生物技术毕业设计（论文）-鼠间充质干细分离培养及细胞形态特征研究.doc

学号： 20077140002 潍坊医学院本科生毕业论文（设计）题 目：大鼠间充质干细分离培养及细胞形态特征研究姓名专业生物技术年级、班级2007级本班部、系(院)药学与生物科学学院指导教师姓名专业技术职务2011 年 6月 24日潍坊医学院本科生毕业论文（设计）诚信声明本人声明：所呈交的毕业论文（设计）是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，论文中引用他人的文献、数据、图件、资料均已作明确标注，论文中的结论和结果为本人独立完成，真实可靠，不包含他人成果及为获得潍坊医学院或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。论文作者签名： 日期： 年 月 日潍坊医学院本科生毕业论文(设计)版权使用授权书本毕业论文作者完全了解潍坊医学院有关保留、使用毕业论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权潍坊医学院可以将本毕业论文全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本毕业论文。本人离校后发表或使用该毕业论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名单位仍然为潍坊医学院。论文作者签名： 日期： 年 月 日指导教师签名： 日期： 年 月 日目 录中文摘要- 1 -ABSTRACT- 2 -1 前 言- 3 -2 实验材料和实验器材：- 4 -2.1 实验动物- 4 -2.2 主要实验仪器及试剂- 4 -3 实验方法：- 5 -3.1 间充质干细胞的分离:- 5 -3.2 原代培养：- 5 -3.3 传代培养：- 6 -3.4 不同培养基的比较- 6 -4 实验结果：- 7 -结 论- 8 -参考文献- 10 -综 述- 12 -致 谢- 17 -中文摘要目的:通过大鼠见间充质干细胞的分离与体外培养和鉴定，进一步探讨人类间充质干细胞体外培养与移植的可行性。方法:全骨髓培养法，即提取大鼠骨髓细胞，在适当条件下分离大鼠间充质干细胞，并对其进行原代与传代培养，观察其形态和生理形态。结果:成功分离和得到大鼠间充质干细胞：MSCs原代培养72h后，此时细胞已基本贴壁，细胞变大、变形、形态不一。有的呈梭形，多角形，有少量突起，有的呈圆形，以后每34d半量换液一次，一般约10 d细胞可达基本融合。刚传代的细胞呈圆形，24h内完全贴壁，形态较均一，呈长梭形或三角形，胞核圆而明显，呈漩涡样生长。传代细胞生长较快，一般57d可达融合结论: 大鼠见间充质干细胞的分离与体外培养的结果很成功。得到分离的原代细胞和传代细胞。因此对于大鼠的间充质干细胞的培养技术基本成熟，可考虑进一步对人类间充质干细胞进行培养和研究。关键词：间充质干细胞；细胞培养；细胞形态结构 ABSTRACTObjective: to the rat saw the separation of mesenchymal stem cells in vitro and identification with, further discussing human mesenchymal stem cells in vitro feasibility of cultivating and transplantation. Methods: all the marrow culture method, named bone marrow cells extracted from rats, under appropriate conditions separation rat mesenchymal stem cells, and carries on the original generation and cultivation, and observe the nestin morphological and physiological form. Results: successful separation and get rat mesenchymal