毕业设计（论文）-不同基因型小麦对铅胁迫响应的差异研究.doc

题 目： 不同基因型小麦对铅胁迫响应 的差异研究 姓 名： 学 号： 200907040049 系 别： 生命科学系 专 业： 生物技术 年级班级： 2009级生物技术班 指导教师： 2013年5月31号目 录摘 要1Abstract 11材料与方法21.1 材料21.1.1 材料来源21.1.2 主要试剂21.2 主要仪器与设备31.3土壤的选取和处理.31.4 方法31.4.1 小麦种子处理31.4.2 试验方法31.4.3 萌发率与生理测定指标42结果与分析52.1 不同处理对不同基因型小麦萌发率和幼苗生长的影响52.2 不同处理对不同基因型小麦生理指标的影响62.2.1 不同处理对不同基因型小麦POD的影响62.2.2 不同处理对不同基因型小麦SOD的影响62.2.3 不同处理对不同基因型小麦CAT的影响73结果与讨论73.1 结果73.2 讨论9参考文献10致谢12不同基因型小麦对铅胁迫响应的差异研究摘 要：采用不同浓度的硝酸铅溶液（0、100、250、500 mg/L,以铅元素计），对3种不同基因型小麦（众麦1号、周麦18号、周麦22号）进行水培和土培处理，研究了不同基因型小麦对铅胁迫响应的差异。结果表明：不同基因型小麦对铅元素的耐性不同，低浓度硝酸铅溶液能够影响小麦种子的发芽率（七天）和幼苗的高度生长（十天），甚至有促进作用。高浓度的硝酸铅溶液能够显著地降低小麦种子的发芽率，不同浓度的硝酸铅溶液对于幼苗的POD、SOD、CAT活性刺激程度不同，不同品种间存在一定程度的差异。关键词：不同小麦；铅胁迫；差异研究Different Wheat Genotypes to Lead Stress Response DifferencesAbstract：Using different concentrations of lead nitrate solution (0,100,250,500 mg / L, to lead an elemental basis), on three different genotypes of wheat (wheat on t- he 1st congregation, Zhoumai the 18th, Zhoumai the 22nd) for hydroponics and soil c -ulture process, the effects of different wheat genotypes lead Stress response differen- ces. The results showed that: different wheat genotypes with different tolerance for le- ad elements, low concentrations of lead nitrate solution can affect wheat seed germin- ation rate (seven days) and seedling height growth (ten days), and even promote. High concentrations of lead nitrate solution can significantly reduce wheat seed germinatio- n rate, different concentrations of lead nitrate solution for seedling POD, SOD, CAT activity stimulation differs among different species there are some differences in the degree.Key Words:Different wheat;The stress of lead;Differences in study 引言小麦是我国主要的粮食作物之一，人体所需的微量元素主要来源于小麦中的微量元素。由于小麦品种、种植区域、气候条件以及施肥状况的不同，小麦中的微量元素与有害元素的组成与含量也存在着很大的差异1。土壤中的重金属可被小麦吸收，在小麦体内积累的重金属超过一定水平时就会影响小麦本身的生长及生态环境，不仅严重影响植物的生长发育、降低产量与质量，而且重金属通过进入食物链，威胁着动物和人类的健康。在众多的重金属污染中，铅污染最为普遍，就污染程度而言，铅是环境中主要的重金属污染物之一，铅污染位于第2位，仅次于镉2。