中药复方的抗氧化.doc

中药复方的抗氧化作用研究姓名：刘畅，学院：生命科学学院摘 要：目的：研究中药复方的抗氧化作用。方法：采用Fenton反应体系、还原力的测定、DPPH法等三个方面评价中药复方的抗氧化能力。结果：中药复方在还原力以及对二种自由基的清除作用时，均表现出了不同程度的抗氧化能力。结论：中药复方具有较强的还原力，在清除自由基方面其清除率与其浓度存在着明显的量效关系。关键词：中药复方；抗氧化 Antio-xidant Activities of a Chinese Herbal CompoundLiu Chang，College of Life SciencesAbstract: Objective: Study on anti-oxidant activities of a Chinese herbal compound. Methods: The anti-oxidant activities of the Chinese herbal compound were measured by hydroxyl radicals scavenging activity assay, reducing power, DPPH assay. Result: The result indicated that the Chinese herbal compound in reducing power and the two kinds of radical scavenging activity showed some different effects on anti-oxidant activities. Conclusion: The Chinese herbal compound had high reducing activity, and the clearance rates are positive proportional to the concentration. Key words: Chinese herbal compound; anti-oxidant activities1 引 言抗氧化就是任何以低浓度存在就能有效抑制自由基的氧化反应的物质，其作用机理可以是直接作用在自由基，或是间接消耗掉容易生成自由基的物质，防止发生进一步反应。人体的抗氧化物质有自身合成的，也有由食物药物供给的。随着机体的衰老，自身的抗氧化能力在减弱。因此从外界获取抗氧化物质有利于机体减少自由基的产生或加速其清除。自由基系活性氧的一种。自由基能杀死红细胞，降解DNA、细胞膜和多糖化合物，继而又发现许多由它所导致的有害效应当加入自由基的清除剂后会明显降低1。研究自由基的清除剂，如本实验所用的中药复方，对研究某些病变原因、衰老机理的揭示具有重大意义。抗氧化剂的还原能力与其抗氧化性之间存在正相关。抗氧化剂是通过自身的还原作用给出电子而清除自由基，还原力越强，抗氧化性越强。因此，可通过测定还原力来说明其抗氧化活性的大小。抗氧化剂越来越受到人们的关注，但是关于中药复方抗氧化的研究应用还很少，本研究将从铁离子还原能力以及对2种不同自由基的清除能力方面对中药复方进行了较为全面、系统的研究，从而探讨中药复方的抗氧化作用，为进一步将此药复方用到保健食品以及日化产品的开发中提供科学依据。2 材料与方法2.1 材料2.1.1 实验材料 中药复方（此中药复方为安徽师范大学中药资源研究所提供） 不同浓度样品的配制：8mg/ml的样液100ml的配制：称取0.8g样品，溶于适量蒸馏水，过滤，取滤液，定容至100ml。依次逐级稀释获得4mg/ml的样液50ml；2mg/ml的样液50ml；1mg/ml的样液50ml；0.5mg/ml的样液50ml；0.25mg/ml的样液100ml。2.1.2 主要仪器 UV-9200型紫外可见分光光度计2.1.3 试剂羟自由基的清除能力测定的试剂：硫酸亚铁溶液（2mmol/L)；过氧化氢溶液（6mmol/L)；水杨酸（6mmol/L)；蒸馏水还原力测定的试剂：磷酸缓冲液（pH=6.6）；1%铁氰化钾溶液；10%三氯乙酸溶液；0.1%三氯化铁溶液，蒸馏水DPPH法测定的试剂：0.2mmol/L DPPH乙醇溶液；蒸馏水2.2 方法2.2.1羟自由基清除能力清除羟自由基的能力是体外常用的评估抗氧化2-3方法之一。本实验采用了水杨酸捕获法，利用Fenton体系4产生羟自由基5，加入水杨酸来捕获，能在510nm下产生强吸收的有色物质，通过测定其吸光度来判定羟自由基7的清除率。吸取2mmol/L硫酸亚铁溶液1ml，6mmol/L过氧化氢溶液1ml，6mmol/L水杨酸1ml，加入样液1ml，37水浴30min。以蒸馏水为参比，在510nm处测定吸光度。计算羟自由基的清除率。清除率=A0-(A1-A2)/A0*100%。式中：A0为以溶剂代替药液的试剂空白管的吸光度；A1为加了药液的吸光度；A2为不加显色剂的药液的本底光密度，是为了减去药液本身颜色对于实验的影响。 用75%乙醇代替样液的试剂空白管的吸光度（A0）：吸取2mmol/L硫酸亚铁溶液1ml，6mmol/L过氧化氢溶液1ml，6mmol/L水杨酸1ml，75%乙醇1ml。