stem cells: 72h MSCs original generation after training, when cells have basic stick. wall, cell greater, deformation, the shape is differ. Some have a spindle, polygonal, a small bumps, some assumes the circular, every 3 after 4d half quantity change fluid time, generally about 10 d cells can reach basic fusion. Just the cell assumes the circular, nestin within 24h stuck completely wall, form a uniform, show long fusiform or triangle, the nucleus round and obvious, the keratocysts grow samples. Nestin cell growth faster, general 5 7d can amount to merge.Conclusion: rat saw mesenchymal stem cells in vitro of separation and the result was a success. Get the original generation cells and separation nestin cells. Therefore, as for rats mesenchymal stem cells cultivation technology basic mature, can consider further on human mesenchymal stem cells for training and research. Keywords: Mesenchymal stem cells; Cell culcure; Cell morphology structure1 前 言骨髓充质干细胞(bone marrowderived Mesenchymalstemcells，BMSCs)是骨髓内除造血干细胞(hematopoietiestemeels，HSC)之外的另一类干细胞，是骨髓造血微环境的重要组成部分，在体内外均具有支持和调控造血的作用。在临床应用上有很高的潜力，特别是在组织与细胞移植方面有很高的应用价值1：把BMSCs运用于临床疾病的治疗，比如心血管疾病、血液系统疾病、神经系统疾病及外科损伤等领域的治疗。在这些领域的研究中有很多已经获得成功，因此BMSCs有着广阔的临床应用前景。不同物种的BMSCs体外培养的形态学特征大致相同,主要表现为梭形、纺锤形,少数为多角形。所以采用大鼠骨髓间充质干细胞来作为模型。 目前, BMSCs的分离方法主要有以下几种: (1)全骨髓培养,是将无菌抽取的骨髓加入培养液制成细胞悬液并培养,原代培养培养物以造血细胞成分居多,为利于BMSCs的贴壁生长,可采用DMEM和胎牛血清培养。BMSCs对营养要求高,胎牛血清终浓度为10% 20%5 ,有人认为红细胞会随着换液而逐渐被自然去除,对BMSCs影响不大。细胞融合后以1: 2 比例传代, 3 4 天换液一次2;(2)离心培养法3,是根据骨髓中细胞成分比重的不同,采用离心分离法提取单核细胞进行培养。在新鲜无菌的骨髓抽取物中加入抗凝培养液稀释15002000 r/min离心2030min,采集交界处的单核细胞层, PBS洗涤23次后,加入培养液接种培养6; (3)细胞表面分子标记4分选法,主要是根据BMSCs的细胞表面分子特征来分离。一般采用流式细胞仪、免疫磁珠或免疫沉积法来进行分选。但由于目前仍未找到BMSCs特异性的细胞表面标记物该法较少采用。影响BMSCs扩增的主要因素: (1)血清:血清对大量扩增BMSCs起着重要的作用,不同浓度的血清对培养BMScs纯度的影响亦较大,常用10% 20%7的胎牛血清培养BMSCs; (2)接种密度: BMSCs的体外扩增速度与其接种密度也有关,一般认为较低密度种植有益于增殖。