猪BMP-6基因的克隆与表达、多态性与其生产性状相关性分析-硕士论文

C l a s s i f i e dI n d e x ： U D C ： Di s s e r t a t i o nf o rt h eM a s t e rD e g r e e M O L E C U L A RC L O N 烈GA N D E X P I 冱SS I O N ，G E N E T I CV A 砌A T I O N A N A L Y S I SA N DC O R R E L A T I O NM T H P R O D U C T I O NT R A I T SO FB 仫P 一6G E N EI N S W E C a n d i d a t e ： S u p e r v i s o r ： A c a d e m i c D e g r e eA p p l i e d f o r ： S p e c i a l i t y ： D a t eo f0 r a lE x a m i n a t i o n ： U n i v e r s i t y ： 3 r a n gS h a o c h e n g P r o f L i uD i M a s t e ro f A g r i c u l t u r e A n i m a lG e n e t i c sa n dB r e e d i n g J u n e 2 0 l O N o r t h e a s tA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y k 曲 册Y 脚1 删7 脚8 删7 脚1 舢舢1 f 8 f f f 目录 中文摘要I 英文摘要I l 引言一l 1 18 彳p 6 基因的研究进展l 1 1 1B M P s 家族概况“1 1 1 2B M P s 的信号传导途径l 1 1 3B M 罕 - 6 基因的发现2 1 1 4B M T - 6 基因的结构：2 1 1 5B M P - 6 基因的生物学功能3 1 1 6B M P - 6 基因的应用前景。5 1 2 实时荧光定量P C R 技术6 1 2 1 实时荧光定量P C R 原理6 1 2 2 荧光定量P C R 的定量方法7 1 2 32 以c T 方法的原理8 1 2 4 实时荧光定量P C R 技术的应用9 1 3 实验目的及意义9 2 材料与方法1 0 2 1 实验材料1 0 2 1 1 实验用组织样1 0 2 1 2 主要药品和酶1 0 2 1 3 主要仪器设备1 l 2 1 4 缓冲液及主要溶液的配制1 l 2 2 实验方法1 2 2 2 1 耳组织样D N A 的提取及检测1 2 2 2 2 组织样总R N A 的提取与检测13 2 2 3 猪B 么P - 6 基因的克隆1 4 2 2 4P C R S S C P 检测1 7 2 2 5 猪B M P - 6 基因的表达分析2 2 2 2 6 主要分子生物学软件及统计分析软件2 4 2 2 7 相关生物信息学网站2 4 3 结果与分析2 5 3 1 猪B M P - 6 基因的克隆和序列分析2 5 3 1 1 总m R N A 的提取2 5 3 1 2 克隆2 5 3 1 38 必p 6 基冈的生物信息学分析2 7 3 2B Z P - 6 的多态性分析2 9 东北农业大学农学硕上学位论文 3 2 1 引物B M P s 2 0 6 和B M P a 2 0 7 的单核茁酸多态性分析2 9 3 2 2 引物B M P s 2 1 5 和B M P R 的单核苷酸多态性分析3 l 3 38 织6 基因的定量检测。3 4 3 3 1R N A 的质量检测。3 4 3 3 2 扩增曲线及溶解曲线的绘制3 4 3 3 3 定量分析3 6 4 讨论3 8 4 1 猪8 很6 基因的克隆3 8 4 2 猪B M P - 6 基因的多态性分析3 8 4 3 猪8 俨二6 基因表达规律分析3 9 4 4 关于荧光定量的讨论。3 9 5 结论4 0 致谢4 1 参考文献4 2 攻读硕士学位期间发表的学术论文4 4 I l r 专 +j 一 C N O T E N T S C O N T E N T S C h i n s e sA b s t r a c t I E n g l i s hA b s t r a c t H I 1I n t r o d u c t i o n 1 1 1R e s e a r c hd e v e l o p m e n to f Z i L Z P 一6g e n e 。l 1 1 1B I P Sf a m i l y 。l 1 1 2S i g n a lt r a n s d u c t i o np a t h w a yo f B M P s 1 1 1 3d i s c o v e r yo f B M P 一6 9 e n e 2 1 1 4c o n s t r u c t i o no f8 彳r 尸- 6g e n e 2 1 1 5B i o l o g i c a lf u n c t i o no f 上n 4 P 一6g e n e 3 1 1 6P r o s p e c t so f B M P - 6 g e n e 5 1 ：! l t e a lt i m eP C R 6 1 2 1P r i n c i p l eo f R e a lt i m eP C R 6 1 2 2D e t e c t i o nm e t h o d so f R e a lt i m eP C R 7 1 2 3P r i n c i p l eo f2 - AA C Tm e t h o d 8 1 2 4A p p l i c a t i o no f R e a lt i m eP C R 9 1 3O b j e c t i o na n ds i g n i f i c a t i o n 9 2M a t e r i a l sa n dM e t h o d s 1 ( ) 2 1M a t e r i a l s 1 0 2 1 1E x p e r i m e n t a lt i s s u eS a m p l e 1 0 2 1 2M a i nr e a g e n t sa n dd r u g s 10 2 1 3M a i na p p a r a t u s 1l 2 1 4B u f f e r sa n ds o l u t i o n s l1 2 2M e t h o d s 1 2 2 2 1D N Ae x t r a c t i o n 1 2 2 2 2T b t a lR N Ae x t r a c t i o n 1 3 2 2 3C l o n i n go fP i gB M P - 6 g e n e 14 2 2 4P C R S S C Pd e t e c t i o n l7 2 2 5E x p r e s s i o na n a l y s i so fp i gB M P - 6g e n e 2 2 2 2 6M a i ns o f t w a r e 2 3 2 2 7M a i nb i o i n f o r m a t i cw e b 2 4 3R e s u l Ba n da n a l y s i s 2 5 3 1C l o n i n ga n ds e q u e n c ea n a l y s i so f p i g8 4 ，尸6g e n e 2 5 3 1 1C l o n e 2 5 3 1 2B i o i n f o r m a t i c sa n a l y s i so f B M P - 6g e n e 2 5 3 2P o l y m o r p h i cA n a l y s i so f B M P 一6g e n e 2 7 3 2 1S N P A n a l y s i so fp r i m e rB M 口s 2 0 6a n dB 伊a 2 0 7 2 9 I I I 3 2 2S h i p A n a l y s i so f p d m e r B M P s 2 1 5a n dB M P - R 2 9 3 3Q u a n t i t a t i v ed e t e c t i o no f B M P - 6g e n e 31 3 3 1Q u a l i t yi n s e p c t i o no f R N A 3 4 3 3 2T h ep l o t so f a n p l i f i c a t i o na n dd i s s o c i a t i o n 3 4 3 3 3Q u a n t i t ya n a l y s i s 3 4 4D i s c u s s i o n s 3 8 4 1C l o n i n gA n a l y s i so fp i gB M P - 6g e n e 。3 8 4 2P o l y m o r p h i s ma n a l y s i so f p i gB M P 一6g e n e “3 8 4 3E x p r e s s i o nr e u l a r i t yo f p i gB M P 一6g e n e 3 9 4 4D i s c u s s i o no f R e a lt i m eP C R 3 9 5C o n c l u s i o n 4 0 A c k n o w l e d g e m e n t 4 1 R e f e r e n c e s 。4 3 A c a d e m i cp a p e rp u b l i s h e dd u r i n gt h em a s t e rd e g r e e 4 4 l V 研究生学位论文独创声明和使用授权书 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谓 的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 ( 洼! 麴遗查墓丝益塞挂别童塑的! 奎拦亘窒2 或其他教育机构的学位或证 书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：黼日期2 口肜年月歹日学位论文作者签名。制险 日期么口年夕月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密 后适用本授权书) 学位论文作者签名：耪 导师签名： 日凝z e ? o 年1 | ；A ) B 日期：z 汐矽年石彤日 I，j一 ，|】ii 摘要 摘要 B M P 6 所编码的蛋白质是一种骨形态发生蛋白( b o n em o r p h o g e n e t i cp r o t e i n s ，B M P s ) 。这 种蛋白属于转化生长因子1 3 ( t r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o r1 3 ，T G F - 1 3 ) 超家族成员。