棉花航天诱变芽黄突变体中棉所58Vsp的遗传及基因表达差异分析-硕士论文

aV i r e s c e n tM u t a n t C C R l 5 8 V s pb yS p a c eM u t a t i o n 研究生：杨兆光 指导教师：喻树迅研究员 专业：作物遗传育种 申请学位名称：农学硕士 研究方向：棉花遗传育种 申请学位时间：2 0 1 0 年6 月 华中农业大学植物科学技术学院 二。一。年六月 l l I m l l l l l l l l l l I I l l I l l l I l I l I I I m m I Y 17 9 9 3 c 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 舌 如需保密，解密时闻年月日 是否保密 独创性声明 本人声明所星交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特剐加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 弼使用过的材料，指导教| I l 爹对此进行了审定与我一同工作的弱志对本研究所做的任 何贾献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谶意 研究生签名：物疹l ；l j 对阕：7 盯护年月砂细 学位论文使用授权书 本入完金了解华中农业大学关予保存，使用学位论文的规定，帮学生必须按照学 校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子舨， 并提供目录梭索和阅览服务，可以采用影路、缩印或扫描等复钢手段保存，汇编学位 论文本人潮意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全 部或部分内容，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力。 注：保密学位论文( 弹涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论 文) 在解密后适用于本授权书 学雠文作秘名：扬茅匕扎导师始输恐歹 签名器期：硼。年上月归签名日期：砌年，月矽日 淀：请将本袭真接装订在学位论文的扉页和目蒙之间 棉花航天诱变芽黄突变体中棉所5 8 V s p 的遗传及基因表达差异分析 曰永 摘要I A b s t r a c t I I I 英文缩略语表V 第一章前言一1 1 棉花芽黄突变体的研究现状1 1 1 陆地棉芽黄突变体的遗传研究l 1 1 1 陆地棉芽黄突变体的遗传鉴定2 1 1 2 芽黄基因部分同源关系2 1 1 3 双隐陆芽黄基因v 1 6 v 1 7 遗传的剂量效应3 1 2 芽黄突变性状与棉花杂种优势利用3 1 2 1 棉花杂种优势利用现状3 1 2 2 利用指示性状生产杂种种子的可行性4 1 2 3 芽黄指示性状的杂种优势利用4 1 2 4 雄性不育系芽黄品系的利用5 2e D N A A F L P 研究进展：6 2 1 c D N A A F L P 技术的原理与应用一7 2 1 1e D N A A F L P 技术的原理7 2 1 2e D N A A F L P 技术的应用7 2 2e D N A A F L P 技术的缺点lO 3 研究的意义与目的1 0 4 研究路线11 第二章材料与方法1 2 1 中棉所5 8 V s p 的农艺性状调查及遗传学分析1 2 1 1 试验材料1 2 1 2 试验方法1 2 2 中棉所5 8 V s p 的生理生化物质测定及细胞超微结构观察1 3 2 1 材料种植1 3 2 2 叶绿素及其叶绿素合成前体物质的测定1 3 2 3 叶绿体透射电镜15 3c D N A A F L P 1 5 3 1 试验材料15 3 2 试验方法1 6 3 2 2c D N A A F L P 乡子析17 3 2 3 差异片段的回收和再扩增2 3 3 2 4 连接与转化2 4 3 2 5 特异片段的回收和二次P C R 一2 6 3 2 6T D F s 的克隆、测序及序列分析2 7 华中农业大学2 0 1 0 届硕上研究生学位论文 4 相关T D F s 的克隆及Q R T - P C R 分析2 7 4 1G h C h 船J 基因的克隆2 7 4 2 基因全长e D N A 序列及其编码氨基酸序列的结构特征和分子进化分 析：1 7 4 3G hC h l G l 基因的时空表达分析2 8 第三章结果与分析3 0 l 中棉所5 8 V s p 和中棉所5 8 农艺性状及遗传学分析3 0 1 1 棉花芽黄材料的表现情况3 0 1 2 中棉所5 8 V s p 芽黄性状的遗传模式3 l 1 3 基因等位性鉴定3 1 2 中棉所5 8 V s p 的生理生化物质测定与细胞超微结构观察3 3 2 1 中棉所5 8 V s p 不同叶龄叶绿素相对含量的变化3 