铅对人的神经系统、骨髓造血机能、消化系统及生殖系统以及人体其它功能都有明显毒害作用，特别对婴儿和儿童的健康危害较大3 。汽油里添加抗爆剂烷基铅是环境中铅的主要来源，随汽油燃烧后的尾气积累在公路两侧百米范围内的土壤中。另外，其它的重要污染源来源于含铅蓄电池厂、铅冶炼厂、铅采矿场以及含铅油漆的生产厂家4。作物对外部环境反应的开始标志是种子萌发及幼苗生长，也是作物对外界反应的敏感期，在这段时间，重金属主要是通过生理生化过程来影响植株5。已有研究报道，铅可竞争性的取代某些酶活性中心的金属元素而影响酶的正常活性，从而引起植物光合作用、呼吸作用等过程。作物生长的关键时期是种子的萌发和幼苗的成长，种子发芽质量好坏直接影响农作物生长和经济效益6，作物种子的成苗率和幼苗质量是影响播种质量的重要因素，更是提高田间植株数量和质量进而提高产量的关键因素。本实验用不同浓度的硝酸铅培养黄淮区具有代表性的三种不同基因型小麦，通过测定小麦的萌发率和苗长，抗氧化酶活性等，为筛选铅耐性较好，又能保障使用安全的小麦提供理论依据。1、材料与方法1.1 材料1.1.1 材料来源小麦种子：众麦1号，周麦18，周麦22，由周口师范学院生命科学系重点实验室提供1.1.2 主要试剂磷酸缓冲液、硝酸铅溶液、愈创木酚、过氧化氢、氮蓝四唑、EDTA-Na2、核黄素、高锰酸钾、草酸、过氧化氢、碳酸钙粉等均为分析纯（AR）1.2 主要仪器与设备L-500低速离心机： 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司 可见分光光度计： 上海棱光技术有限公司制造 TGL-16台式高速离心机： 江苏金坛市医疗仪BCD-215KCM冰柜： 青岛海尔股份有限公司722S可见分光光度计： 上海箐华仪器设备有限公司UV-5100型紫外分光光度计光度计： 上海元析仪器有限公司HH-2数显恒温水浴锅： 江苏荣华仪器有限公司JD200-3电子天平： 沈阳龙腾电子有限公司80-2离心沉淀器： 江苏省金坛市医疗仪HC-3018高速离心机： 安徽中科中佳科学仪器有限公司H1650-W台式高速离心机 ： 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司1.3 土壤的选取和处理称量硝酸铅制取母液为100 mg/L的溶液，然后再分别制取250 mg/L、500 mg/L的溶液。在试验田选取没有杂质、沙土化较高的土壤，放置于自然条件下使其风干。将土壤和细沙搅拌均匀后，分别放置在四个托盘中，每盘3 kg沙土，用浓度分别为0、100、250、500 mg/L（以Pb元素计）各1200 mL将沙土搅拌均匀，放置在实验室中，使其在室温下晾干备用。 1.4 方法1.4.1 小麦种子处理选取粒大饱满的小麦种子用清水浸泡16 h后，用0.1%的氯化汞溶液表面消毒6 min。1.4.2 试验方法试验设置4个处理,分别为：0 mg/L； 100 mg/L； 250 mg/L；500 mg/L（各浓度以Pb2+元素计）的硝酸铅溶液。每组处理设置3次重复。(1)水培法：培养皿（直径10 cm，12个，3个一组），将每个培养皿中放入4-5层纱布，分别用0、100、250、500 mg/L（以Pb元素计）给每组培养皿分别加入30 mL硝酸铅溶液。将消毒后备用的小麦种子捞出沥干后，挑取均匀健康饱满的种子，将一组浓度梯度中的每个平板放置同一品种小麦50粒，腹面朝下，每天上午八点和下午三点分别向培养皿中倒入20 mL蒸馏水，放置于恒温培养箱中，25室温下培养。(2)土培法：将硝酸铅溶液处理过的土壤粉碎，均匀的放置在每个托盘（30205(cm)）中，每盘3 kg土壤，将消毒后的小麦种子沥干均匀播种于加有土壤的的托盘中，每天上午八点、十一点和下午三点分别向托盘中倒入200 ml蒸馏水，放置于实验室窗台进行自然光照。1.4.3 萌发率与生理测定指标萌发率和幼苗的高度：7 d内发芽种子总数，以百分数表示为萌发率，发芽率=总发芽种子数供试种子数100%；10 d后测定幼苗的高度，并测量小麦的长势。过氧化物酶(POD)测定采用愈创木酚法7，在有过氧化氢存在下，POD能使愈创木酚氧化成茶褐色物质，此产物在470 nm波长处有最大吸收峰，故可以通过测量470 nm波长下吸光度值的变化以表示过氧化物酶的活力。读出第2 min、第3 min的OD值，按下面的公式计算酶活力单位：酶活力=(OD3-OD2)/(1 min0.001)。过氧化氢酶(CAT)测定采用高锰酸钾滴定法8。过氧化氢酶属于血红蛋白酶，含有铁，能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。