毕业论文-3种马尾藻中多酚类成分的提取分离和抗氧化活性研究.doc

本科生毕业论文本科生毕业论文 3 3 种马尾藻中多酚类成分的提取分离和抗氧化活性种马尾藻中多酚类成分的提取分离和抗氧化活性 研究研究 Studies on Separation, Extraction and Antioxidant activity of Polyphenols in three kinds of Sargassum 学生姓名 所在专业食品质量与安全 所在班级食安1104 申请学位工学学士 指导教师职称讲师 答辩时间2014 年 5 月 31 日 目 录 目 录 摘 要.I ABSTRACT.II 1 前言.1 1.1 目的和意义.1 1.2 国内外研究现状.2 1.3 主要内容和关键问题.3 2 材料和方法.3 2.1 实验材料、试剂和仪器.3 2.1.1 材料.3 2.1.2 主要试剂.4 2.1.3 主要仪器与设备.4 2.2 褐藻多酚的提取方法和步骤.4 2.3 总酚的测定.5 2.3.1 试剂的配制.5 2.3.2 检测方法.5 2.3.3 标准曲线的制定和样品含量计算.5 2.4 总抗氧化能力的检测.6 2.4.1 试剂的配制.6 2.4.2 检测方法.6 2.5 对 DPPH清除能力的检测.6 2.5.1 试剂的配制.6 2.5.2 检测方法.6 3 结果与分析.7 3.1 褐藻多酚的提取结果.7 3.2 总酚的测定.7 3.2.1 标准曲线.7 3.2.2 测定结果.8 3.3 总抗氧化能力的检测.8 3.4 对 DPPH清除能力的检测.9 3.5 展望.10 4 结论.11 鸣 谢.12 参考文献.13 摘 要 I 摘 要 本课题选取湛江海域的 3 种马尾藻属褐藻（硇洲马尾藻、铜藻和鲜鱼头草）为研究 对象，对其中的褐藻多酚进行分离提取，并测定其总酚含量和多酚提取物的抗氧化活性 及自由基清除率。采用溶剂抽提法提取褐藻多酚，采用微晶纤维素粉吸附法进行纯化， Folin - Ciocalteu 比色法测多酚含量，通过测定其总抗氧化性和 DPPH（1，1-二苯基- 2-三硝基苯肼自由基）的清除率评价其抗氧化活性。 结果显示 3 种马尾藻的总酚含量分 别为为 0.36、0.39 和 0.26 mg 没食子酸(GA)/g 海藻湿基；相同浓度下总抗氧化能力 （TCA）为硇洲马尾藻鲜鱼头草铜藻；3 种褐藻多酚提取物对 DPPH的半数清除浓 度（IC50）大小依次为铜藻（IC50=83.701 mg/L）硇洲马尾藻（IC50=86.699 mg/L）鲜 鱼头草（IC50=88.972 mg/L） 。硇洲马尾藻、铜藻和马尾藻 3 种褐藻中褐藻多酚具有较强的 抗氧化和清除自由基活性是一类良好的海洋生物天然抗氧化剂和天然自由基清除剂， 具有不错的应用价值。 关键词：马尾藻；铜藻；褐藻多酚；DPPH 自由基；抗氧化活性 ABSTACT II ABSTRACT The Present thesis is foeused on the studies of the Isolation, Extraction , Antioxidant activity and free radicals scavenging activity of the phlorotannins in the three kinds of Sargassum(Sargassum naozhouense Tseng et Lu,Sargassum Horneri and The Sargassum) from Zhanjiang ocean.Phlorotannins were Separated by Microcrystalline cellulose sorption method and extracted by Solvent extraction, by Folin-Ciocalteu colorimetry determination of polyphenols content, by measuring the Total antioxidant capacity and scavenging DPPH(- diphenyl-picrylhydrazyl) radical