高密度接种后细胞生长较慢其原因可能是由于细胞间的接触抑制,或细胞释放到培养基中的因子影响了BMSCs的生长;(3)细胞因子:一些细胞因子对于维持BMSCs增殖和未分化状态亦十分重要。因此本实验采用该法进行间充质干细胞的分离培养方法。2 实验材料和实验器材：2.1 实验动物成年SpragueDawley(SD)大鼠，雌雄不限，重量120-180g左右，由山东中医药大学购买。2.2 主要实验仪器及试剂ESPECBNA一3I1型CO2培养箱(美国)倒置相差显微镜(日本OLYMPUS)，L-DMEM培养基和IMDM培养基(美国Gibco)，胎牛血清(抗州四季青生物工程有限公司)，胰蛋白酶(美国Sigma公司)、正常山羊封闭血清（武汉博士德生物工程有限公司），兔抗大鼠神经元特异性烯醇化酶(NSE，北京中山试剂公司)，兔抗大鼠神经丝蛋白(NF，北京中山试剂公司)，兔抗大鼠胶质纤维酸性蛋白(GFAP，北京中山试剂公司)，羊抗兔二抗(北京中杉金桥试剂公司)，碱性成纤维生长因子(bFGF，美国R&D公司)，酶联免疫检测仪450型 (Bio一RAD公司) ，80万U/瓶的青霉素和100万U/瓶的链霉素，-巯基乙醇、二甲基亚砜（DMSO）等。3 实验方法：3.1 间充质干细胞的分离培养基的制备：（1）DMEM培养基：将干粉型培养基溶于总量1/3的三蒸水中，再用1/3水冲洗包装内面两次，倒入培养液中，以保证所有干粉都溶解成培养液。搅拌使其溶解,补加3.7g NaHCO3，以便调节PH值。将青霉素为80万U/瓶的青霉素，溶解在4ml体积内，每1000ml培养液中加0.5ml，即成最终浓度为100U/ml。将100万U/瓶的链霉素，溶解到5ml体积内，也是每1000ml加0.5ml，使其最终浓度为100g/ml。调节培养液的pH值为7.27.4。1000毫升容量瓶定容。过滤法除菌。分装于玻璃瓶中，加入DMEM和胎牛血清（约20%）。（2）同时按上面方法配置IMDM培养基。与DMEM培养基共同放置于4冰箱保存备用。干细胞分离：取4周龄SD大鼠1只，颈椎脱臼法处死，无菌条件下分离股骨和胫骨，用医用剪刀剪去骨两端，剔除附着于骨头上的肌肉等软组织7，用10ml含10%胎牛血清的L-DMEM培养基反复冲洗骨髓腔，将骨髓冲洗入培养瓶中， 直至髓腔发白，将获得的冲洗液充分吹打均匀，分装于培养瓶中，使细胞悬液的量以覆盖后略高于培养瓶底部为宜。置CO2培养箱内，5CO2，37静置培养。3.2 原代培养：培养开始后24h后半量换液，72h后全量换液，以后每三天换液一次。待细胞生长接近融合（约培养10-14d）时，加入0.25%胰蛋白酶消化，370C，3-5分钟，倒置相差显微镜下控制消化，当细胞回缩、变圆、间隙增大时，立即加入含胎牛血清的培养液，终止消化。一般35d，原代培养细胞可以黏附于瓶壁，并伸展开始生长，可补加原培养液量12的新培养液，继续培养23d后换液，每日于倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况，待细胞增殖到覆盖培养瓶底的80-90时， 以0.25胰酶+0.02EDTA进行消化，以1106的密度进行传代培养 。3.3 传代培养：倒掉培养瓶内旧培养液。向瓶内加入胰蛋白酶液和EDTA混合液少量。以能覆盖培养瓶底为宜。置37孵箱或室温(25温度)下进行消化，25min后把培养瓶放在倒置显微镜下进行观察，当发现胞质回缩、细胞间隙增大后，应立即中止消化吹打细胞使其分散成单个细胞，调整细胞浓度，按照1:2传代培养，每3d换液一次，传代细胞于24h内贴壁，呈梭形。传代时利用骨髓间充质干细胞较淋巴细胞、单核细胞易脱落的特点，保证MSCs在短时间内与瓶底分开，而淋巴细胞、单核细胞因贴壁较强仍贴附于培养瓶底，通过MSCs的这种贴壁生长特性，每次换液去除悬浮生长的造血细胞和其他的一些细胞，从而使得MSCs得到很好的分离纯化。3.4 不同培养基的比较比较间充质干细胞在DMEM和IMDM不同培养基的生长情况。观察细胞贴壁时间，对数生长期的时间。4 实验结果：接种后第三天细胞开始贴壁生长细胞变大、变形、形态不一。