可根据过氧化氢的消耗量或者氧气的生成量测定该酶活力的大小。在该体系中加入一定量的过氧化氢溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的过氧化氢，即可求出消耗的过氧化氢的量。酶活性用每克鲜重样品分钟内分解过氧化氢的毫克数表示：过氧化氢酶活性(A-B)(VT/VS)1.7/(Wt)mg/(g.min)式中：A为对照KMnO4滴定毫克数；B为酶反应后KMnO4滴定毫克数VT为提取酶液总量，mL；Vs为反应时所用酶液量，mL；W为样品鲜重，g；t为反应时间，min；1.7为1 mL 0.1 mol/L高锰酸钾，相当于1.7 mg H2O2。超氧化物歧化酶（SOD）测定用氮蓝四唑法8。超氧化物歧化酶普遍存在动、植物的体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶， 超氧化物歧化酶通过抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作用来确定酶活性的大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易被氧化而产生超氧阴离子，超氧阴离子可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560 nm处有最大吸收。而SOD可清除超氧阴离子，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶的活性愈低，反之酶的活性俞高。据此可计算出酶活性的大小。已知SOD活力单位以抑制氮蓝四唑光还原的50%为一个酶活力单位表示，下式计算SOD活性：SOD总活力=(ACK-AE)V/(0.5ACKWVt)；公式中：SOD总活力以鲜重酶单位每克表示；比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；ACK为照光对照管的吸光值；AE为样品管的吸光度；V为样品液总体积，mL；Vt为测定时样品用量，mL；W为样品鲜重，g；蛋白质含量单位为mg/g。2 结果与分析2.1 不同处理对不同基因型小麦萌发率和幼苗生长的影响将不同基因型小麦用水培的方法进行不同铅溶液的处理，参照肖光顺9等的方法。统计7d内发芽种子总数，以百分数表示为发芽率，发芽率=总发芽种子数供试种子数100%；第10d后测定幼苗的高度，用皮尺进行测量。表1不同处理（mg/L）对不同基因型小麦萌发率（%）影响处理众麦1号周麦18周麦220 mg/L100 mg/L250 mg/L500 mg/L84%84%86%80%90%96%96%80%96%98%100%86%从表1的数据中，在较低铅浓度100 mg/L和250 mg/L处理下，对于小麦的萌发具有正向刺激作用，萌发率较高；高浓度的铅溶液处理下即500 mg/L时，对于小麦的萌发率具有显著地抑制作用。周麦18和周麦22与众麦1号相比，受铅胁迫的影响较小，即铅耐性比较强。表2不同处理（mg/L）对不同基因型小麦幼苗苗长（cm）的影响处理众麦1号周麦18周麦220 mg/L100 mg/L250 mg/L500 mg/L5.730.088b7.330.601a7.070.145b4.770.639a8.030.555a8.200.173ab8.370.470a7.430.536b8.570.371a9.070.233a8.530.524a7.900.115a注：各列中标有不同小写字母表示在5%水平差异显著。从表2中得出，在铅胁迫条件下，对于众麦一号和周麦18，100 mg/L与0 mg/L相比具有显著差异，即100 mg/L影响小麦苗长的生长，并且具有促进作用；而500 mg/L与0 mg/L相比，分别降低为原来的83.2%、92.5%，具有显著差异（P0.05），即高浓度的铅溶液具有抑制作用。周麦22在四个处理中没有显著差异，即在不同浓度的铅溶液下，周麦22受胁迫的作用较小。 2.2 不同处理对不同基因型小麦生理指标的影响2.2.1 不同处理对不同基因型小麦POD的影响表3不同处理（mg/L）对不同基因型小麦POD(U)的影响处理众麦1号周麦18周麦220 mg/L100 mg/L250 mg/L500 mg/L96.331.856a160.671.764c129.672.603b122.674.485c93.331.764ab97.672.517b130.002.887b146.334.910b85.672.963b221.676.009a213.0027.791a195.336.489a注：各列中标有不同小写字母表示在5%水平差异显著。