assay of antioxidant activity.Results showed The total Polyphenol contents of three kinds of Sargassums were 0.36, 0.39mg and 0.26 mg gallic acid (GA)/g algae samples,at the same concentration algae samples ,Total antioxidant capacity (TCA) were Sargassum naozhouense Tseng et LuThe SargassumSargassum Horneri;Three kinds of phlorotannins extract DPPH cleared half of concentration (IC50), followed by Sargassum Horner（IC50=83.701 mg/L）Sargassum naozhouense Tseng et Lu（IC50=86.699 mg/L） The Sargassum（IC50=88.972 mg/L）.phlorotannins from Sargassum naozhouense Tseng et Lu,Sargassum Horneri and the Sargassum had promising antioxidant and free radicals scavenging activity, which can be used as a resource of novel natural antioxidants agents. KEYWORDS: Sargassum;Sargassum Horneri;phlorotannins;DPPHfree radical; Antioxidant activity 广东海洋大学2014届本科生毕业论文 1 3 3 种马尾藻中多酚类成分的提取分离和抗氧化活性研究种马尾藻中多酚类成分的提取分离和抗氧化活性研究 食品质量与安全专业，2001011221115，李源 指导老师：卢虹玉 1 前言 1.1 目的和意义 褐藻多酚具有显著的抗氧化活性1-8，能够起到良好的清除自由基、预防癌症的作用 且对人体无害，适宜大量开发用作天然抗氧化剂。寻求抗氧化活性的药物用于清除自由 基具有重要意义，由于人工合成药物的毒性和成本问题，寻找具有抗氧化活性可清除自 由基的天然产物是当前的研究热点9-10。 通常在有机物提取实验中，当醇含量为 50%60%时可除去淀粉等杂质；醇含量达 60%时， 无机盐开始沉淀；醇含量达 75%以上时，可除去蛋白质等杂质；当醇含量达 80%时，几 乎可除去全部淀粉、多糖、蛋白质、无机盐类杂质，但是鞣质、水溶性色素、脂质等不 易除去11。所以，本课题选择用无水正己烷浸取除去样品中的脂质，用甲苯溶液过柱除 去样品中的水溶性色素，用甲醇提取尽可能的除去淀粉，多糖，蛋白质，无机盐，用 70%丙 酮提取其中的褐藻多酚，如此操作可以较为有效地减少多糖和蛋白质对多酚提取的影响。 测定抗氧化活性的方法有很多种，但综合考虑成本及实验条件，磷钼络合物法有良 好的可操作性和再现性，且成本低廉，适用于多种样品溶剂的抗氧化能力测定，故本课 题选用磷钼络合物法测定褐藻多酚提取物的总抗氧化活性。而二苯代苦昧酰基 （DPPH）法具有稳定、快速、简便、灵敏的优点，故选用 DPPH法评价提取物的自 由基清除能力。 湛江作为我国大型海藻资源地之一，有着丰富的褐藻资源，尤其是硇洲马尾藻为湛 江特有，且少见相关研究的报道。这样的资源不加以利用太过于可惜和浪费。不同中数 的褐藻中褐藻多酚的含量差距很大，与藻体的大小、年龄、组织、盐度、季度、营养条 件、光照条件及采摘后的保存时间和条件都有关系。因此本课题选取 3 种典型的湛江产 马尾藻：硇洲马尾藻、硇洲产铜藻和鲜鱼头草，提取分离其中的褐藻多酚，并检测其含 量、总抗氧化能力以及对自由基清除能力，综合评价其抗氧化活性。为硇洲马尾藻、硇 洲产铜藻和鲜鱼头草的开发利用提供一定依据。 