有的呈梭形，多角形，有少量突起，有的呈圆形，对其换液，之后每3天换液共换液4次，此时细胞贴壁率大约90%左右开始传代培养刚传代的细胞呈圆形，24h完全贴壁，形态较均一，呈长梭形或三角形，胞核圆而明显，呈漩涡样生长。这与其他干细胞和骨髓中其他种类的细胞有很大的不同。骨髓其他细胞大部分游离于培养液中，而间充质干细胞则贴于细胞培养瓶壁上这样换液后大多数其他细胞被除去，大量间充质干细胞则留于培养瓶中进一步传代培养。传代细胞生长较快，一般57d可达融合，本实验经分离纯化获得均一生长的长梭形或多角形贴壁细胞便是间充质干细胞，但可见还有部分骨髓细胞残留，所以通过反复传代后贴壁细胞形态趋于均一，且细胞表型更为纯化。如此多次传代后间充质干细胞基本达到实验要求。可方便观察和研究形态。因为间充质干细胞与其他干细胞和骨髓中其他种类的细胞在形态上有很大的不同。同时不同物种的BMSCs体外培养的形态学特征大致相同。因此可很容易的从细胞培养集中找到间充质干细胞。通过观察细胞生长可以发现：DMEM也可以也可以很好的分离培养骨髓间充质干细胞，但是比较了一下IMDM比DMEM细胞生长的更快，而且状态更好。结 论骨髓中含有多种细胞，包括基质细胞，血管细胞，脂肪细胞，成骨细胞，破骨细胞，造血干细胞和间充质干细胞8。以前认为骨髓中细胞的功能只是骨髓内细胞再生和再生循环血细胞。现在的研究揭示骨髓干细胞有分化成多种细胞的潜能9。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal体外分离培养后能向各种结缔组织和部分来源于外胚层的组织分化，形成脂肪细胞、肌细胞、软骨细胞、神经细胞、内皮细胞和成骨细胞等10-11 。它与胚胎干细胞相比具有明显优势，不存在免疫排斥、畸胎瘤及伦理等问题，是理想的组织工程种子细胞。而且它可使外源基因导人和表达，是潜在的基因治疗靶细胞。探索理想的BMSCs体外培养扩增方法具有重要的理骨髓中间充质干细胞的含量较低,约为0.001%-0.01%12 难以满足组织工程和细胞治疗的需要，且易与其他细胞相混杂所以必须选择含有更高骨髓的部位进行细胞提取，又因为大鼠骨骼太小不易于骨髓提取所以一般意义上采用提取大鼠两只股骨和胫骨骨髓组织作为一个折中的方法。目前用于分离间充质干细胞的方法主要有四种：贴壁法,流式细胞仪分离法,密度梯度离心法和免疫磁珠法。贴壁细胞分离法是最早的方法。是根据间充质干细胞具有在塑料组织培养瓶中贴壁生长的特性对其进行分离,又因为大鼠两只股骨和胫骨骨髓组织含量较少经过穿刺吸取或本实验所采用的剪去骨端用培养液冲洗所能得到的骨髓组织就更少。密度梯度离心法即根据骨髓中各细胞成分比重的不同，分离单核细胞进行贴壁培养。二者本质上无多大区别。但离心法需要更多的材料同时Lisignoli等13-14， 指出使用密度梯度离心法易使BMSCs向成骨细胞分化，而降低了向其他方向分化的能力。流式细胞仪法、免疫磁珠法为新型方法，但经过流式或磁珠分选后的细胞出现了增殖缓慢等一些问题，加之成本较高和技术的难度，在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。大鼠骨髓组织量少不足以采用除贴壁法以外的3种方法分离间充质干细胞（三种方法需要大量骨髓，比较适用于大型动物）,对初次培养者来说，贴壁法分离骨髓间充质干细胞操作简单易掌握，不易发生污染，是一个较好的分离方法。贴壁分离法根据骨髓中间充质干细胞贴壁生长，而血细胞和造血干细胞悬浮生长的特性将其分离开来,可方便可靠的分离出间充质干细胞。缩短了培养前操作时间，细胞也具有很好的分化潜能，与以往文献结果相似15。关于细胞鉴定方面经过十几年的研究近年来对间充质干细胞的细胞表面标记的研究已经取得了一些成果。MSCs必须表达CD105、CD44、CD90等，同时不表达造血干细胞的表面标记，包括CD34、CD45、CD14、CD1lb等16-17对于观察方面，采用透明培养瓶并用倒置显微镜观察细胞生长和形态可以方便清楚地观察细胞。又因为采用这种方法得到的细胞是活体有很高的生物活性，因此可进一步观察细胞形态的正常形态和形态变化。同时为以后研究骨髓间充质干细胞的分化提供大量材料18。体外培养的间充质干细胞呈长梭形或三角形，胞核圆而明显，能以自我繁殖的方式增殖，不表达分化相关的细胞标志，也不表达造血干细胞的表面标志。这说明间充质干细胞有很强的增值能力，可以人工大量生产。