3 2 2 中棉所5 8 V s p 不同叶龄的色素含量变化3 5 2 3 叶绿素合成前体物质含量变化分析3 7 2 4 中棉所5 8 V s p 叶绿体的超微结构分析3 7 3c D N A A F L P 4 0 3 1R N A 的提取和d se D N A 的合成4 0 3 2 预扩增及选择性扩增4 1 3 3e D N A A F L P 分析4 2 3 3 1 不同基因的表达模式4 2 3 3 2 回收、纯化二次P C R 检测4 2 3 4 特异扩增条带的测序和生物信息学分析4 3 4 相关基因的克隆及荧光定量分析4 4 4 1G 办劬，G J 基因全长的获得4 4 4 2 棉花G hC h l G l 基因全长e D N A 序列及其编码氨基酸序列的结构特征 分析4 5 4 3 棉花G hC 忍，G J 基因的同源性和分子进化分析4 7 4 4 中棉所5 8 V s p 和野生型中叶绿素合成酶基因的序列分析4 9 4 5 棉花叶绿素合成酶的时空表达分析5 2 第四章讨论5 3 1 经航天诱变获得一份芽黄材料一中棉所5 8 V s p 5 3 2 叶绿体的发育程度与叶绿素含量有很大关系5 3 3e D N A A L F P 技术在棉花中进行基因表达差异的可行性5 4 4 棉花叶绿素合成酶基因的效用5 5 第五章全文结论一5 7 参考文献5 8 致谢6 4 附录B L A S T 部分序列比对结果一6 5 附图l1 6 份芽黄材料的表型7 0 传及摹因表达差异分析 棉所5 8 V s p 为材料，从生理学、细 获得研究结果如下： 1 中棉所5 8 V s p 子叶表现绿色，芽黄性状从第一片真叶开始表现，一直持续到 盛花期结束。真叶从0 天到3 天叶龄，随芽黄性状加重表现为叶绿素相对含量- S P A D 值降低，之后叶色逐渐转绿，中棉所5 8 C R R l 5 8 V s p 的S P A D 值在3 5 天叶龄过程中增 大，之后趋于平稳，约经历9 天，叶子由芽黄转为正常绿色。遗传分析表明，C R R l 5 8 V s p 突变体芽黄性状由一对隐性核基因控制。基因等位性分析表明，中棉所5 8 V s p 芽黄 基因与棉花中期库中已知1 7 份芽黄材料的芽黄基因并不处于同等位点，初步确定中 棉所5 8 C R R l 5 8 V s p 是一个新的芽黄材料。 2 与野生型相比，中棉所5 8 V s p 叶片生长发育前期，叶绿素和类胡萝卜素含量 的积累速度较野生型慢，随着叶片发育进程的延长，中棉所5 8 V s p 中叶绿素和类胡 萝卜素含量不断增加，逐渐接近野生型的水平。3 天叶龄时，中棉所5 8 V s p 中叶绿 素合成前体物质A L A 的含量低于野生型，U r o g e nI l l 和C o p r o g e nI I I 积累量高于野 生型，其原因可能是中棉所5 8 V s p 叶片发育早期色素合成受阻，反馈调节前体物质 的合成，造成前体物质含量的减少或增加。 3 中棉所5 8 V s p 的叶绿体发育滞后j0 、3 天叶龄的叶绿体发育不良，3 天叶龄 的叶绿体的发育程度比0 天低，如：细胞之间的界限模糊、大多叶绿体为近圆形、 叶绿体膜破损严重、类囊体膜和基粒片层垛叠数减少、基粒排列不整齐。随着叶绿 体的发育，5 天叶龄中棉所5 8 V s p 的叶绿体有明显好转，虽然基质片层排列混乱， 但是基粒数、垛叠片层数增多、片层结构清晰、有淀粉粒等内含物的出现。7 - 9 天 叶龄时中棉所5 8 V s p 的叶绿体结构基本上达到野生型的状态，叶绿体结构的变化与 色素含量的变化相一致。 4 应用c D N A A F L P 技术，对中棉所5 8 V s p 和对照3 、5 、7 天叶龄进行表达差异 分析，共筛选了6 4 对引物组合，平均每个泳道有1 5 个条带，共扩增出约6 0 0 0 个条 带；成功获得T D F s7 9 条。其中与叶绿素合成、叶绿体发育、光合作用、信号传导 等有关的T D F s l 2 条。这些T D F s 可能与中棉所5 8 V s p 的芽黄性状相关。 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 5 利用电子克隆技术，分别在野生型和中棉所5 8 V s p 中获得叶绿素合成酶基因 G h C H L G l 和G h C H L G 2 。分析表明，中棉所5 8 V s p 和野生型该基因的序列有5 个碱基突 变，导致3 个氨基酸改变。在这两个材料中通过Q R T - P C R 技术对该基因进行表达谱 分析。相对于对照O 天叶龄来说，中棉所5 8 V s p 中该基因早期表达量低，3 天叶龄 上调，3 天及以后的表达量都等于或显著高于野生型的表达水平；对照中该基因的 表达量有一个上调一下调一上调表达的趋势。有可能是由于该基因的几个碱基的突变 导致了该现象的发生，有可能是导致中棉所5 8 V s p 芽黄性状的原因。 