CYP450酶与中药代谢相互作用及酶活性测定的研究进展.doc

CYP450酶与中药代谢相互作用及酶活性测定的研究进展 摘要 药物对于人体属于外源性化合物，进入人体后将被许多酶所代谢。CYP450酶作为主要的代谢酶，且是重要的药物I相代谢酶，人体约75%的药物代谢是通过CYP450酶进行，而且CYP450酶是引起中药-中药（药对）、中药-西药等联合用药时药物相互作用产生的关键因素。为明确代谢酶与中药代谢的相互作用关系，普遍以酶活性作为评价指标，即以CYP450酶活性的增强和降低来推断中药有效成分及提取物等对酶的诱导或抑制作用。目前，代谢酶活性测定的常用方法是Cocktail探针药物法，其中探针底物的选择是关键。这对研究药物在机体内的吸收、分布、代谢及排泄（ADME）过程有着重大意义。该文就中药、中药有效成分、中药提取物及Cocktail探针底物等与CYP450酶的相互作用进行了综述，以期对将来的相关研究有借鉴和指导意义。 关键词 中药;有效成分;CYP450酶;代谢;探针底物 Interaction between CYP450 enzymes and metabolism of traditional Chinese medicine as well as enzyme activity assay LU Tu-lin1，2， SU Lian-lin1， JI De1，2， GU Wei1， MAO Chun-qin1* （1.College of Pharmacy， Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210023， China; 2. Jiangsu Provincial Key Laboratory of Chinese Medicine Processing， Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210023， China） Abstract Drugs are exogenous compounds for human bodies， and will be metabolized by many enzymes after administration. CYP450 enzyme， as a major metabolic enzyme， is an important phase I drug metabolizing enzyme. In human bodies， about 75% of drug metabolism is conducted by CYP450 enzymes， and CYP450 enzymes is the key factor for drug interactions between traditional Chinese medicine（TCM）-TCM， TCM-medicine and other drug combination. In order to make clear the interaction between metabolic enzymes and TCM metabolism， we generally chose the enzymatic activity as an evaluation index. That is to say， the enhancement or reduction of CYP450 enzyme activity was used to infer the inducing or inhibitory effect of active ingredients and extracts of traditional Chinese medicine on enzymes. At present， the common method for measuring metabolic enzyme activity is Cocktail probe drugs， and it is the key to select