进而可想象只需提取少量的间充质干细胞就可培养大量细胞组织，对以后的大规模组织移植和组织分化提供了条件。BMSC最重要的特性是具有多项分化潜能，针对不同的分化方向采用不同的诱导剂，通过体外贴壁培养，可分化为多种造血以外的组织细胞，特别是来源于中胚层和神经外胚层的组织细胞19。另一方面因为自体骨髓细胞移植无免疫排斥10，所以在血管疾病、血液系统疾病、神经系统疾病及外科损伤等领域的治疗方面可得到很好的应用。参考文献1 刘瑶瑶 ，陶玉香. 骨髓间充质干细胞的生物学特性及其应用进展J. 西部医学2009, 21（8）：1395-1397.2 舒胜文，李盛琳，马绪臣大自鼠骨髓间质干细胞体外培养体系的建立及分化研究J现代口腔医学杂志，2002，2(16)：97993 Pittenger MF，Mackay AM，Beck SC，et a1Muhilineage potential of aduh human meaenehymal stelTl cellsJScience，1999，284(541 1)：143-1524 Dolbeare F，Selden JRImmunochemical quantitation of bromedeoxyuridine：application to cellcycle kineticsJMethods Cell Biol，1994，41(4)：297-316.5 刘瑶瑶 ，陶玉香，徐海伟,骨髓间充质干细胞的生物学特性及其应用进展J西部医学2009.8.21 (8) (Med J West China，August 2009，Vo121，No8),257-2676 Liu L，DiGirelamo CM，Navarre PA，et a1Tclomerase deficiency impairs diferentiation of mesenchymal stem cellsJExp Cell Res，2004，294(1)：187 王宇，魏书艳，史小琴，王燕，张明艳。许文杰大鼠骨髓问充质干细胞的分离培养及rhEGF对其增殖的影响J细胞与分子免疫学杂志(Chin J Cell Mol Immuno1)2010，26(4):1244-1250.8 周丽娜 谢华。改良法体外分离培养成年大鼠骨髓间充质干细胞实验研究J 解剖学研究2010年第32卷第2期Anat Res，2010，Vo132，No2,165-174.9 王廷华，羊惠君 干细胞理论与技术M北京：科学出版社，2005.3（21世纪生物技术丛书）10Pittenger MF，Mackay AM，Beck SC，以 Multilineage potential of adtct humanmesenchymal stem cellsJScience，1999，284(5411)：14314711Devine SMMesenchymal stem cells：will they have a role in the dinicJ，J Cell Biochem(supp1)，2002，38(85)：73-77 .12Pittenger MF,Mackay AM,BeckSC,et al.Multilinage potential of adult human mesenchmal stemcellJ.Science,1999,284(5411);143-147.13Lisignoli G，Remiddi G，Cattini LAn elevated number of differentiated osteoblast eolonies Can be obtmned from rat bone martw stromalcells using a gradient isolation procedureJConnect TissueRes，2001，42(1)：495714刘品端，王伟，梅晰凡大鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养J中国临床康复，2005，9(18)：3841 .15连霞骨髓问充质干细胞生物学特性及其多向分化潜能的理论基础和机制J临床医药实践，2006，15(3)：11213316邢承忠，洪晶，顾绍峰，等兔骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定J中国医科大学学报，2008，37(1)：4-517Lee JW，Gupta N，Serikov V，et a1Potential application ofmesenchymal stem cells in acute lung injuryJExpert0pin Biol Ther，2009，9(10)：12591270 .18 刘瑶瑶 ，陶玉香。 