关键词：中棉所5 8 V s p ，遗传分析，c D N A A F L P ，叶绿体，叶绿素合成酶 I I 棉花航天诱变芽黄突变体中棉所5 8 V s p 的遗传及基因表达差异分析 A b s t r a c t I nt h i sr e s e a r c h , C C R l 5 8a n dC R R l 5 8 V s pw h i c ho b t a i n e db ys p a c em u t a t i o nw e r e u s e da st h em a t e r i a l s ，C R R l 5 8 V s pw e r es y s t e m a t i c a l l ya n a l y z e di nl e v e l so f p h y s i o l o g y ， c y o l o g ya n dm o l e c p l a rb i o l o g y T h er e s g l t sw e r ea sf o l l o w ： 1 I tw a s n ty e l l o wi nc o t y l e d o ni nC R R l 5 8 V s p ，t h ev i r e s c e n tp h e n o t y p ea p p - e a r e df r o mt h ef i r s tt r u el e a fu n t i lt h ee n do ff l o w e r i n gs t a g e I nC R R l 5 8 V s p ，F r o m0t o3 d a y so fl e a fo l d ，R e l a t i v ec o n m e n to fc h l o r o p h y l l S P A Dv a l u ed e c r e a s e di nt r u el e a v e s a sv i r e s c e n tt r a i ta g g r a v a t i o n ，a n da st h el e a v e st u r n e dg r e e n i n gg r a d u a l l y ，S P A Dv a l u eo f C R R l 5 8 V s pi n c r e a s e df r o m3 - 5d a y sa n dr e m a i n e ds t e a d i l ya f t e rt h a t ，t h e nl e a ft u r n e dt o b en o r m a lg r e e nf r o my e l l o wi na b o u t9d a y s G e n e t i ca n a l y s i ss h o w e dt h a tv i r e s c e n t t r a i ti sc o n t r o l l e db yap a i ro fr e c e s s i v ek a r y o g e n ei nC R R l 5 8 V s p A n a l y s i so fa l l e l i s m i n d i c a t e dt h a tC R R l 5 8 V s pw a sn o tt h es a m ea so t h e rk n o w n17v i r e s c e n tm a t e r i a l si n a c t i v ec o l l e c t i o n so fC R I C A A S ，C R R l 5 8 V s pi sp r i m a r i l yc o n s i d e r e dt ob ean e w v i r e s c e n tm a t e r i a l 2 C o m p a r i s o no fc h l o r o p h y l la m o u n to fC R R l 5 8 V s p t ot h ew i l d t y p ei n d i c a t e dt h a t d u r i n gt h ee a r l ys t a g eo fC R R l 5 8 V s p l e a fd e v e l o p m e n t ，c o n m e n to fc h l o r o p h y l la n dC a r - o t e n o i dw a sl o w e rt h a ni nw i l d t y p e ，w i t ht h ed e v e l o p m e n to fl e a f , c o n t e n t so fc h l o r o p - h y l la n dc a r o t e n o i di nC R R l 58 V s pi n c r e a s e dg r a d u a l l ya n dc l o s e dt ot h en o r m a ll e v e l A