POD是植物中普遍存在的一种活性较高的氧化还原酶，与光合作用以及生长素的氧化等都有紧密的联系10。植物耐受重金属胁迫的物质基础之一是POD活性的维持和提高11。对于3种基因型小麦，在铅胁迫条件下，POD的活性不同程度的被激活：100 mg/L对众麦1号和周麦22的激活效应明显，POD的活性明显提高，与0 mg/L相比分别提高66.8%和158.7%，差异达显著水平（P0.05）；250 mg/L对众麦1号和周麦22具有一定的激活效应，POD的活性也明显提高，与0 mg/L相比分别提高35%和149%，差异显著。500 mg/L时，三种基因型小麦的POD活性都受到不同程度的抑制，但是都比0 mg/L时的活性高。2.2.2 不同处理对不同基因型小麦SOD的影响 表4不同处理（mg/L）对不同基因型小麦SOD(U/g)的影响处理众麦1号周麦18周麦220 mg/L100 mg/L250 mg/L500 mg/L253.673.480a260.132.918a160.032.849c20.671.705d176.203.499b270.671.202a274.030.689a245.901.079a76.975.527c252.034.448b203.702.579b185.872.824b注：各列中标有不同小写字母表示在5%水平差异显著。在硝酸铅胁迫的逆境条件下，SOD活性的提高对于植物的抗逆性具有重要的意义11。从表4可以看出，在100 mg/L处理中，众麦1号幼苗叶片SOD活性变化与0 mg/L相比无显著差异，而250 mg/L、500 mg/L处理中，众麦1号幼苗叶片SOD活性降低到对照的61.5%和7.6%，差异达到显著水平（P0.05）；周麦18在100 mg/L、 250 mg/L和500 mg/L与对照0 mg/L相比SOD活性分别提高到原来的150%、160%和140%，有显著性差异（P0.05）；周麦22在100 mg/L、 250 mg/L、500 mg/L与0 mg/L对照相比SOD活性分别提高为原来的330%、260%和240%，有显著性差异（P0.05），可见，铅处理诱导三种小麦幼苗叶片SOD活性，周麦22的铅耐性强于众麦1号和周麦18。2.2.3 不同处理对不同基因型小麦CAT的影响表5不同处理(mg/L)对不同基因型小麦CATmg/(g.min)的影响处理众麦1号周麦18周麦220 mg/L100 mg/L250 mg/L500 mg/L1.460.020b2.020.020b3.990.052a1.990.138a3.073.499b6.830.145a2.870.169b2.050.104a3.390.121b4.100.240b2.970.082b0.760.265b注：各列中标有不同小写字母表示在5%水平差异显著。所有植物中都存在CAT，通过催化过氧化氢分解为分子氧和水，可清除植物体内的过氧化氢，从而使过氧化氢不能毒害细胞，是植物防御系统的一种关键酶 10。由表5可以看出，不同基因型小麦对不同处理的响应不同，众麦1号在250 mg/L和周麦18在100 mg/L处理时与0 mg/L相比，CAT活性分别提高了170%、120%，具有显著差异（P0.05）；在不同处理中，CAT活性呈先升高后降低的变化趋势，但是周麦22在不同处理中差异不显著。3、结果与讨论31 结果环境污染问题日益突出，越来越多的重金属铅进入土壤，对动植物生长发育具有毒害作用，并且通过食物链进入人体12。Pb2+能与酶活性中心或蛋白质中的巯基结合，取代金属蛋白中的必需元素（Ca2+、Mg2+ 、Zn2+和Fe2+），导致生物体酶活性等一系列生理生化过程不能正常代谢 13。抗氧化酶活性升高能保护细胞免受重金属引起的氧化胁迫伤害14,15，从而保护植物能正常生长。本实验用不同浓度硝酸铅溶液培养3种不同基因型小麦,测定一定时期内小麦的生理指标,旨在研究不同基因型小麦对不同浓度的铅胁迫响应的差异研究，得出以下结论：不同浓度的铅溶液对于不同基因型小麦的胁迫作用不同，低浓度的铅溶液可以正向刺激小麦的萌发以及小麦幼苗的生长，提高POD、SOD和CAT的活性，但是高浓度的铅溶液抑制不同基因型小麦的萌发以及抗氧化酶的活性。实验结果显示：100 mg/L、250 mg/L要比0 mg/L（对照组）小麦的发芽率和幼苗高度高，500 mg/L时发芽率和幼苗高度比0 mg/L（对照组）的低。