测混合液体的吸光度，为减少误差，测三组平行样，取其平均值，记为A0。加入样液的吸光度（A1）：吸取2mmol/L硫酸亚铁溶液1ml，6mmol/L过氧化氢溶液1ml，6mmol/L水杨酸1ml，样液1ml。测混合液体的吸光度，为减少误差，测三组平行样，取其平均值，记为A1。不加显色剂的样液的本底光密度（A2）：吸取2mmol/L硫酸亚铁溶液1ml，6mmol/L水杨酸1ml，样液1ml，蒸馏水1ml。测液体的吸光度，为减少误差，测三组平行样，取其平均值，记为A2。2.2.2 还原力测定还原能力的强弱，可以反映药物的潜在抗氧化6性能，是体外抗氧化8的一个重要指标。本实验采用的是铁氰化钾法。取2ml样液于试管中，再加入磷酸缓冲液和1%铁氰化钾溶液各2ml，混匀，在50下水浴20min。加入10%三氯乙酸溶液2ml，震荡混匀后取2ml混合液，加入2ml蒸馏水和0.1%三氯化铁溶液0.4ml。静置10min，用蒸馏水为空白对照。在700nm处进行比色。若吸光度越大，则还原力越强。为了减小误差，每一样液浓度梯度测三组平行样，最后取其平均值。2.2.3 DPPH法 DPPH9在有机溶剂中是一种稳定的自由基，其醇溶液呈紫色，具有单一电子，故能接受一个电子或氢离子，DPPH的单电子被捕捉而使其颜色变浅，在最大光吸收波长处的吸光值下降，且下降程度呈线性关系，从而评价药物的抗氧化能力。此抗氧化能力用抑制率10来表示。抑制率越大，抗氧化性越强。取2mlDPPH乙醇溶液于试管中，加入2ml样液，混匀，室温静置30min，在510nm处测定吸光度。计算DPPH法的清除率。清除率=（A0-A1)/A0*100%式中：A0是不加样液而加入2ml蒸馏水的空白对照吸光度值；A1是加入样液的吸光度值。3 结果 图1中药复方对羟自由基的清除能力Fig.1 Scavenging effects of the Chinese herbal medicine on hydroxyl free radicals图2还原力测定的吸光度Fig.2 Reducing activity of the Chinese herbal medicine 图 中药复方对DPPH自由基的清除作用Fig.3 Scavenging effects of the Chinese herbal medicine on DPPH free radicals 4 讨论本实验采用清除羟自由基、铁离子还原能力、清除DPPH自由基3方法分别进行了体外抗氧化实验，实验结果表明，中药复方在还原力以及对两种自由基的清除作用时，均表现出了不同程度的抗氧化能力。中药复方在对OH和DPPH自由基的清除作用，是随着样液的浓度增加而增强。此中药复方对于预防和治疗衰老性疾病有一定的作用，对于多种自由基均具有很强的清除能力，因此是具有潜力的抗氧化剂资源，可以作为一种有效的自由基清除剂，是理想的抗氧化剂之一，其在食品、化妆品以及药品方面有广泛的开发应用前景。分光光度法可较准确地测定羟自由基的清除规律，方法简便，仪器简单，测定快速，稳定性好，易为一般实验室所采用。因此，本体系的建立对鉴定清除羟自由基的抗氧化剂，研究清除羟自由基的机理有一定的应用价值。本实验在计算羟自由基的清除能力时，浓度为1mg/ml的样液，清除率为3.09%。浓度为0.5mg/ml的样液清除率则为负值，那么样液的清除率最低是多少？还有待于进一步研究。 还原力测定时，在所有浓度的样液中，样液浓度为8mg/ml时，吸光度值最大，如果浓度再大，吸光度值会升高吗？最大值将是多少？有待于进一步研究。自由基与机体的许多功能障碍和疾病的发生密切相关。因此，研究自由基的检测方法并探讨抗氧化剂对自由基的清除作用具有重要意义。DPPH 的稳定性主要来自共振稳定作用及3个苯环的空间障碍，而使夹在其中间氮原子上的不成对电子不能发挥其应有的电子成对作用。将DPPH 自由基清除试验应用于药物抗氧化活性的比较研究。DPPH 体外抗氧化实验的特点是快速、灵敏，可检测到不同浓度的样品具有的直接抗氧化能力，从而进行活性比较，同时，也能对样品的抗氧化有初步的了解。DPPH 法测定清除率时，对照组中加的是蒸馏水，如果对照用乙醇，清除率会有较大变化吗？还有待于进一步研究。参考文献:1 杨明慧,何丽仙,李珍贵.分光光度法测定Fenton体系产生的羟自由基J.大理学院学报,2007,6(4):38-40.2 楚文靖,滕建文,夏宁,等.紫甘薯酒抗氧化活性的研究J.酿酒科技,2007(12):43-46.3 宋立霞,王向社,吴紫云,等.羟自由基吸收能力测定方法的研究进展J.食品研究与开发,2008,29(12):166-170.4 崔桃,王婷,和勇,等.褪色光度法测定Fenton体系中产生的羟自由基J.大理学院学报,2010,9(10):37-39.5 朱琳娜,何争光,吴超.NR光度法测定Fenton试剂所产生的羟基自由基J.福建分析测试,2006,15（3）:10.6 徐贵华,张凤梅,张磊.果蔬食品体外抗氧化方法研究进展J.食品研究与开发,2010,31(11):215-2