t 3d a y so fl e a fa g e ，t h ep r e c u r s o ro fc h l o r o p h y l li nC R R l 5 8 V s pw a sl o w e rt h a ni nw i l d ， w h i l et h ec o n t e n t so fU r o g e nI I Ia n dC o p r o g e n w e r eh i g h e rt h a nc o n t r 0 1 T h ep o s s - i b l er e a s o ni st h a tt h es y n t h e s i so fc h l o r o p h y l lw a si n t e r r u p t e dd u r i n ge a r l ys t a g eo fl e a f d e v e l o p m e n t ，t h e nt h ep r e c u r s o ro fc h l o r o p h y l lw a sa f f e c t - e db yf e e d b a c kr e g l al a t i o n ，a s ar e sUI t t h ea c c u mpl a t i o no fp r e c u r s o rw a si n c r e a s e do rd e c r e a s e d 3 T h e d e v e l o p m e n tc h l o r o p l a s t si nC R R l 5 8 V s pw e r es l o w e r t h a nw i l d t y p e I n C R R l 5 8 V s pc h l o r o p l a s t so f0 - 3d a y so fl e a fo l dw e r ed e v e l o p m e n t a la b n o r m a l i t y A n d d e v e l o p m e n to fc h l o r o p l a s t so f3d a y sw a sl o w e rt h a nt h a to f0d a y , e g b o u n d a r yo f c e l l sw a sn o tc l e a r , m o s to fc h l o r o p l a s t sw e r ec l o s et ob eg l o b g l a r , c h l o r o p l a s tm e m b r a n e w a sd a m a g e ds e v e r e l y , t h y l a k o i dm e m b r a n ea n dg r a n al a m e l l a ew e r er e d u c e d ，b a s a lg r a n 1 1 1 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 Ul ea r r a n g e d i r r e g I _ t l a r l y W i t ht h e d e v e l o p m e n t o fc h l o r o p l a s t s ，c h l o r o p l a s t si n C R R l 5 8 V s po f5d a y st u r n e db e t t e r , n u m b e ro fb a s a lg r a n I - t l ea n dg r a n al a m e l l a ei n c r e a s e d ，g r a n al a m e l l a es t r u c t u r ew a sc l e a r , s t a r c hg r a i na p p e a r e d A t7 - 9d a y sl e a fo l d ，t h e l x l t r a s t r u c t u r eo fc h l o r o p l a s t si nC R R l 58 V s pw e r es i m i l a rt ot h a to fw i l d - t y p e ，a n dt h e c h a n g e so fl x l t r a s t r u c t u r eo fc h l o r o p l a s ti nC R R l 58 V s pw e r es i m i l a rt ot h a to fp i g m e n t c o nt e n td u r i n gt h eg r e e n i n gp r o c e s s 4 D i f f e r e n t i a lg e n ee x p r e s s i o na n a l y s i