该家族成员无 论在体I 内( i nv i v o ) 还是在离体( i nv i t r o ) 实验中都表现出具有调节成骨细胞和成软骨细胞的分 化，诱导异位骨形成，促进骨折愈合，及控制哺乳动物骨骼不同形态特征形成的功能。随着 研究的深入，研究者发现B M P s 的生物学作用不仅限于骨的发育和形成，而且几乎涉及全身 所有系统，包括心血管、胃肠、呼吸、泌尿生殖、体被及神经系统的胚胎发育、生长和分化。 使这个基因在人类医学研究和动物繁殖育种研究工作中越来越受到重视。本实验旨在研究和 阐述B M P - 6 基因在猪这个重要家眚中的结构、表达情况和其对母猪繁殖性状的影响。 本实验首次克隆了猪的B M P 一6 基因全C D S 序列，并利用生物信息学的方法对其结构功 能域及分子进化进行分析。利用P C R o S S C P 方法对其进行单核苷酸多态性分析，探讨不同基 因型在种间的分布规律；采用R e a lt i m e P C R 方法研究了其组织表达规律。主要研究结果如 下： 1 首次克隆了猪的B M P 6 基因全C D S 序列( G e n e b a n kN M0 0 1 1 6 8 0 0 1 ) 。序列总长为 1 5 1 8 b p ，预计编码5 0 5 个氨基酸残基。 2 使用P C R S S C P 方法在B M P 6 基因C D S 上检测出2 个多态位点，其中引物B M P s 2 0 6 和B M P a 2 0 7 所检测出的多态位点为同义突变。引物B M P s 2 1 5 和B M P R 所检测出的突变为 错义突变。 3 野猪与北京黑猪、法系大白猪之间差异极显著( P 0 0 1 ) ，与长白猪差异显著 ( 0 。0 1 P 0 0 5 ) 。 4 将检测到的错意突变多态位点与产仔数与产活仔数这两项繁殖性状进行相关性分析 后发现，各基因型对这两项繁殖性状有显著影响。其中A B 型最高，平均为1 3 0 0 头胎，比 最低的B B 型平均多6 7 1 头月瞻，差异显著( P 0 0 1 ) 。而对于产活仔数，A A 型最高，平均1 0 8 l 头胎，比最低的B B 型平均多3 6 9 头胎。差异显著( P O 0 1 ) 。 5 使用染料法R e a l - t i m eP C R 方法对B M P 6 基因在各组织中的表达情况进行了分析。 B M P - 6 在各组织中均有表达，且表达量在小肠、肌肉和软骨中最高。 关键词猪：B M P 6 ：P C R S S C P ；R e a lt i m e P C R ；繁殖性状 一 A b s t r a c t M o l e c u l a r C l o n i n ga n dE x p r e s s i o n ，G e n e t i cV a r i a t i o n A n a l y s i sa n d c o r r e l a t i o nw i t hp r o d u c t i o nt r a i t so f B M P 6G e n ei nS w i n e A b s t r a c t T h ee n c o d e dp r o t e i no fB M P 一6g e n ei so n eo fb o n em o r p h o g e n e t i cp r o t e i n s T h i sk i n do f p r o t e i n sb e l o n g st ot h er a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o r1 3f a m i l y M e m b e r so ft h i sf a m i l yC a l lr e g u l a t e d i f f e r e n t i a t i o no fO s t e o b l a s t sa n dC h o n d r o g e n i c ，I n d u c et h ef o r m a t i o no fe c t o p i cb o n e ，p r o m o t e b o n e h e a l i n ga n d o v e r m a s t e ro ft h ef o r m a t i o no fd i f f e r e n t m o r p h o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s m a m m a l i a nb o n ei nv i v oo ri nv i t r o 、阴t had e t a i l e ds t u d y , t h e yf o u n dt h eb i o l o g i c a lf u n c t i o no f B M P sf a m i l yi sn o to n l yl i m i t e dt Od e v e l o p m e n ta n dt h ef o r m a t i o no fb o n e ，b u ta l s oi n v o l v e d a l m o s ta l lb e d ys y s t e m ，i n c l u d i n gc a r d i o v a s c u l a r , g a s t r o i n t e s t i n a l ，r e s p i r a t o r y , u r o g e n i t a l ，h a i r a l s o i n v o l v i n gg r o w t ha n dd i f f e r e n t i a t i o no fn e r v o u ss y s