1.2 国内外研究现状 目前已知的属于海藻中褐藻门的海藻就有 250 属、1500 多种，其中马尾藻属海藻分 布广泛，种类繁多，常见种类有羊栖菜、海黍子、海蒿子、马尾藻、鼠尾藻等。在广 广东海洋大学2014届本科生毕业论文 2 东经国际自然保护组织认定的就有 60 多种。其特征均为含有褐色色素的丝原或丝状的 植体的藻类，是海藻中一大比较高级的类群，具有生长快、易养殖、产量稳定、分布广 等特点，有着巨大的潜在市场和经济价值，是非常引人注意的一类海藻，属于三大经济 海藻。马尾藻属是提取褐藻胶等天然物质的重要原料，一些马尾藻在在本草纲目 、 神农本草经 、 千金方 、等著作中收录作为药用。广东沿海地区的产量每年产量 25 万担（干品）左右，其中湛江的产量约占四分之一。其生长在低潮带的马尾藻，有着较 易于采集的优点，再加上生长迅速，植株较大，研究利用和开发就有了便利的条件12。 而湛江作为我国马尾藻的主要产地之一，具有得天独厚的优势。 多酚是一大类结构不同、含有多个羟基的化合物总称, 在植物中广泛存在。但随着现 代化学分析和物质分离技术的成熟，并大量应用于藻类资源的开发及对褐藻的次级代谢 产物 褐藻多酚化合物( phlorotannins) 逐渐深入的研究, 褐藻多酚越来越引起研究者 和药食品从业者的关注。 抗氧化剂可分为天然抗氧化剂和人工合成抗氧化剂两种。由于天然抗氧化剂需要养 殖，提取等等繁琐的工序，因此在食品工业一些人工合成抗氧化剂如二丁基羟基甲苯 （BHT） 、丁基羟基茴香醚（BHA） 、叔丁基对苯二酚、没食子酸丙酯被大量使用。虽然 生产快速，成本低廉，但人体在长期高剂量的摄入后，会导致细胞突变从而患上癌症。 已有大量事实证明，在食品中，就毒性而言，天然抗氧化剂要远比人工合成抗氧化剂的 毒性低的多。民以食为天，随着人们对食品安全的持续关注，天然抗氧化剂在食品添加 剂和保藏鲜肉果蔬食物领域中有着广阔的应用前景1 ，而褐藻多酚也因其良好的抗氧化 性引起了广泛关注2。 就现阶段而言，已经被大量开发和应用的褐藻产物主要是褐藻盐（Aliginates）和褐 藻酸（Alginic） ，约占褐藻干重的 15-40%13，它们具有抗凝血及抗微生物活性，可以降低 血液中的胆固醇含量。而褐藻多酚的研究工作国外早已开展多年，steinberg14对多种褐藻 中多酚含量及其摄入威胁性进行了研究。随着植物单宁化学本质的不断显示,以及 T.swainlss1516等不断地强调植物代谢产物的生理活性和功能,才推动了酚类物质的生物学 研究。其它的研究还包括 Ragan 在 1979 和 1980 年对褐藻多酚与重金属离子络合作用。 一些国外生物学者对空茎昆布( Eckloniacava)、黑海藻( black sea algae) 18 等海藻中多酚 的提取方法、含量、抗氧化性能等进行了大量的研究。 但在国内还未尚未有深入系统的研究。严小军(1994)17是国内研究褐藻多酚较早的学 者之一。他对中国常见的几种褐藻比如裙带菜( Undaria pinnatifida )、海黍子( Sargassum kj ellmanianum ) 、海带( Laminaria japonica) 、鼠尾藻( Sargassum thunber gii )和几种马 尾藻中多酚含量进行了测定。从目前已有的相关研究报导中，普遍认为在马尾藻、墨角 藻、水云属等褐藻中多酚含量较多19-20。 迄今为止，国内外报道的提取分离褐藻多酚的方法主要超声波提取法、微波提取法、 超临界流体萃取法、吸附树脂法、高速逆流色谱法和有机溶剂萃取法等21。国内外报道 的测定褐藻多酚抗氧化物质清除自由基的方法主要有紫外-可见光分光光度法、化学发光 广东海洋大学2014届本科生毕业论文 3 法、电子自旋共振法、电化学检测法、荧光法、气相色谱法和超高效液相色谱串联质谱 法等22。目前，1，1-二苯基-2-苦基苯肼（DPPH）清除实验被广泛用于抗氧化活性的 测定，具有稳定、快速、简便、灵敏的优点。国外很多学者运用 DPPH 溶液的紫外-可见 光分光光度计的吸光度变化作为清除 DPPH 自由基能力的测定方法23-24。 