so f3 ，5a n d7d a y sw a sp e r f o r m e du s i n g e D N A - A F L P t e c h n o l o g yi nC R R l 5 8 V s pa n dw i l dt y p e ，6 4p a i r so f p r i m e r sw e r es c r e e n e d ， 15b a n d sp e rl a n ei ne v e r o l d ，6 0 0 0b a n d sw e r ea m p l i f i e d ；7 9T D F sw e no b t a i n e d ，12o f t h e mi n v o l v ei np h o t o s y n t h e s i s ，c h l o r o p l a s td e v e l o p m e n ta n dl i g h ts i g n a lt r a n s d u c t i o n T h e s eT D F sm a yr e l a t et ot h ev i r e s c e n tt r a i to fC R R l 5 8 V s p 5 C h l o r o p h y l ls y n t h e t a s e - G h C H L G l a n dG h C H L G 2w e r eo b t a i n e db yE c l o n em e t - h o d A n a l y s i ss h o w e dt h a tt h e r ew e r e5m u t a t e db a s ei nG h C H L G 2g e n ec o m p a r e dw i t h G h C H L G l s e q u e n c e ，l e a d i n gt oc h a n g eo f3a m i n oa c i d s E x p r e s s i o np r o f i l ea n a l y s i sw a s p e r f o r m e db yQ R T - P C R T h eg e n ee x p r e s s i o na m o u n ti nC R R l 58 V s pi sl o w e rd u r i n g e a r l ys t a g ec o m p a r e dw i t hi t sc o n t r o lo f0d a yl e a fo l d ，a n du p r e g l x l a t e da t3d a y sl e a fo l d ， a f t e rt h a tt h ec o n t e n to fg e n eo fc h l o r o p h y l ls y n t h e t a s ew a sh i g h e rt h a no re q u a lt o C R R l 5 8 ；t h eg e n ee x p r e s s i o np a t t e r ni nw i l dt y p ei s ：u p - r e g l x l a t i o n - d o w n - - r e g t l a t i o n - u p - r e g p l a t i o n T h eg e n ee x p r e s s i o np a t t e r nw a sd i f f e r e n tb e t w e e nC C R l 58 V s pa n d C R R l 58m a y b et h er e s p l to fb a s em u t a t i o n ，a n dt h ev i r e s c e n tp h e n o t y p em a yb ec a u s e d b yt h eb a s em u t a t i o ni nC R R l 58 V s p K e yw o r d s ：C R R l 58 V s p ，G e n t i ca n a l y s i s ，e D N A - A F L P ，C h l o r o p l a s t ，C h l o r o p h y l ls y n t h e t a s e I V 棉花航天诱变芽黄突变体中棉所5 8 V s p 的遗传及基因表达差异分析 英文缩略语表 英文缩写英文名称中文名称 m m o lm i l l i m e t e r毫摩 d N T P d e o x y r i b o n u c l e o s i d et r i p h o s p a t e脱氧核糖核酸三磷酸 d d H 2 0 d o u b l ed i s t i l l e dw a t e r双蒸水 p Hh y d r o g e np o w d e r 酸碱度 山 m