主要用于快速筛选、分离沙门菌。其基本原理：利用沙门菌特异性酶与显色基团的特有反应，使色原游离出来，沙门菌在培养基上呈紫色或紫红色。而大肠杆菌等其他肠道杆菌呈蓝绿色。,色原-特定结合物,色原特定结合物,沙门菌辛酸脂酶,无色,显色,游离,可疑菌落的生化鉴定,自选择性琼脂平板（至少2种选择性平板）上直接挑取2个以上可疑菌落，分别接种三糖铁琼脂(TSI)。TSI的主要成分：蛋白胨、乳糖、蔗糖、葡萄糖、硫酸亚铁铵、硫代硫酸钠、酚红、琼脂。在TSI琼脂中有2个指示剂体系：-酚红:在碱性环境中呈红色；在酸性环境中呈黄色。-硫酸亚铁铵：是硫化氢的指示剂，可与硫化氢反应生成硫化铁呈黑色。硫代硫酸钠可防止硫化氢氧化形成S-S基而影响反应。,沙门菌在TSI琼脂上的反应,赖氨酸脱羧酶试验,赖氨酸脱羧酶试验培养基：蛋白胨、酵母浸膏、葡萄糖、溴麝香草酚蓝（紫）。原理：细菌使氨基酸脱羧，产生胺类，使培养基变碱，颜色不改变。沙门菌的反应：阳性。意义：柠檬酸杆菌、志贺菌均为阴性；埃希氏菌不定。注：本试验的阳性反应为培养基不改变颜色,而培养基变黄色者为阴性反应。本试验一定要设空白对照。培养基需用液体石蜡封盖，阻止空气的氧化作用。,靛基质试验,靛基质试验的培养基：蛋白胨水。原理：细菌分解蛋白胨中色氨酸，生成靛基质，与对二氨基苯甲醛作用，形成玫瑰吲哚而呈红色。沙门菌的反应：阴性反应或阳性（靛基质阳性变种）。,尿素酶试验,尿素培养基：蛋白胨、葡萄糖、酚红、氯化钠、磷酸二氢钾、尿素，pH7.2。原理：含尿素酶细菌能分解尿素，产生大量的氨，使培养基呈碱性，指示剂变红。沙门菌的反应：阴性。,氰化钾试验,氰化钾试验培养基：蛋白胨、磷酸盐缓冲对、氯化钠、氰化钾。原理：氰化钾是剧毒药物，可抑制某些细菌的呼吸酶系统，使这些酶失去活性，细菌的生长因此受到抑制。而某些细菌可对氰化钾产生抗性，能在氰化钾培养中生长。本试验常用于沙门菌与柠檬酸杆菌的鉴定。沙门菌生长情况：阴性（不生长）。注：本试验必需设置对照管（不加氰化钾），若对照管细菌生长良好，试验管细菌不生长，可判定为阴性。若对照管与试验管均无细菌生长，则应重复试验。试验失败的主要原因是封口不严，氰化钾逐渐分解，生成氢氰酸气体逸出，以致药物浓度降低细菌生长，呈假阳性反应。,沙门菌生化鉴定培养基-半乳糖苷酶(ONPG)试验,-半乳糖苷(ONPG)培养基：蛋白胨、ONPG。原理：大肠杆菌含有-半乳糖苷酶，能分解ONPG，使培养基呈黄色。沙门菌的反应：阴性。注：本试验主要用于不产H2S的沙门菌与大肠杆菌的判定,沙门菌生化鉴定的主要试验项目,糖发酵试验：三糖铁琼脂(葡萄糖、乳糖、蔗糖)、甘露醇、山梨醇、卫茅醇、水杨苷、ONPG。氨基酸和蛋白质代谢试验：靛基质、赖氨酸脱羧酶、尿素酶。碳源和氮源利用试验：丙二酸盐。其他生化试验：氰化钾。,沙门菌在API20E的典型反应,VITEKGNI,沙门菌的血清学鉴定,培养基：一般使用1.5%的琼脂斜面作纯培养，取培养物(抗原)作玻片凝集试验。国内使用的沙门菌O抗原