带你认识真正的talent技术-斯丹赛talent技术讲座.ppt

上海斯丹赛生物技术有限公司,SIDANSAIBiotechnology,InnovatoronTALENtechnologyandStemCellresearch,TALEN技术在基因功能研究及ips领域中的应用,靶向基因修饰,What?通过某种方法将一个特定靶基因破坏或失活，使其失去原有的功能。Why?基因敲除是寻找、证明基因功能过程中的必要步骤之一，是基因工程和基因治疗的重要手段。Way?如何基因敲除（Knockout）,基因敲除的方法,同源重组(HomologousRecombination)依赖DNA分子的互补性，经典基因敲除方法特点：效率低（1per106cells），实验周期长RNA干扰(RNAinterference)依赖RNA分子的互补性：高效性，特异性；特点：临时性，基因沉默而非敲除；,锌指核糖核酸酶（ZFN）20世纪末DNA识别域(ZFP)+非特异性核酸内切酶构成（FokI),依赖DNA识别域的特异性：效率高有脱靶现象，专利被垄断,基因敲除的方法,TALEdomain:DNA识别域TALE，植物病原体黄单胞菌Xantomonas用于调控宿主基因由34的氨基酸长度的重复单位构成第12，13位点氨基酸（repeat-variabledi-residue，RVD）不同RVD决定识别位点不同Nucleasedomain:DNA剪切域FokI，发现于海床黄杆菌Flavobacteriumokeanokoites采取其非特异性DNA剪切结构域形成二聚体时发生剪切,N,C,TALE,FokI,LTPDAVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHG,NIAHDCNGTNNG,ATTCTGCTAACTCATAC,新的里程碑技术：TALEN(transcriptionactivator-likeeffectornuclease，2010年底),TALEN切割双链,5,5,3,3,左臂,右臂,FokI聚合,DSBDoublestrandBreak,Non-homologousEndJoining(NHEJ),HomologousRecombination(HR),无模板,有模板,GeneDisruption,Geneinsertion,Genereplacement,TALEN取代了过去,构建TALEN质粒,如何将这些高度重复的DNA片段连接起来？,TALEN的组装(GoldenGate),PCR3步,Digest2步,Ligate2步,一步法连接,只要4-5小时，这些片段就全部连接起来了,一步连接,1,2,3,6,5,4,9,13,7,10,12,16,8,14,11,15,17,18,FastTALETM连接TALEN,N,C,N,C,TALENmodulesat9positions,TALENbackbonevectors,TALENassembledvectors,Promoter,FokI,Promoter,FokI,x4,x16,x4,x16,x4,x16,x4,x16,x4,x16,x4,x16,x16,x16,x4,x16,Position1,Position2,Position3,Position4,Position5,Position6,Position7,Position8,Position9,1/2,9x12dimers,7x4monomersCompletelibrary:172,CMV,EF1a,Ubi,35S,T7,SP6,MaximumRVDs:19MinimumRVDs:12,多种TALEN骨架载体，满足不同物种需求,第一组载体：干细胞专用打靶载体，采用EF1启动子。第二组载体：构建动物模型专用载体，含有原核表达启动子sp6或T7，便于体外转录。第三组载体：普通细胞打靶载体，采用CMV启动子。第四组载体：植物专用打靶载体，采用ubiqutin或35s启动子。,TALEN质粒构建流程,靶点设计,挑克隆细菌培养,DNA质粒抽提酶切鉴定,得到测序正确质粒,TALEN连接,细菌转化,质粒测序,Day1,Day2,Day3,Day4,4天得到构建正确的TALEN质粒！简单、快速！,靶点设计,DecideTALENtarget(leftarm/rightarm)TALE-NT2.0/DNASTAR,Spacer12-21bp,5,5,3,3,TALEN连接,1.设计序列，选择模块,2.加样，进行连接,4-5h完成,转化至感受态细胞在Kana+LB平板中培养,细菌转化,挑单克隆，细菌培养,挑5-12个克隆（连接效率50%）Kana+LB培养液,单克隆菌落,将单菌落接入含5mlKa+的LB培养液的试管中,DNA质粒抽提，酶切鉴定,DNA质粒小抽提使用BamHI+PstI双酶切，植物载体采用BamHI+SpeI,target:15nt,target:18nt,左臂,右臂,1kbMarker,1kbMarker,Digestion,Digestion,Asssemblylength:15x102=1530,Asssemblylength:18x102=1836,Onbackbone:531,Totallength:1530+531=2061,Onbackbone:531,Totallength:1836+531=2367,1个单模块