硝酸铅溶液可以在一定程度上激活幼苗的萌发率和苗长，可能与提高幼苗叶片中POD和CAT以及SOD三种酶活性有关。综上所述，一定浓度铅溶液可以促进小麦种子的发芽率，并提高小麦的生长速率，这种促进效果可能导致大量活性氧自由基的产生，该类自由基能够对抗重金属的毒害，从而使毒害症状减轻。32 讨论植物在受到胁迫时，膜透性随着细胞膜的破坏增大，从而使细胞内的电解质外渗，膜透性是评定植物铅耐性反映的生理指标之一16,17。小麦种子的发芽不仅和细胞膜的完整性相关，还受其它因素的影响。本实验显示处理500 mg/L的幼苗高度和发芽率比正常的要低。抗氧化系统通过保护植物脂肪过氧化来保护细胞膜的完整性，促进植物的生长。体内的活性氧在超过一定范围时会引起脂肪过氧化，破坏细胞膜，抑制生长。SOD、POD和CAT是三种主要清除活性氧的酶18。POD、CAT、SOD协同作用能够降低自由基在植物体内的积累，从而使植物的膜结构免受自由基的伤害。100 mg/L、250 mg/L的处理促进了幼苗的萌发率以及苗高，与显著提高幼苗叶片中POD和CAT以及SOD三种酶活性有关。硝酸铅溶液在一定浓度范围内可以正向刺激小麦的生长，超过一定的浓度界限会抑制小麦的生长，并且与小麦的基因型也有一定的关联，即不同的小麦基因型忍受铅胁迫的能力不同。本实验结果表明，不同浓度硝酸铅处理，100 mg/L和250 mg/L 时能显著提高不同基因型小麦种子的发芽率和增加苗高，并且能够不同程度的诱导POD、SOD、CAT的活性。由韩红江19等的研究表明，在低浓度的铅胁迫作用下，SOD、POD以及CAT的活性都有不同程度的提高，在高浓度的铅胁迫作用下，SOD、POD和CAT的活性被抑制。由马文丽5等通过研究铅胁迫对乌麦和小麦种子萌发及幼苗生长的影响表明，不同浓度的铅胁迫对小麦的种子萌发具有低浓度下的激活效应和高浓度下的抑制效应。由魏学玲11等通过研究Pb2+ 胁迫对两种小麦幼苗生理特性影响表明，在不同浓度的铅胁迫下，抗氧化酶活性被不同程度的诱导。本实验研究表明，硝酸铅浓度为100 mg/L时，对于3种不同基因型小麦可使幼苗株高增高以及SOD、POD和CAT含量，促进生长效果显著。而当硝酸铅浓度为250 mg/L处理3种不同基因型小麦，除众麦1号的SOD外，其他各项指标都高于0 mg/L即对照组。由此说明一定浓度的硝酸铅溶液确实具有促进植株生长的效果，但是高浓度的硝酸铅溶液对小麦的生长起抑制作用。这种抑制效果跟小麦的基因型种类有关。本实验采用的方法是用水培法和土培法培养小麦种子。许多试验均已证明硝酸铅溶液的确能正向刺激植物生长和抗氧化酶的活性。已知土壤中含有少量的微量元素，土壤的特性会影响金属离子在土壤中的有效性和分散性，只有溶解性的和可交换态形式的离子才可直接被作物吸收20。这些因素均可能对植物的生长发挥作用21，硝酸铅溶液对种子的萌发和幼苗生长起多大作用与土壤的特性也有一定的关联。如果能对上述问题阐述清楚，对小麦的育种以及选择铅耐性好的小麦在农业上的广泛应用将会有更大的帮助。参考文献1王小丽.小麦Fe、Zn、Pb、Cu吸收分配特性的研究D.扬州大学，2008:10.2孙光闻，朱祝军，方学智，等.我国蔬菜重金属污染现状及治理措施J.北方园艺，2006(2):66-67.3陈天金，魏益民，潘家荣.食品中铅对人体危害的风险评估J.中国食物与营养2007(2):15-18.4柴宝玲，邵云，李春喜，等.碳酸钙和粉煤灰对铅胁迫下小麦毒害的缓解效应J.环境污染与防治，2008,30(9):6-10.5马文丽，金小弟，王转花.铅胁迫对乌麦种子萌发及幼苗生长的影响J.山西大学学报（自然科学版），2004,27(2):202-204.6何俊瑜,任艳芳,王阳阳,等.不同品种小麦种子萌发和幼苗生长对镉胁迫的响应J.麦类作物报,2009,29(6):1048-1054.7任小林,李嘉瑞.杏果实成熟衰老过程中活性氧和和几种生理指标的变化J.植物生理学通讯,1991,27(1):34-36.8李合生.植物生理生化实验原理和技术M.北京：高等教育出版社.2000.9肖光顺,李保成,周小风,等.一种简便有效的棉花种子发芽试验方法J.中国棉花,2007,34(1):21.10李玉琴,赵丹丹,于永芳,等.磷胁迫对油菜幼苗 ApasePODCAT活性的影响J.安徽农业科学,2011,39(16):9548-9550.11魏学玲，史如霞，杨颖丽，等. Pb2+ 胁迫对两种小麦幼苗生理特性影响的研究J.植物研究，2009，29(6):714-720.12邵云，姜丽娜，李万昌，等.砷、铅胁迫对小麦幼苗毒害效应及叶片下表皮扫描电镜观察J.西北农业学报，2009,18(1):133-138.13杜连彩.植