the suitable probe substrates. This is of great significance for study drugs absorption， distribution， metabolism and excretion （ADME） process in organisms. The study focuses on the interaction between TCMs， active ingredients， herbal extracts， cocktail probe substrates as well as CYP450 enzymes， in order to guide future studies. Key words traditional Chinese medicine; active ingredient; CYP450 enzymes; metabolism; probe substrate doi：10.4268/cjcmm20151802 细胞色素P450（CYP450）位于胞浆内质网膜上，主要存在于肝脏中，此外，在胃肠道（特别是小肠中）、肺、肾和胎盘也有表达。CYP450酶系在人体肝脏中约重1020 g，占人体总蛋白含量的1%2%。CYP450酶根据其基因序列和同源性，主要分为CYP1，CYP2，CYP3这3个大的亚家族。据研究统计，在人体内已有16个基因家族和29个亚家族已被确认，是外源性化合物的主要代谢酶，CYP450是重要的药物相代谢酶（所谓相代谢即药物经过氧化、去甲基化和水解反应作用后，非极性脂溶性化合物变为极性和水溶性较高而活性较低的代谢物），可以催化多种外源性化合物的氧化和还原代谢，人体内约有75%的药物代谢通过CYP450酶进行¹，这对解释药物在机体内的清除过程有着非常重要的意义。CYP3A4是表达量最大的异构体，约占人体肝脏CYP450的30%40%，有近50%的药物通过它进行代谢。其次是CYP2C（约占18%）和CYP1A2（约占13%）。CYP2D6虽然只占人体代谢酶的1.5%，但却有近30%的药物通过其代谢。目前已明确，CYP450酶对中药中有效成分的代谢作用是中药代谢研究的基础。因此，中药与CYP450酶的相互影响需要进一步深入挖掘和探索，为今后的科研、临床实践提供可靠的理论物质基础。 1 中药与代谢酶的相互作用 1.1 中药有效成分与CYP450酶的相互作用 中药是有多种化合物组成的混合物，单就一味中药来说，其含有的活性成分多达几十种，有的甚至达几百种;中药复方就更不用说了。因此，进行代谢动力学方面的研究也就困难重重。中药的有效活性成分多种多样，种类繁多，包括黄酮类、生物碱类、挥发油及萜类、多糖类、甾体皂苷类、苯丙素类等。研究发现，中药单体成分如黄酮及其衍生物、生物碱、多糖等都对代谢酶有诱导或抑制作用。涂自良等²实验证明葛根素对CYP1A2和CYP2D6有明显的抑制作用，且随葛根素浓度的升高，抑制作用增强。Qin C J等³研究发现土木香内酯对CYP3A4有显著抑制作用（非竞争性抑制作用），对其他CYP450亚型酶无明显影响，半抑制浓度分别为3.599 mol（HLMs）和3.90 mol（CYP3A4重组体）;土木香内酯有效抑制CYP3A4的生物活性具有剂量依赖性，但无时间依赖性，且这种抑制作用在老鼠体内研究中已得到验证。部分中药单一有效成分与CYP450酶相互作用总结见表1。 1.2 中药及其提取物与CYP450的相互作用 中医在临床上大多以中药饮片或中药提取物的形式入药，单一的中药活性成分对CYP450酶的影响可能与单味中药或复方用药时对CYP450酶的影响有所不同。因此，明确单味和复方中药与CYP450酶间的相互作用关系，对临床用药有现实指导意义，见表2。 亦有研究表明某些中药有效成分或提取物在动物体内与在人体内、外对CYP450酶的影响存在差异性。如银杏提取物在大鼠体内能诱导肝微粒体酶，增强CYP1A1，CYP1A2，CYP2C9，CYP2E2等的活性;而人体外，银杏叶提取物能有效抑制CYP1A2，CYP2C9，CYP2C19，CYP2E1等的活性，但人体内却能诱导CYP2C19，CYP2E1的活性²⁸。