i c r ol i t e r微升 m m o l L m o l L i t e r 毫摩尔升 u m o l m i c r o m o l e微摩尔 E D T A E t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d乙二胺四乙酸 T R I S T r i s h y d r y m e t h y l a m i n o m e t h a n e 三羟甲基氨基甲烷 C T A BC e t y lt r i m e t h y la m m o n i u mb r o m i d e 十六烷基三甲基溴化铵 D N A d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d脱氧核糖核酸 E S T e x p r e s s e ds e q u e n c et a g表达序列标签 P C R Q u a n 1 a n V er e V e r s e transcripQRT P C R a s e 荧光定量P C R 、 荧光定量 p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n P C R P o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n聚合酶链式反应 O R F O p e nR e a d i n gF r a m e开放阅读框 A m p l i f i e df r a g m e n tl engAFLP t h 扩增片段长度多态性扩增片段长度多态性 p o l y m o r p h i s m e D N A C o m l e m e n t a r yD N A互补D N A E BE t h i d i u mb r o m i d e溴化乙锭 5 溴4 氯一3 吲哚p D 半 x 。g a l 5 - b r o m 。一c h l 。r 。3 抽d 。1 1 3 - D - g a l a c t o s i d e 乳糖甘 。 T D F s T r a n s c r i p tD r i v e dF a c t o r s转录衍生因子 L D - P C R L o n g d i s t a n c eP C R长距离P C R B l a s tB a s i cl o c a la l i g m e n ts e a r c ht o o l局部比对基本搜索工具 C h l a C h l o r o p h y l la 叶绿素a C h l b C h l o r o p h y l lb 叶绿素b C h l C h l o r o p h y l l叶绿素 C a r C a r o t e n o i d 1 3 胡萝卜素 V 析 。大多数纯合芽 是一种优良的指 ( 王学德，1 9 9 0 ) 。 棉花苗期叶片通常表现为绿色，自1 9 2 5 年在陆地棉品种M e b a n e 中发现了一 个单基因隐性遗传的芽黄突变体开始，世界上陆续发现并鉴定了许多不同的芽黄 突变体。芽黄性状是棉花在不利环境条件下控制叶色表达基因发生的隐性突变， 自交纯合后，叶片表现出叶绿素缺乏的黄色性状( K i l l o u g hDT 等，1 9 3 3 ) 。就芽 黄性状表现的时间长短和程度而言，不同类型突变体间存在很大差异，一些突变 体表现时间长且程度重，如v 。v 。、v 。v 。、v 。：v 。等，有些则时间短、程度轻，如v 5 v 5 v 6 v 。、 v 。v mv 。v ，。等。棉花芽黄突变体的一般为新生叶表现黄色，但随着叶片的发育渐 渐转为绿色，性状大多表现在苗期，明显易于鉴别，同时其遗传方式比较简单， 大多受1 对隐性基因控制，是鉴定棉花基因连锁群、同源转化群( 肖松华等， 1 9 9 6 b ) 以及棉花突变基因图谱定位的理想试验材料。棉花种间或品种间杂交存 在着杂种优势，通过连续回交将芽黄性状导入优良品种、品系，以其作为指示性 状进行杂交制种，利用间苗技术按指示性状淘汰伪杂种，可以简化制种手续，是 棉花杂种优势利用中经济、有效生产杂种种子的途径。 1 1 陆地棉芽黄突变体的遗传研究 陆地棉芽黄突变体的遗传研究始于二十世纪初，B a lls 以一个浅绿色叶片的 陆地棉和一个暗绿色叶片的海岛棉进行杂交，在群体中发现，浅绿色叶片植株与 暗绿色叶片植株的分离比例为3 ：1 ( K i l l o u g hDT 等，1 9 3 3 ) 。K i l l o u g h 辐射陆地 棉种子，获得了叶绿素缺乏型的黄苗，遗传分析表明，黄苗对绿苗为隐性，杂合 基因型植株自交产生绿苗和黄苗的比例为3 ：1 。 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 1 1 1 陆地棉芽黄突变体的遗传鉴定 K i l l o u g h 和H o r l a c h e r 对在陆地棉品种M e b a n e 中发现的芽黄突变体，进 行了遗传学研究，以芽黄株和正常株做亲本配制杂交组合，F 。