硇洲马尾藻（Sargassum naozhouense Tseng et Lu）属于褐藻门（Phaephyta）圆子纲 （Cyclospreae）墨角藻目（Fucales）马尾藻科（Sargassaceae）马尾藻属（Sargassum）12， 其为广东特有物种，主要分布于硇洲岛和雷州半岛等地，多生长在中低潮带的岩石上。 硇洲马尾藻具有高蛋白、低脂肪、低热量、高膳食纤维且富含锌、铁、钾等微量矿质元 素的优点，是理想的天然保健食品原料25，有着很高的药用和食用价值，是南方高温海 区非常具有规模化栽培前景和商业价值的本土种类。其重要作用还体现在海洋生态系统 中，可用作实施海洋生态修复或重建浅海藻场。 铜藻（Sargassum horneri）属于褐藻门（Phaephyta）圆子纲（Cyclospreae）墨角藻目 （Fucales）马尾藻科（Sargassaceae）马尾藻属（Sargassum） ，又称草茜、竹茜菜、柱囊 马尾藻，铜藻可用于堆肥或作为季节性食材，甚至发展成为发酵生产酒精的原料。其分 布区很广，南可至香港，是一种常形成海藻林的常见温带马尾藻，能在每年的冬末春初 大量繁殖，最快时每天可以长约一米，最长的个体可达十米12。硇洲岛是广东的主要铜 藻产地之一，其易养殖、收割，且产量高，目前相关市场开发程度较低，其实具有较高 的食用和药用价值，可进行更多的生产提取，如可用来制铜藻罐头、动物饲料和天然抗 癌药物。 鲜鱼头草属于褐藻门（Phaephyta）圆子纲（Cyclospreae）墨角藻目（Fucales）马尾 藻科（Sargassaceae）马尾藻属（Sargassum） 。其藻株高约 1020cm，叶略卷曲，宽约 0.51.0cm，呈褐色，是典型的马尾藻，目前暂时只有俗名，正在鉴定中的马尾藻。 1.3 主要内容和关键问题 本课题的主要研究内容是从已有的研究基础及相关文献报道着手，参考 Federico Ferreres , Graciliana Lopes , Angel Gil-Izquierdo 等人的方法26提取， Folin - Ciocalteu 比色 法27测定褐藻多酚含量，磷钼络合物法28检测总抗氧化能力，二苯代苦昧酰基自由基 (DPPH)法21-22检测自由基清除能力，对 3 种湛江本地产的马尾藻中褐藻进行检测来验 证其褐藻多酚含量、抗氧化性和自由基清除能力。 本课题将进行以下内容： 褐藻多酚的提取分离； 褐藻多酚含量的测定； 褐藻多酚总抗氧化能力的检测； 褐藻多酚的 DPPH自由基清除能力检测。 2 材料和方法 广东海洋大学2014届本科生毕业论文 4 2.1 实验材料、试剂和仪器 2.1.1 材料 硇洲马尾藻，铜藻，鲜鱼头草均在湛江硇洲岛采集。 2.1.2 主要试剂 folin-酚试剂（北京鼎国生物技术有限公司） ，没食子酸（GA） （福建南方化工有限公 司，色谱纯） ，无水 Na2CO3（分析纯） ，三水合醋酸钠（分析纯） ，冰乙酸（分析纯） ， TPTZ 试剂（美国 Sigma 公司） ，浓盐酸（分析纯） ，六水合三氯化铁（分析纯） ，DPPH 试剂（美国 Sigma 公司） ，无水乙醇（分析纯） ，正己烷（分析纯） ，丙酮（分析纯） ，甲 醇（分析纯） ，甲苯（分析纯） ，浓硫酸（分析纯） ，七水合硫酸亚铁（分析纯） ，微晶纤 维素（国药集团化学试剂有限公司，柱层析） ，实验用水如无特殊说明均为超纯水。 2.1.3 主要仪器与设备 仪器名称型号生产厂家 真空旋转蒸发仪 DIGITAL WATER BATH 循环水式真空泵 N-1000 SB-1000 SHZ-D() EYELA EYELA 巩义市予华仪器有限责任公司 数显恒温水浴锅 HH-8 常州澳华仪器有限公司 紫外分光光度计UV2550日本岛津公司 高速冷冻离心机 CR22G 日本日立公司 超声波清洗器 KQ-500E 昆山市超声波仪器有限公司 电子天平AUY220SHIMADZU 超纯水机 LD-50G-D 重庆利迪实验仪器设备有限公司 摇床 SKY-1102C SUKUN 电热鼓风干燥箱 DHG-9240A 上海-恒科学仪器有限公司 无菌注射针筒50ml中国医疗器材公司 2.2 褐藻多酚的提取方法及步骤 3 种新鲜马尾藻样品在采集之后, 用清水反复清洗除去附生生物后，再用蒸馏水洗涤 3 次, 然进行植株的物种鉴定，放置于冰箱中零下 20低温保存备用。