t e m ，w h i c hm a k eB M P - 6g e n eg e tm o r ea n d m o r ea t t e n t i o ni nh u m a nm e d i c i n ea n da n i m a lb r e e d i n gf i e l d I n t e n t i o no ft h i ss t u d yi su n d e r s t a n d a n de x p l a i nt h ec o n s t r u c t i o n ，e x p r e s s i o na n da f f e c to f r e p r o d u c t i v et r a i t so f B M P 6g e n ei nS O W T h i ss t u d yf i r s tc l o n e dt h ef u l l - l e n g t ho fB M P - 6C D S s e q u e n c eo fs w i n e ，a n a l y z ei t ss t r u c t u r e f u n c t i o na n dm o l e c u l a re v o l u t i o nb yb i o i n f o r m a t i c s D e t e c tt h ep o l y m o r p h i s m sa n da p p r o a c ht h e d i s t r i b u t i o no fd i f f e r e n ta l l e l eb yP C R - S S C Pt e c h n o l o g y , a n ds t u d yd i s t r i b u t i o no fd i f f e r e n t g e n o t y p e si ns w i n e ，a n dw h a ta f f e c t i o nt h e yd o n ea b o u tl i t t e rs i z ea n dn u m b e rb o m a l i v ei nS O W B y u s i n gR e a l - T i m eP C R , s t u d ye x p r e s s i o no f B M P - 6g e n ei nd i f f e r e n tt i s s u e s T h em a i nr e s u l t sa r ea s f o l l o w ： 1 F o rt h ef i r s tt i m e ，w ec l o n e dt h ef u l l - l e n g t ho fB M P - 6C D Ss e q u e n c e ( G e n e b a n k N M 一0 0 11 6 8 0 0 1 ) F u l l - l e n g t ho f s w i n eB M P - 6 9 e n ei sc o m p o s e d o f l 5 1 8 b pe n c o d i n g5 0 5 A A 2 T w op o l y m o r p h i s m sf o u n di nC D Ss e q u e n c eo fs w i nB M P 一6g e n eb yu s i n gP C R S S C P O n eo ft h e m ，w h i c hd e t e c t e db yp r i m e rB M P s 2 0 6a n dB M P - a 2 0 7 ，i ss y n o n y m o u sm u t a t i o n ， A n o t h e r , w h i c hd e t e c t e db yp r i m e rB M P - s 215a n dB M P R ，i sm u t a t i o nw r o n g l yi t a l y 3 T h ep o l y m o r p h i s m ，w h i c hd e t e c t e db yp r i m e rB M P - s 215a n dB M P Ri sa s s o c i a t e dw i t h l i t t e rs i z ea n dt h en u m b e rb o ma l i v e t h e r ew e r es i g n i f i c a n td i f f e r e n c ea m o n gW i l db o a ra n d Y o r k s h i r ea n dF r e n c hY o r k s h i r e ( P 0 01 ) ，d i f f e r e n c eb e t w e e nW i l db o a ra n dL a n d r a c e ( O 01 P 0 0 5 ) S i g n i f i c a n td i f f e r e n c ea m o n gM i nP i ga n dY o r k s h i r ea n dF r e n c hY o r k s h i r e ( P O 0 5 ) 4 B ys t u d yc o r r e l a t i o nb e t w e e np o l y m o r p h i s mo fB M P - 6g e n ea n dr e p r o d u c t i v et r a i t s ，w e f o u n dp o s i t i v ea