骨髓间充质干细胞的生物学特性及其应用进展J. 西部医学2009, 21（8）：1395-1397.19 博杰，蒋迎九， 姜蓉。骨髓间充质干细胞定向分化为心脏瓣膜构成细胞及鉴定J Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research July 2，2010 VoL14,No27,2578-2579.20Smits AM,van Vliet P,Hassink RJ,et al.The role of stem cells in cardiac regeneration.J Cell Mol Med.2005;9(1):25-36.综 述1.BMSCs的生物学特点骨髓问充质干细胞(BMSCs)是一类从骨髓中分离的具有强大增殖能力和多向分化能力的干细胞，后来有许多研究表明1，骨髓以外的其他器官也广泛存在着具有多向分化潜能的干细胞，体内所有这类干细胞统称为问充质干细胞它在一定条件下可分化为骨、软骨、脂肪、肝、神经、心肌等多种组织细胞2。体外培养的BMSCs细胞体积较小，呈梭形，核浆比大，在培养体系中倍增时间约为33小时。BMSCs 20 处于G。期，非增殖状态的BMSCs特异性表达鸟氨酸脱羧酶抗酶蛋白。BMSCs具有广泛的细胞因子表达谱，包括造血因子、非造血生长因子、白细胞介素、趋化因子等，3提示BMSCs对维持骨髓微环境有重要作用。BMSCs也表达多种生长因子和细胞因子受体以及细胞间黏附作用的受体，提示BMSCs的功能受自分泌和旁分泌循环的调控。BMSCs不仅参与诱导、调节骨髓造血干细胞和基质细胞的发育，而且可以促进细胞外基质分子的有序排列。2. BMSCs的分离方法2.1 全骨髓培养，是将无菌抽取的骨髓加入培养液制成细胞悬液并培养，原代培养培养物以造血细胞成分居多，为利于BMSCs的贴壁生长，可采用DMEM和胎牛血清培养。BMSCs对营养要求高，胎牛血清终浓度为10 一20 ，有人认为红细胞会随着换液而逐渐被自然去除，对BMSCs影响不大。细胞融合后以1：2比例传代，34天换液一次4 ；2.2 离心培养法5，是根据骨髓中细胞成分比重的不同，采用离心分离法提取单核细胞进行培养。在新鲜无菌的骨髓抽取物中加入抗凝培养液稀释15002000rmin离心2030min，采集交界处的单核细胞层，PBS洗涤23次后，加入培养液接种培养；2.3 细胞表面分子标记分选法，主要是根据BMSCs的细胞表面分子特征来分离。一般采用流式细胞仪、免疫磁珠或免疫沉积法来进行分选。但由于目前仍未找到BMSCs特异性的细胞表面标记物6该法较少采用。3影响BMSCs扩增的主要因素3.1 血清：血清对大量扩增BMSCs起着重要的作用，不同浓度的血清对培养BMScs纯度的影响亦较大，常用10 一207的胎牛血清培养BMSCs；3.2 接种密度：BMSCs的体外扩增速度与其接种密度也有关，一般认为较低密度种植有益于增殖。高密度接种后细胞生长较慢其原因可能是由于细胞间的接触抑制，或细胞释放到培养基中的因子影响了BMSCs的生长；3.3 细胞因子：一些细胞因子对于维持BMSCs增殖和未分化状态亦十分重要；3.4 动物种属：一般认为BMSCs的生长特性相似，但也有资料显示BMSCs生长特点有种属差异。4. 大鼠BMSCs的原代提取、扩增和纯化取4周龄SD大鼠1只，无菌条件下取出双下肢股骨和胫骨，剔除附着于骨头上的肌肉等软组织， 以L-DMEM液反复冲洗骨髓腔， 直至髓腔发白，将获得的冲洗液充分吹打均匀，以200目筛网过滤，获得单细胞悬液，将此单细胞悬液转移到离心管中，以1 000 r，min离心5 min，吸除上清液，将获得的细胞再次以LDMEM液重悬后，接种于塑料培养瓶中。