实验时取出保藏的 3 种马尾藻，在研磨钵中研磨碎后，用电子天平分别于广口瓶中 3 次平行称取 66.89g 马尾藻， 25.34g 铜藻，31.41g 鲜鱼头草备用。 按质量体积比 1:6（样品：正己烷）加入正己烷溶液，使样品完全浸没后，放置在摇 床上（25，120r/min）摇晃以加快浸取速度，经过 6h 后，浸取完毕。同中等密度滤纸过滤， 滤渣按上述方法重复提取 3 次，确保除去脂质。之后将滤渣倒出广口瓶置于滤纸上，自然干 燥滤渣 12h，确保正己烷已经挥发不会影响下面的实验。获得 3 种马尾藻的粗提物 I。 广东海洋大学2014届本科生毕业论文 5 再按照质量体积比 1:6（滤渣：70%丙酮溶液）加入 70%丙酮溶液，使样品完全浸没 后，放置于摇床上（25，120r/min）晃动浸取 1 小时，4000r/min 离心 5min，按上述方法重 复提取 3 次，合并离心液，得粗提液。 将离心液倒入 500ml 旋蒸瓶中置于真空旋转蒸发仪（40，85r/min）蒸馏去丙酮和水。 然后加入甲醇溶液以超声波清洗器溶解附着在旋蒸瓶上的提取物，换 250ml 旋蒸瓶，用旋转 蒸发仪（40，85r/min）旋蒸干燥至恒重后，3 次平行，用差量法算出提取物的质量分别为 2.77g、1.63g、1.25g。得 3 种马尾藻粗提物 II。再以甲醇溶解，加入 2 倍质量的微晶纤维素， 继续旋蒸干燥得到微晶纤维素提取物。 将微晶提取物从旋蒸瓶中倒出后，以 50ml 针筒过柱，具体步骤如下 首先在针筒底部塞入一层棉花，确保微晶颗粒不会由针筒口流出，接着加入一层微晶纤 维素约 2 药勺，然后放入旋蒸干燥好的纤维素提取物，再在上面覆盖一层微晶纤维素，确保 充分提取。把甲苯缓缓倒入针筒中，使甲苯通过两层纤维素后由针筒口流出，反复操作，过 柱直至甲苯洗出液呈无色，收集洗出液。然后加入 70%丙酮，使 70%丙酮通过两层纤维素后 由针筒口流出，提取 3 次，收集并合并洗出液后，4000r/min 离心 5min，即得到丙酮提取液。 将提取液在真空旋转蒸发仪中 30旋蒸除去其中混杂的甲苯和丙酮，待无液体蒸出 后，用超声波震荡使得附着于璧山的提取物溶解，所得溶液即为最终样液，放置于冰箱中零 下 20保存。 将实验中用到的各种有机溶剂在旋转蒸发仪中旋蒸以回收有机溶剂，供反复使用。 2.3 总酚的测定 2.3.1 试剂的配制 880mg/L 没食子酸标准液：准确称取 0.044g 没食子酸，用水溶解，定容至 50ml。 12% Na2CO3溶液：准确称取无水 Na2CO313.0g 溶于 40ml 水中，定容至 100ml。 1mol/L folin-酚试剂乙：取一定量的 folin-酚试剂乙原液以 1:1 比例稀释后待用。 2.3.2 检测方法 根据相关文献，采用 Folin - Ciocalteu 比色法13。 Folin-酚乙液可与多酚在碱性条件下发生氧化反应，形成钨钥兰复合物，复合物呈蓝 色，在避光条件下反应 60min 后达到稳定状态，复合物在 =765nm 处有最高吸收峰并无 干扰峰，在一定浓度范围内，其吸光度变化值与总酚含量呈比例关系，故可依据标准曲 线得出对应浓度，用没食子酸（GA）mg/g 海藻湿基来表示海藻的多酚含量。 实验具体操作如下： 用移液管量取 1ml 待测液于 10ml 具塞试管中，然后准确加入 2ml 1mol/LFolin-酚乙 液，震荡摇匀，然后静置 2min，接着缓慢的加入 6ml 的 12% Na2CO3，防止溶液冲出试 管，迅速摇匀，用超纯水定容至 10ml，室温下避光放置 60min 使反应稳定后，用紫外-可 见分光光度计在 =765nm 处测定吸光度，以 1ml 超纯水代替样品进行上述过程，作为空 广东海洋大学2014届本科生毕业论文 6 白对照。以没食子酸作为衡量多酚含量的标准。得相对的褐藻多酚总含量，用 mg GA/g 海藻湿基表示。 2.3.3 标准曲线的制定和样品含量计算 取配制好的没食子酸标准溶液配制系列浓度为 0、2.2、4.4、6.6、8.8mg/L，采用 2.2.2 中的 Folin - Ciocalteu 比色法，建立浓度和吸光度的关系曲线（图 1）作为标准曲线。 代入测得的样品吸光度值，即可得出样品的相对 GA 浓度，换算可得每克样品相对 GA 含量。 