f f e c t i o n A Bt y p eg e tt h eh i g h e s tn u m b e r so fp i g l e t ，a v e r a g e1 3 0 0p i g s ，a v e r a g e 6 71p i g sm o r et h a nB Bt y p e ，w h i c hi sl o w e s t ，d i f f e r e n c ei ss i g n i f i c a n t ( P O 01 ) F o rn u m b e rb o m a l i v e ，A At y p eg e tt h eh i g h e s t , a v e r a g e10 81p i g s ，a v e r a g em o r e3 6 9p i g st h a nt y p eB B ，d i f f e r e n c e I I I 东北农业人学农学硕士学位论文 i ss i g n i f i c a n t ( P 0 5 时，该座位为高度多态；0 2 5 P I C 0 5 时，为中度多态； 2 l 东北农业人学农学硕1 ：学位论文 P I C O 2 5 时，为低度多态。 P I C = I 一壹 ) 2 一宝壹料= 一 ) 2 一耐 f - I扭Ij 卅+ I 。 注：P i 和P j 分别为第i 个和第j 个等位基因频率；n , - 等位基因数 ( 6 ) 基因型与性状的关联分析 将基因型与各个性状指标进行最小二乘分析( J 伊7 O ) 。用于分析的统计模型为： Y _ l a + G + e 注：Y 为性状的表型值，p 为群体均值，G 为基因型固定效应，e 为剩余效应。 2 2 5 猪曰脚6 基因的表达分析 2 2 5 1 引物设计 ( 1 ) 猪B M P - 6 基因引物设计 根据本实验所得猪的B M P 6 基因设计引物，扩增片段为1 2 6 3 b p 1 4 6 2 b p ，长度为1 9 9 b p 。 引物序列如下： B M P S 2 51 ：5 一G A T C A T C G C A C C C A A G G G C T A - 3 ： B M P - A 2 5l ：5 T G G A G T T G T C A T C A A A G T A A A G A A 3 ( 2 ) 1 3 - a c t i n 基因引物的设计 设计l 对引物，引物序列如下： l B - a c t i nS 4 ：5 - T G C G G G A C A T C A A G G A G A A G 一3 ； 1 3 - a c t i nA 4 ：5 一A G T T G A A G G T G G T C T C G T G G 3 引物序列由上海英俊生物技术有限公司合成。 2 2 5 2 反转录 按大连宝生物反转录试剂盒( B c a B E S TR N AP C R K i tV e t 1 1c o d e ：D R R 0 2 3 ) 要求进行反转 录。进行反转录时，将每组2 只猪的R N A 等量混合从中取1 t g 作模板。反应液调制见下表： 表2 - 9 反转录反应液的配制 T a b 2 - 9P r o p o r t i o no fR Ts y s t e m 药品名称 N a m eo fd r u g s 用量 A m o u n t 2 x B c a1s tB u f f e r 2 5 M mM g S 0 4 D n t pM i x t u r e R n a s eI n h i b i t o r ( 4 0 U u 1 ) B c a B E S TP o l y m e r a s e ( 2 2 U u 1 ) O l i g od TP r i m e r R N AS a m p l e 1 0 p 1 4 p 1 1 1 t l 0 S p l l p , l l p l 1p l 材料与方法 ( 接上表) 药品名称 N a m eo fd r u g s 用量 A m o u n t R n a s eF r e ed H 2 0 T l o t a l 1 5 1 t l 2 0 1 t l 反转录反应反应程序如下：6 5 C ，1 m i n 一3 0 ，5 m i n 一1 5 3 0 m i n 内匀速升温一6 5 ， 2 5 r a i n 一9 8 ，5 m i n - - - 5 ，5 m i n 。 2 2 5 3R e a l t i m eP C R 反应 以c D N A 为模板进行P C R 扩增，2 5 u l 反应体系如下表： 表2 - 1 02 5 u l 定量P C R 反应体系 T a b 2 - 92 5 u lP r o p o r t i o no fR e a l - T i m eP C Rs y s t e m 药品名称 N a m eo fd r u g s 用量 A m o u n t S Y B RP r e m i xE xT a q ( 2 x ) P C RF o r w a r dP r i m e r ( 10 B M ) P C RR e v e r s eP r i m e r ( 1O B M ) R O XR e f e r e n c eD y eI I ( 5 0 x ) 3 T e m p l a t e 去离子水 T b t a l 1 2 5 p 1 O 5 l 0 5 1 x l 0 5 1 x l 2 0 I - t l 9 0 p 1 2 5 1 x l 两步法P C R 扩增标准程序： S e g m e n t1 ：9 5 C ，1 0 m i n ，1C y c l e ： S e g m e n t2 ：9 5 C ，3 0 s e c 一6 0 l m i n ，4 0C y c l e ： S e g m e n t3 ：D i s s o c i a t i o nC u r v e 东北农业大学农学硕上学位论文 4 0C y c l e s 2 2 5 4 数据分析： 采用2 一c T 方法分析B M P - 6 基因表达相对变化。 