因此有学者猜想银杏叶提取物对CYP450酶影响的不一致可能与银杏叶提取物商品的组成成分以及给药剂量和用药时间的长短有关。 1.3 中药药对及复方与CYP450的相互作用关系 从代谢酶的角度研究中药药对或中药-中药配伍的相互作用关系，见表3，具有重要的现实意义，为“十八反”、“十九畏”中药配伍禁忌机制的阐述提供了研究思路和方法。中医药理论认为“甘草能解百药之毒”，因此许多中药-中药药对及复方中都有甘草这味药，但对于其作用机制并不十分清楚。现代研究表明，甘草对人体肝药酶的诱导作用可能是“甘草能解百毒”的一个机制³⁵。如甘草与海藻这一相反药对以一定比例混煎后，对肝药酶（CYP450酶）有诱导作用，提示当方药中有这一相反药对存在时， 会对方中其他药物的代谢产生影响， 有可能改变方中一些药物甚至整个方药的药理或毒理作用³⁶。王宇光等³⁷采用紫外分光光度法和RT-PCR技术研究了人参与藜芦合用对CYP450同工酶在酶活性及mRNA水平的调控作用， 结果显示人参与藜芦合用可明显降低CYP450蛋白含量，在mRNA水平上，藜芦可诱导 CYP2C11的基因表达，与人参合用后却导致CYP2C11的表达下降;藜芦与人参配伍诱导了CYP1A1的表达;人参可抑制CYP2B1/2的基因表达， 与藜芦合用后却明显诱导了CYP2B1/2的表达;人参与藜芦合用后也明显诱导了 CYP3A1的表达。为了解释“半蒌贝蔹芨攻乌”的科学内涵，肖成荣等³⁸研究了半夏、瓜蒌、贝母、白蔹、白芨配伍乌头对大鼠CYP450酶的影响，结果显示配伍组与其相应单药组比较可显著降低 P450酶的含量。 目前对复方中药的代谢酶研究相对较少，是因为中药复方配伍作用机制更加复杂，对结果的解释难度更大。施畅等⁴²通过研究发现，不同剂量复方丹参滴丸诱导处理后大鼠肝脏脏器系数、总CYP450含量及 1A2，2E1，3A亚型酶活性未见明显增高;高剂量复方丹参滴丸诱导后，大鼠肝脏CYP2B1/2活性与空白对照组相比显著升高，但中、低剂量组则无明显改变。 1.4 中药炮制对CYP450酶的影响 近年来，CYP450酶的研究还被应用到中药炮制研究中，这为一些中药炮制机制（如醋制入肝、盐制入肾、酒制升提等）的探索奠定了基础。王菊等¹⁸以Cocktail探针药物法研究了生、醋莪术对CYP450酶的影响，生莪术提取物对CYP1A2，CYP2E1，CYP3A4这3种亚型酶活性影响并不明显，醋莪术粗提物对CYP1A2和CYP2E1具有抑制作用，对CYP3A4 具有诱导作用。胡芳等⁴³进行了醋制五味子对CYP450酶影响的相关研究，结果表明单次灌胃给予大鼠生、醋五味子醇提取物，可以有效抑制CYP1A2酶活性，诱导CYP2El和CYP3A4活性，且醋五味子抑制CYP1A2酶活性的效果要强于生五味子。多次灌胃给予大鼠生、醋五味子醇提液对CYP1A2有抑制作用，且醋五味子抑制作用强于生五味子;生、醋五味子对CYP3A4均有诱导作用，诱导作用分别相当于苯巴比妥的37.84%，40.83%;生、醋五味子对CYP2E1有抑制作用⁴⁴。Cheng Y等⁴⁵通过实验证明柴胡、醋制柴胡对CYP2C9和CYP2C19存在不同程度的影响，并推测生、醋柴胡提取物不同疗效可能与此有关;同时还发现柴胡及醋制柴胡可显著影响CYP2E1，CYP2D6，CYP3A4的活性，但二者对CYP1A2均无显著性影响。 2 CYP450酶活性的测定 目前测定CYP450酶活性的方法主要是探针药物法，它又可分为体内实验和体外实验。体外实验的优点是方法简单，操作方便，代谢周期短，实验易于重复，可排除其他生理因素的干扰，能够直观地显示药物对酶的抑制或诱导作用以及酶对底物的选择性代谢，它适用于所有经CYP450酶代谢的化学物质的代谢研究，尤其针对那些对人体有较大损害的化学物质，避免了体内实验过程中可能对人体造成的伤害。体外实验的缺点主要是很难完全真实的模拟体内复杂的代谢环境。然而体内实验的优点在于实验是在动物或人体整体用药的基础上进行的，可以准确地反映生命机体在生理状态下的药物代谢状况，但易受个体机能状态、个体差异、用药耐受量、有无合并用药等因素的影响，同时它还受伦理道德的限制，实验规模往往较小，重复性差。 