2.4 总抗氧化能力的检测8 2.4.1 试剂配制 试剂液（内含 0.6mol/L 硫酸、28mmol/L 磷酸钠和 4 mmol/L 钼酸铵）：量取 16.30ml 98%H2SO4，用超纯水稀释一定程度后，再称取 2.4716g 四水合钼酸铵和 5.32g 十二水合 磷酸钠，用一定超纯水震荡溶解于烧杯后，再将溶液倒入上述装有稀释硫酸的容量瓶中， 用超纯水定容至 500ml。 2.4.2 检测方法 采用磷钼络合物法28。其测定原理是抗氧化物质将 Mo()还原后生成绿色的 Mo(V) 络合物，在 695 nm 处有最大吸收峰且无干扰峰。测得的吸光度值在一定范围内与被测物 质的抗氧化物质活性成比例关系。故可通过比较 3 中马尾藻样品的吸光度，得出其抗氧 化性大小的顺序。该方法有良好的可操作性和再现性，且成本低廉，适用于多种样品溶 剂的抗氧化能力测定。 具体操作步骤参考 Prieto 等28的方法并加以改进：用移液管准确量取 0.5mL 样品液 于 5ml 试管中，接着量取并加入 4.5mL 试剂液，充分摇匀。然后在恒温水浴 90 min，待 反应稳定后，迅速用紫外-可见光分光光度计于 =695 nm 下测吸光度，比较 3 种待测褐 藻多酚溶液的总抗氧化能力强弱。用 0.5mL 溶剂代替样品液按上述步骤操作用作空白液。 2.5 对DPPH清除能力的检测5,13,21-22,24 2.5.1 试剂配制 0.2mmol/L DPPH 乙醇溶液：称取 0.0040g DPPH 试剂用无水乙醇溶解，定容至 50ml。 2.5.2 检测方法 测定方法采用二苯代苦昧酰基自由基 (DPPH)法。其具有简单、快速的特点，仅需 一台紫外-分光光度计就可以测定，试剂配制也十分容易。DPPH是一种稳定的以氮为中 心的自由基，其醇溶液呈深紫色，在 =517nm 处有一吸收峰且无干扰峰。加入自由基 清除剂可与 DPPH发生氧化还原反应而使其颜色变浅，从而使 517nm 处的吸光度减小 广东海洋大学2014届本科生毕业论文 7 且颜色变化与吸光度成比例关系。故根据吸光度值的变化可测得抗氧化剂的活性，从而 评价实验样品的抗氧化能力。 取 5ml 具塞试管，将 3 种马尾藻褐藻多酚提取液分别稀释为 18mg/L、40mg/L、60mg/L、120mg/L、180mg/L 的系列，并按照如下过程操作。 0 管：加入 1ml 超纯水，2ml 无水乙醇溶液，用无水乙醇定容至 5ml。 对照组：加入 1ml 样品溶液，2ml 无水乙醇溶液， 用无水乙醇定容到 5ml。 样品组：加入 1ml 样品溶液，2ml 0.2mmol/L 的 DPPH 乙醇溶液， 用无水乙醇定容到 5ml。 空白组：加入 1ml 超纯水，2ml 0.2mmol/L 的 DPPH 乙醇溶液， 用无水乙醇定容到 5ml。 将上述试管于暗处放置 60min 待反应完全后，用紫外-可见光分光光度计在 =517nm 处 测定其吸光度值。 按以下公式得出各个样品对应浓度下的 DPPH清除率： %100% 0 210 A AAA ）清清除除率率（ 式中： Ao：空白组吸光度 A1：对照组吸光度 A2：试样组吸光度 利用 SPSS 建立样品浓度和清除率的关系曲线，算出半数清除浓度 IC50 6。 3 结果与分析 3.1 褐藻多酚的提取结果 利用相似相溶的原理，在实验室允许的条件下，使用不同有机溶剂除去各种脂肪， 色素，多糖，蛋白质等杂质，得到纯度较高的褐藻提取物。马尾藻中有着自由基清除能 力和抗氧化性的活性物质主要是褐藻多酚，必须想办法分离提纯出其中的褐藻多酚，才 能进一步测定其褐藻多酚的含量，提取率，自由基清除能力和抗氧化活性。 3 种马尾藻样品平行 3 次的质量及提取率如表 3-1 所示 表 3-1 3 种马尾藻样品的质量、褐藻多酚提取物质量及提取率 样品名硇洲马尾藻铜藻鲜鱼头草 样品质量（g） 粗提物质量（g） 提取率（%） 66.890.02 2.770.03 4.140.04 25.340.01 1.630.02 6.430.08 31.410.03 1.250.01 3.980.03 结果显示：铜藻的粗提物提取率最高，为 6.430.08%，硇洲马尾藻与鲜鱼头草的提 取率相近，分别为 4.140.04%和 3.980.03%。