2 2 6 主要分子生物学软件及统计分析软件 L a s e r g e n e6 ，M e g a 3 。1 ，P r i m e rP r e m i e r5 0 ，B i o e d i t ，G e n e d o c ，S w i s s P d b V i e w e r ，D P S 数据分析管理系统。 2 2 7 相关生物信息学网站 h t t p ：w w w N C B I n l m n i h g o v h t t p ：w w w g e n o m e j p k e g g h t t p ：s w i s s m o d e l e x p a s y o r g h t t p ：c n e x p a s y o r g p r o s i t e h t t p ：w w w c h e m b n e t o r g s o t l w a r e T M p r e d - - f o r m h t m L 2 4 ， 结果与分析 3 结果与分析 3 1 猪B M P - 6 基因的克隆和序列分析 3 1 1 总m R N A 的提取 使用T r i z o l 法对法系大白猪的各组织样进行总R N A 的提取，琼脂糖凝胶电泳结果显示 R N A 较完整，未发生降解( 图3 - 1 ) ；紫外分光光度计检测表明O D 2 6 0 O D 2 的值均在1 8 2 0 之间，说明R N A 质量和纯度良好，可以反转录成e D N A 。 圈 图3 1 总R N A 的检测结果 F i g 3 - IT h er e s u l to f t o t a lR N Ae l e c t r o p h o r 3 1 2 克隆 使用引物B M P - S 1 5 0 和B M P A 1 2 1 这对引物，以猪肌肉组织总e D N A 为模板进行P C R 扩增，得到第一部分扩增产物如下( 图3 2 ) 。 Mc1c 2 图3 - 2B M P 6 基因第一段引物扩增 F i g 3 - 2F i r s tp a r tP C Ra m p l i f i c a t i o no f B M P - 6 使用引物B M P - S 1 0 和B M P 。A 1 1 1 这对引物，以猪耳组织总e D N A 为模板进行P C R 扩增， 得到第二部分扩增产物如下( 图3 3 ) 。 熬 嬲残 残 徽 强 东北农业人学农学硕上学位论文 2 0 1 0 0 0 7 _ 5 0 卯0 签o 1 0 0 Me l 图3 3B M P 6 基因第二段引物扩增 F i g 3 - 3s e c o n dp a r tP C Ra m p l i f i c a t i o no f B M P - 6 使用引物B M P - S 9 4 和B M P A 8 1 这对引物，以猪耳组织总c D N A 为模板进行P C R 扩增， 得到第三部分扩增产物如下( 图3 - 3 ) 。 图3 3B M P - 6 基因第三段引物扩增 F i g 3 3t h i r dp a r tP C Ra m p l i f i c a t i o no f B M P 一6 使用引物B M P - S 4 8 和B M P R 1 5 1 8 这对引物，以猪耳组织总e D N A 为模板进行P C R 扩 增，得到第四部分扩增产物如下( 图3 4 ) 。 Mc 图3 - 4B M P 6 基因第四段引物扩增 F i g 3 - 4f o r t hp a r tP C Ra m p l i f i c a t i o no fB M P - 6 将所获得的4 段片段分别进行胶回收纯化后，连接进p M D 1 S T 载体，转化进入D H 5a 感受 。撇 眦琳蛳 鼬啦 结果与分析 态细胞中，在L B 液体培养集中培养，进行质粒扩增。对扩增后的质粒进行测序( 上海英俊生 物有限公司) 。将测序后获得的序列进行拼接，以获得完整的B M P - 6 的C D S 序列。拼接后所得 序列如下图( 图3 5 ) - 1A T r , C C C , r o r E ：CT G G G C ；c G G A 6G G c G c 6 T C - t ；c T G r G c T G G rG G T 觥T 5 1G c T G T G c G cT G c T G c 6 G G CC _ c C G T C G c TG c G G c C G c C CC T G c C C G c C G 1 0 1C C G c C G c C G cC G c C G c C c - J C , GG G G G c G c T G cT G G G G G C G GC G G G | G c C C G 1 5 1C 3 G , C C A C G c G G 腻A ! G c C G c CC C C G c C G c G , c C T C T T C c TC C G G T T T C C T 2 0 1C T A C C G G c 0 GC T C G c G CA C G A G k 从c GG I 铀L G J U G c G 6