72 h后首次换液，以后每隔两三天换液1次，培养体系为体积分数为1O胎牛血清+90L_DMEM。每日于倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况，待细胞增殖到覆盖培养瓶底的80-90时， 以025胰酶+O02EDTA进行消化，以110 的密度进行传代培养。85. 存在问题和展望尽管近年来对骨髓MSCs的研究取得了很大进展，但仍然存在下列问题有待解决：(1)骨髓间充质干细胞缺少特异性表面标志物，对其鉴定困难，只能结合其形态和部分表面标志物进行综合判断。目前对于干细胞也仅限于功能上的定义，而没有足够的形态学和表型上存在的证据。因此在分离提取间充质干细胞时，由于对于细胞的特性尚缺乏足够的了解，使分离方法几乎不可能达到完全纯化9；(2)BMSCs培养过程中的异质性，影响了干细胞分离纯化的效果。长期培养发现，BMSCs多次传代后，并不能保留其分化能力。对于传代后MSCs分化能力丧失的原因，近来有人认为与端粒酶缺失有关10，依据是端粒酶基因敲除后的小鼠骨髓BMSCs，即使是早期的BMSCs也不能分化为软骨细胞和脂肪细胞11。MSCs易于外源基因的转染和表达，在细胞治疗和基因治疗中也有着广泛的应用I 3_，但骨髓中MSCs含量很少，每1x105-1xl0 个单核细胞中大约有1个MSCsl 4l，难以满足组织工程和细胞治疗的需要，因此体外纯化和扩增尤其重要。本实验体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞，观察其增殖和生长特性，并探讨人重组表皮生长因子(recombinant human epidermal growth factor，rhEGF)对其体外增殖的影响。尽管对间充质干细胞的特性还有很多未知，但由于BMSCs具有多向分化潜能和高增殖特性，取材容易，对机体损伤小，易于基因操作，组织相容性好等优点，被认为是组织工程和基因工程理想的靶细胞12。同时，在临床应用上有很高的潜力，特别是在组织与细胞移植方面有很高的应用价值：把BMSCs运用于临床疾病的治疗，比如心血管疾病、血液系统疾病、神经系统疾病及外科损伤等领域的治疗13。在这些领域的研究中有很多已经获得成功14，因此BMSCs有着广阔的临床应用前景15。迄今在MSCs的研究还存在许多问题和争议，也显示出好的预兆和前景。人们将在不远的将来一定会阐明其多向分化潜能的本质，并掌握其规律，使BMSCs更好地造福人类。参考文献1Gafni Y，Turgernan G，Libergal M，et aiStem cells as vehicles for orthopedic gene therapyJGene Ther，2004，11(4)：417-4272 Jaiswal N，Haynesworth SE，Caplan AI，et a1Osteogenic differentiation of purified，cultureexpanded human mesenchymal stem cells in vitroJJ Cell Biochem，1997，64(2)：295-3053 刘瑶瑶 ，陶玉香, 徐海伟,骨髓间充质干细胞的生物学特性及其应用进展J西部医学2009.8.21 (8):154-167.4 舒胜文，李盛琳，马绪臣大自鼠骨髓间质干细胞体外培养体系的建立及分化研究J现代口腔医学杂志，2002，2(16)：97-995 Pittenger MF，Mackay AM，Beck SC，et a1Muhilineage potential of aduh human meaenehymal stelTl cellsJScience，1999，284(541 1)：143-1496 Dolbeare F，Selden JRImmunochemical quantitation of bromedeoxyuridine：application to cellcycle kineticsJMethods Cell Biol，1994，41(4)：297-316.7 刘瑶瑶 ，陶玉香. 骨髓间充质干细胞的生物学特性及其应用进展J. 西部医学2009, 21（8）：1395-1397