查文献得知，从海藻中提取褐藻多酚的含 广东海洋大学2014届本科生毕业论文 8 量约占海藻干重的 0.4-20%17,26，实验结果换算为干重后，符合这一范围，且属于含量较 高的水平。 3.2 总酚的测定 吕志华、于广利、迟连利对褐藻中海黍子的抗氧化作用做了研究，发现主要成分是 褐藻多酚；罗广华，王爱国，柯德森等对海藻中清除自由基的物质做了大量研究，发现 主要作用成分也是多酚类29,30。故褐藻多酚是褐藻中主要的抗氧化和清除自由基的物质， 其具有易提取的优点，提取其做抗氧化性研究很有意义。 3.2.1 标准曲线 以总酚含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，建立标准曲线如图 3-1 所示。 y = 0.1409x + 0.0112 R2 = 0.9992 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 012345678910 总酚含量（以没食子酸计）/（mg/L） 吸光度值（765nm） 图 3-1 总酚含量测定标准曲线 结果说明，GA（没食子酸）在浓度为 0 8.8 mg/L 内与其紫外-可见光分光光度计吸 光度值有着良好的线性关系，在此范围内线性回归方程为 y=0.1409x+0.0112 (R2=0.9992)。 3.2.2 测定结果 总酚含量的测定结果（见表 3-2）显示出硇洲马尾藻、铜藻、鲜鱼头草的总酚含量分 别为 0.3630.003、0.3960.004、0.2660.003mgGA/g 海藻湿基，结果表明 3 种马尾藻中， 铜藻中的褐藻多酚含量最高，硇洲马尾藻中的褐藻多酚含量略低于铜藻，鲜鱼头草中的 褐藻多酚含量相对最低。但总体来说，3 种马尾藻的褐藻多酚含量均处于较高水平，是多 酚物质的理想原料。段小娟等人对采自青岛沿海的 28 种海藻粗提物进行总酚的测定，其 总酚含量变化范围为 0.10 到 8.00 mg 没食子酸（GA）/g 海藻干重31-33，杨小青37测得半 叶马尾藻的总酚含量为 3.24mg GA/g 海藻干重，本实验结果换算后与之相符，但含量相 对较低，可能是由于提取不纯，参杂了多糖等杂质所致。 表 3-2 3 种马尾藻样品的总酚测定结果 总酚含量 （mg GA/g 海藻湿基） 硇洲马尾藻铜藻鲜鱼头草 广东海洋大学2014届本科生毕业论文 9 样品 1 样品 2 样品 3 平均值 0.356 0.368 0.363 0.3630.003 0.401 0.393 0.394 0.3960.004 0.263 0.265 0.271 0.2660.003 3.3 总抗氧化能力的检测 抗氧化剂不仅能阻止食品和油脂的氧化腐败，从而延长保质期，而且还有着诸多的 保健功能。因此，随着抗氧化剂在食品工业中广泛的应用，其需求量不断增加。由于人 工合成抗氧化剂如二丁基羟基甲苯（BHT） 、丁基羟基茴香醚（BHA）等长期摄入产生的 毒性问题，随着人们越来越追求绿色环保的消费理念，怎样利用天然植物去开发高效、 安全的天然抗氧化剂成为食品工业的一项重大课题34。 总抗氧化能力检测结果（见表 3-3） ，样品浓度均为 1.5mg/L 时，显示出硇洲马尾藻、 铜藻、鲜鱼头草的抗氧化能力（以吸光度计）大小分别为 0.0850.002、0.0760.001、0.0810.001。表明硇洲马尾藻的总抗氧化能力在 3 种马尾藻 中最高，铜藻的总抗氧化能力在 3 种马尾藻中最低，但三者结果接近，无显著差异。 表 3-3 3 种马尾藻中褐藻多酚提取物的抗氧化能力检测结果 吸光度硇洲马尾藻铜藻鲜鱼头草 样品 10.0860.0770.079 样品 20.0830.0770.082 样品 30.0870.0750.081 平均值 0.0850.0020.0760.0010.0810.001 注：所有样品浓度均为 1.5mg/L 3.4 对DPPH清除能力的检测 褐藻多酚具有较强的自由基清除作用, 已经开始应用到制药，食品等相关行业中， 有着广阔的应用前景。为了了解湛江本地常见的 3 种马尾藻的抗氧化性和自由基清除能 力，顺便验证褐藻多酚的自由基清除作用, 本课题立足现有条件, 进行紫外-可见光分光 分光光度法测定样品的 DPPH自由基清除作用。 