（由34个氨基酸102个碱基组成）识别一个碱基,上游引物:5-CTCCCCTTCAGCTGGACAC-3下游引物:5-AGCTGGGCCACGATTGAC-3,质粒测序,测序结果比对,标准序列,测序结果,得到测序正确质粒,TALEN的实际应用,DNA水平的基因敲除,DNA水平的定点插入,DNA水平的单碱基修饰（点突变）,建立基因敲除/敲入的真核细胞系建立基因敲除/敲入的真核生物模型,DNA水平的miRNA敲除,应用实例1细胞模型,Hela细胞中XX基因敲除的稳转系建立：项目执行时长2个月,设计TALEN识别序列；构建TALEN载体；测序验证质粒正确性,实验流程：,序列100%正确,脂质体转染入Hela细胞中；puromycin药物筛选3天,收集筛选后剩余的部分细胞，抽提基因组DNA,进行PCR,PCR产物送测序,比对测序结果，初步确认TALEN活性,续上,大于53%（每100个细胞中有53个细胞发生碱基突变）,PCR产物TA克隆、单克隆测序确定打靶效率,续上,2019/11/22,最终挑选出阳性单细胞克隆，扩增，保存，稳定遗传系建立成功,消化细胞呈单细胞，接种于96孔板中，待单细胞克隆长大后，同上进行鉴定,部分单细胞克隆测序结果：,单克隆鉴定结果表明：基因改变类型包括插入和缺失两种形式，造成基因移码突变，成功构建稳转系。,挑选至少50个单克隆测序,，鉴定出双拷贝敲除的单克隆,续上,Knock-in载体构建,构建knock-in同源重组载体,WT,Donor,提高同源重组效率同源臂构建简单，500-1000bp利用抗性基因快速进行筛选,打靶示意图（基因敲入）,DirkHockemeyer,HaoyiWang,SamiraKiani.GeneticengineeringofhumanESandiPScellsusingTALEnucleases,NatBiotechnol.;29(8):731734.,打靶示意图（定点突变）,SuMiChoi,YonghakKim,efficientdrugscreeningandgenecorrectionfortreatingliverdiseaseusingpatient-specificstemcells.HEP,12-2140.,打靶示意图（定点缺失）,打靶效率经验参考,建立knock-out细胞系（双拷贝敲除）：293T，hela细胞：建系成功率100%，目前成功建系19个，打靶效率约为30%-70%，最短耗时2个月ES/iPS细胞：建系成功率100%，目前成功建系7个，打靶效率约为20%-50%，最短耗时4个月,数据统计至2013.07月,打靶效率经验参考,建立knock-in细胞系（单拷贝敲入）：293T、hela细胞等：建系成功率100%，目前已成功建系6个，打靶效率约为20%-55%，最短耗时3个月ES/iPS细胞：建系成功率100%，目前已成功建系2个，最短耗时5.5个月，打靶效率约为10%-28%,数据统计至2013.07月,成功实例2动物模型斑马鱼,Zebrafish-geneA,WT,TALEN,580bp,Zebrafish-geneA(KpnI),WT,TALEN,580bp,401bp,179bp,GenomicPCR,Restrictiveenzymedigest,斑马鱼内XX基因敲除,结果回馈,我方设计TALEN识别序列；提供最终的TALEN质粒,TALEN质粒线性化；体外转录,显微注射一细胞期受精卵,48h后收集，抽提胚胎基因组DNA,PCR扩增，酶切看结果,打靶效率为80%以上,应用实例3动物模型小鼠,1.设计构建TALEN打靶载2.细胞水平TALEN活性检测3.体外转录生成mRNA4.往受精卵注射mRNA5.得到嵌合体小鼠（F0）6.得到F1heterozygote7.得到F2homozygote,1.设计构建TALEN及KIdonor载体2.细胞水平TALEN活性检测,基因敲除小鼠,基因敲入小鼠,3.体外转录生成mRNA4.往受精卵注射mRNA/DNA混合物,3.建立ES基因敲入细胞系4.将ES细胞系注射至囊胚,5.得到嵌合体小鼠（F0）6.得到F1heterozygote7.得到F2homozygote,应用实例3动物模型小鼠,PNAS.2013Mar;110(10):3782-7,应用I:基因敲除,TALEN的实际应用,NatBiotechnol2013Jan;31(1):23-4,Phenotypicanalysisofgene-specificknockoutmicehastransformedourunderstandingofinvivogenefunctions.Generationofknockoutmice,however,remainsatime-consumingandexpensiveprocess.Transcriptionactivator-like(TAL)effectornucleases(TALENs)arehighlyeffectiveininducingmutationsatspecificgenomicloci,andconsequentlyTALEN-mediatedmutagenesisinzygotesisapotentialalternativetoconventionalgenetargetinginmice.,设计构建TALEN打靶载体细胞水平TALEN活性检测体外转录生成mRNA往受精卵注射mRNA嵌合体小鼠（F0）F1heterozygoteF2homozygote,应用II：基因敲入,TALEN的实际应用,ThefunctionalstudyofYchromosomegeneshasbeenhinderedbyalackofmousemodelswithspecificYchromosomemutations.Weusedtranscriptionactivator-likeeffectornuclease(TALEN)-mediatedgeneeditinginmouseembryonicstemcells(mESCs)toproducemicewithtargetedgenedisruptionsandinsertionsintwoY-linkedgenesSryandUty.TALEN-mediatedgeneeditingisausefultoolfordissectingthebiologyoftheYchromosome.,NatBiotechnol2013Jan;31(6):530-32,利用TALEN技术建立ES敲除/敲入细胞系,建立动物模型,四倍体细胞补偿法,验证基因表达水平,应用III:基因定点修复,TALEN的实际应用,应用:DNA水平的miRNA敲除,TALEN的实际应用,思路1：针对miRNA的关键识别序列”seed”sequence特异性设计一对TALEN，实现miRNA的敲除。,思路2:在miRNA前体发夹结构的上下游处分别设计一对TALEN，利用TALEN将包含发夹结构在内的DNA片段剪切致缺失，从而实现对miRNA的敲除。,PlOSone8(9),2013(5),TALEN广泛应用,BiotechnolBioeng.2013Mar18.doi:10.1002/bit.24890,拟南芥,短兵草,牛,蟋蟀,果蝇,仓鼠,人,青鳉,小鼠,线虫,大鼠,水稻,蚕,烟草,酵母,斑马鱼,斯丹赛部分成功案例,北京大学张老师成功建立人ES细胞某基因敲除系北京大学尹老师成功在人结肠癌细胞系以及Hela细胞系中打靶成功，打靶效率约为30%长征医院周老师成功建立乳腺癌细胞某基因敲入细胞系清华大学罗老师成功建立小鼠ES细胞某基因敲入系中国科学院生物物理研究所范老师成功建立小鼠MEF细胞某基因敲除系上海生化所宋老师利用培训班拿到的平板直接建立仓鼠细胞某基因敲除系；,细胞建系成功案例,斯丹赛部分成功案例,华东师范大学王老师课题组针对5个靶基因分别构建了2X3组合的TALEN质粒，目前已成功得到其中1个基因敲除的小鼠模型（打靶效率30%：10只F0代小鼠中有3只突变体）；同时另4个基因已得到经细胞水平验证后的高活性TALEN质粒，并正在后续建模中。南京大学官老师成功得到某基因敲除小鼠模型，打靶效率12.7%南方模式费老师成功得到6个基因敲除小鼠模型华东师范大学李老师成功得到某基因敲除小鼠模型.,小鼠建模成功案例,斯丹赛部分成功案例,中国科学院水生生物研究所肖老师成功得到斑马鱼F1代杂合子，效率为14/16，并且后续得到F2代纯合子复旦大学姚老师成功得到斑马鱼某基因敲除的F1代杂合体健康所荆老师成功的得到了斑马鱼突变体，打靶效率达20%；华中科技大学刘老师成功得到斑马鱼某基因敲除的突变体；,斑马鱼建模成功案例,斯丹赛部分成功案例,中国科学院生物物理研究所龚老师成功检测到某基因敲入的F0代果蝇突变体；北京生命科学研究所王老师成功获得F0突变体果蝇；珠海威康健生物科技有限公司杨老师成功获得F0突变体果蝇；湖南师范大学邓老师成功获得F0突变体果蝇,果蝇建模成功案例,专业、完善的技术保障,保证客户得到一对高活性TALEN质粒并且最终建系/建模成功；拥有强大的技术团体，提供全程免费的技术支持；协助客户完善TALEN平台的构建；若发生建系/建模失败，则全额退款。,TALEN在iPS领域的应用,用于iPS建立的体细胞来源,皮肤成纤维细胞骨髓来源的细胞脂肪干细胞肠上皮细胞尿液细胞-无创！毛囊间充质干细胞胸腺来源的细胞血液细胞。,一切体细胞皆有可能！,皮肤成纤维细胞骨髓来源细胞脂肪干细胞毛囊间充质干细胞肠上皮细胞尿液细胞.,Oct4Sox2Klf4C-myc,TALEN技术,iPS细胞,基因敲除iPS细胞,定点修复iPS细胞,定向分化,体外研究：疾病模型建立;发病过程研究;疾病机理研究;药物筛选,体内应用,再生医学,疾病模型用于疾病机理研究,ips细胞系,基因敲除的ips细胞系,不同组织,研究基因功能及和疾病的影响,TALEN技术,定向分化,病人样本,APOB:缺失降低HCV病毒的复制效率SORT1：降低肝细胞ApoB分泌；影响脂肪细胞中葡萄糖转运；介导运动神经元的死亡AKT2：调节肝细胞及脂肪细胞中的胰岛素通路和糖代谢过程PLIN1：影响脂肪细胞中脂质分解过程,WereportheretheuseofTALENstorapidlyandefcientlygeneratemutantallelesof15genesinculturedsomaticcellsorhumanpluripotentstemcells,thelatterforwhichwedifferentiatedboththetargetedlinesandisogeniccontrollinesintovariousmetaboliccelltypes.Wedemonst