2.1 Cocktail 探针药物法 Cocktail探针药物法由Breimer等⁴⁶首次提出，即同时给予多种相对低剂量的探针药物，测定生物样本中每个探针药物的代谢率或其他代谢分型指标，以获取多个代谢酶的表型信息。随着CYP450及其同工酶在药物代谢、毒理学、肿瘤生化、临床合理用药和新药研发等领域广泛而深入的研究。Cocktail探针药物法已成为研究药物对体内代谢酶影响的强大技术手段。Cocktail探针药物法快速、高效、灵敏。Ardjomand woelkart等⁴⁷成功建立了利用96孔混合固相萃取沉淀技术及LC-MS/MS定量测定技术，此法可一次性完成大鼠血浆中4种CYP450探针底物及其代谢产物浓度的测定及分析。Stewart等⁴⁸采用UPLC-MS/MS与“Pittsburgh cocktail”法联用测定人血浆和尿中6种CYP450酶的探针药物和代谢产物浓度。 2.2 Cocktail探针药物的选择 运用Cocktail探针药物法检测CYP450亚型同工酶活性时，探针药物的选择是其关键。选择探针药物的依据有：探针药物及其代谢产物易得且经济，并且同时使用时探针药物之间不产生相互作用;每种探针药物有选择地作用于一种同工酶（专属性），具有高度敏感性，并确知代谢产物及其代谢途径;在抑制剂存在的条件下，探针药物在高浓度下仍能维持其作用专属性，不发生对其他同工酶的抑制作用;探针药物在给予的剂量下应对所检测亚型的活性无影响;活体中在给予探针药物的剂量下其代谢应遵循一级动力学变化，并且其代谢不受肝血流和蛋白结合的影响;给药和采样应简单无损伤，在给药剂量下应确保安全性;不存在潜在的对分析方法的干扰。 经过近几年的深入研究，大多数CYP450亚型同工酶的理想探针底物已经得到确定，见表4。如茶碱是CYP1A2的理想探针，其次是咖啡因;咪达唑仑是CYP3A4的理想探针等。 但CYP450酶有很强的变异性，Cocktail 法易受个体差异（性别、年龄、种族等）的影响，而且探针药物之间也有可能产生相互作用。有报道称CYP2E1底物氯唑沙宗可影响口服CYP3A4底物咪达唑仑的体内代谢过程⁵¹。 3 结语 中药因其独具的纯天然性，毒副作用相对较小等优点被越来越多的人接受和认可，而且中药的优势也日益凸显。由于中药成分的复杂性，临床用药中出现的问题也不断显现，所以药物之间的相互作用理应受到更多的重视。大量的临床和药理实验证明，许多中药对CYP450产生不同程度的影响，许多学者研究发现中药药对、中药配伍、中药-西药联用时或组方制剂、中药炮制具有增强疗效、降低毒副作用，甚至发挥出单味药所不具有的疗效等特点，充分显示了合理联用药物的优越性;相反，不合理的药物联用也可使药物疗效降低或毒副作用加剧。 目前国内外对中药与CYP450酶之间的相互作用关系研究并不系统和完善，一方面是受到实验条件的制约，如绝大多数实验采用动物体外研究预测中药对CYP450酶的作用有可能存在假阳性，基因多源性也可能造成结果偏差，单基因的转录、翻译、表达和酶活性的研究还不够深入;另一方面是理论、思维的限制，中医药的研究很大程度上存在“西化”，包括研究手段和思维模式，所谓的中西医药的结合还只停留于表面。 综上所述，细胞色素P450酶对解决中药研究中许多关键问题显得至关重要，虽然目前关于中药对CYP450活性影响的研究很多，但对其作用机制并未阐述的很明确。因此今后的重点应该是其作用机制的研究。明确中药在体内的代谢过程，解决复杂中药的代谢机制是亟待解决的重要问题。随着细胞色素P450酶的研究不断深入，中药对CYP450酶的相互作用关系将会得到更好的解释。 参考文献 1 董宇，王阶，杨庆，等.CYP450酶与中药代谢相互作用关系研究概况J.中国中医药信息杂志，2011，18（1）：100. 2 涂自良，张澈，王启斌，等.葛根素对人肝微粒体中细胞色素P450酶活性的影响J.中国药师， 2008， 11（2）： 131. 3 Qin C J， Lv Q L， Chu T Y， et al. 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