对 DPPH清除能力的检测结果（图 3-2、表 3-4、表 3-5）中，3 种马尾藻褐藻多酚 提取物都具有一定的清除 DPPH的能力，且随着提取物浓度增加，清除率逐渐增高，但 随着浓度增加到一定值后，清除率不再随浓度增加而继续大幅度提高。在 3 种马尾藻样 品中，对 DPPH的清除能力强弱依次为：铜藻（IC50=83.701 mg/L）硇洲马尾藻 （IC50=86.699 mg/L）鲜鱼头草（IC50=88.972 mg/L） 。但 3 种马尾藻褐藻多酚初提物对 DPPH的清除能力差异并不太大，说明提取褐藻多酚的过程相对成功，依据李晓芬35的 实验数据，植物多酚的半数清除浓度在 138700mg/L 之间，个体差异很大。而褐藻多酚 的半数清除浓度，由于选取的海藻种类不同、提取的褐藻多酚分子量和纯度不同，结果 广东海洋大学2014届本科生毕业论文 10 差异较大，如徐银峰等36测得海带不同提取方法的褐藻多酚提取物半数清除浓度在 200- 600mg/L 之间，而杨小青37测得半叶马尾藻的半数清除浓度在 14mg/L 到 21mg/L 之间， 3 种马尾藻褐藻多酚都具有相当强的 DPPH自由基清除能力，半数清除浓度也大致符合 这一范围。根据图 4 可以看出褐藻多酚的自由基清除能力在 0180mg/L 提取物的范围内， 与浓度有密切的关系，随浓度的增加而增强。与于曙光13的研究结果相符，但与上述总 抗氧化能力的检测结果不太相符，说明总抗氧化能力并不完全等于自由基清除能力，可 能还有未知的反应发生。但是总体趋势还是相符合的，说明了 3 种马尾藻都具有较强的 自由基清除能力。 图 3-2 3 种马尾藻褐藻多酚提取物同浓度对DPPH清除率对比 表 3-4 3 种马尾藻褐藻多酚提取物同浓度对DPPH清除率对比 注：以上浓度对应的清除率为 3 次平行试验的平均值 表 3-5 3 种马尾藻褐藻多酚提取物对DPPH半数清除浓度对比 浓度 清除率（%） 马尾藻 铜藻 仙鱼头藻 18mg/L 40mg/L 60mg/L 120mg/L 180mg/L 10.650.03 23.510.05 38.830.03 73.630.02 96.830.04 11.380.02 26.830.03 40.220.02 78.350.03 96.640.06 9.870.03 23.950.02 34.550.04 71.480.02 96.710.05 样品名 硇洲马尾藻 铜藻 仙鱼头藻 IC50（半数清除浓度 mg/L） 86.799 83.70188.972 广东海洋大学2014届本科生毕业论文 11 3.5 展望 需要说明的是，由于实验条件所限，本实验中马尾藻试样仅为未除去水分的新鲜样 品，使得得出的 mg GA/g 海藻湿基的值偏小一些，若将马尾藻完全除去水分后，褐藻多 酚含量会大幅增加。另外，同样是条件限制，只能用 4 种有机溶剂对 3 种马尾藻中的褐 藻多酚进行提取，褐藻多酚也仅为粗提物，若是将提取物中的抗氧化物质进一步提纯， 则所需剂量会进一步减小。肯定还有一些杂质在其中，有条件应该进行超滤等更好的提 取方法，以得出更精确的结果，便于分析，也更为可信。不过本课题重在横向比较 3 种 马尾藻的褐藻多酚含量、抗氧化性和自由基清除能力，实验条件控制较好，均在相同环 境，相同方法下同时进行，故对结果影响并不大，但能改进仍再好不过。 开发硇洲马尾藻、铜藻、鲜鱼头草作为自由基清除剂、天然抗氧化剂是具有广阔应 用前景的。湛江有着非常好的生物多样性和丰富的海产品，包括海藻资源，其中马尾藻 属就有 50 多种，很多都具有相当的经济价值。而且湛江的硇洲马尾藻和铜藻易于大量养 殖，环境也十分适合其生长，一年有两次的海藻收获高峰期，发展海藻养殖及其深加工， 以丰富湛江的海产品线，充分利用现有资源，环保，绿色的发展经济，走可持续发展之 路是未来的发展方向之一。 4 结论 本课题以硇洲马尾藻、铜藻、鲜鱼头草做为原料，用多种有机溶剂除去杂质，从而 从其中提取并分离了褐藻中的活性物质褐藻多酚，主要研究了 3 种藻中褐藻多酚的 含量以及褐藻多酚的抗氧化活性和清除自由基的生物活性，取得了如下的结论： 3 种