全表现为绿色，F ： 绿苗和黄苗的比例非常接近3 ：l ，表明该突变体的芽黄性状受一对隐性基因控制， 将该芽黄突变基因及其等位基因分别被美国棉花遗传命名委员会统一命名为v 1 和V l ( O u i s e n b e r r yJE 等，1 9 7 0 ) 。随后陆续鉴定v 2 v 2 ( D u n c a nEN 等，1 9 6 7 ) 、 V 3 v 3 ( P e r c i v a lAE 等，1 9 7 4 ) 、V 4 v 4 ( O u i s e n b e r r yJE 等，1 9 7 0 ) 、v 5 v 5 v 6 y 6 ( K o h e l RJ ，1 9 7 3 ) 、v 7 v 7 ( T u r c o t t eEL 等，1 9 7 3 ) 、v 8 v 8 ( K o h e lR ，1 9 7 4 ) 、V 9 v 9 、v l o v l 0 、 v l l v l l ( P e r c i v a lAE ，1 9 7 4 ) 、v 1 2 v 1 2 、v 1 3 v 1 3 、v 1 4 v 1 4 、v 1 5 v 1 5 、v 1 6 v 1 6 v 1 7 v 1 7 ( K o h e lRJ ， 1 9 8 3 ) 、V 1 8 v 1 8 、v 1 9 v 。9 ( 张天真等，1 9 8 6 ) 、V 2 0 v 2 0 ( 张天真等，1 9 9 0 ) 、V 2 1 v 2 1 ( T u r c o t t e EL 等，1 9 8 8 ) 、v 2 2 v 2 2 ( 张天真等，1 9 9 0 ) 、a v l a v 。a v 2 a v 2 ( T u r c o t t eEL 等，1 9 7 8 ) 、 y g 。y g 。y g 。Y g ：( R h y n eCL 等，1 9 5 5 ) 等2 2 个芽黄突变体，共涉及到2 6 个芽黄突变 基因。其中y g 。y g ：来源于海陆杂种后代，v 。、v ，、v 。、a v ，a v 。来源于海岛棉，其余 的均在陆地棉中发现。其中v 。、v 3 、v 5 、v 6 、v 8 、v l o 、v ，。、v 1 6 、v 1 ，、y g 。、y 9 2 分别 定位在XVI I 、XV 、VI I 、I I 、XIV 、XI I 、XI 、VI I 、I I 、I 连锁 群上，加上胡风萍等( 胡凤萍等，2 0 0 6 ) 将v l 基因定位在2 0 号染色体，至今有v 。、 v 。、v 8 、v 。、v 。、y g 。、y 9 2 被定位在1 、1 5 、D 、A 、5 、1 6 、7 上，还有1 4 个芽黄基 因未定位到特定的连锁群或染色体上。同时突变体v 。v 。v 。v 。、v ，。v 。v 。，v 。，、 a v 。a v 。a v 。a v ：、Y g 。Y g ，Y g ：Y g 。表现为两对重叠基因的遗传方式，即两个非等位基因 共同控制一个性状，并且这两个基因具有部分同源关系，当两对基因为纯合隐性 时，才表现芽黄性状( K o h e lRJ ，1 9 7 3 ；K o h e lRJ ，1 9 8 3 ；T u r c o t t eEL 等， 】9 7 8 ) 。 1 1 2 芽黄基因部分同源关系 T u r c o t t e 和F e a s t e r ( T u r c o t t eEL 等，1 9 7 3 )以陆地棉v 。v 1 和海岛棉芽 黄突变体v ，v ，为亲本进行正、反交，F 。幼苗均表现芽黄性状，表明两个品系表现 为芽黄突变发生在同一基因位点，并且这2 个芽黄基因之间有补偿作用。B C 群体 符合1 绿：2 黄：1 白的比例，证明有两个基因，F 。群体绿苗、黄苗和白化苗分离 比例符合5 绿：6 黄：5 白，说明涉及两个非等位基因。K o h e l ( K o h e lRJ ，1 9 7 3 ) 2 棉花航天诱变芽黄突变体中棉所5 8 V s p 的遗传及基因表达差异分析 在鉴定v 。v 。时发现，v 与v ：的F 。后代全为黄苗，F ：群体中出现绿苗和不同程度的 黄苗，芽黄表现型呈现出从亲本类型到生活力很低的白化型，等位性测验结果证 明了v ：、v 。两个非等位基因之间的相作，说明v 。、v 。之间同样具有部分同源关系。 1 1 3 双隐性芽黄基因v 1 6 v 1 7 遗传的剂量效应 张天真和潘家驹( 张天真等，1 9 8 9 ) 首次报道了重叠芽黄基因v 1 6 v 1 7 的遗传 具有剂量效应。单体测验( H 1 V 1 6 v 。，) 的单体株自交产生F 。群体和回交产生的B c 群 体的黄、绿苗恢复出现了单体株。F 。中3 5 株绿苗产生7 株单体，1 1 株芽黄苗中仅 产生1 株单体。在这1 1 株芽黄株，有1 0 株表现程度同原始二体芽黄系亲本一致， 形态学鉴定也表明它们是二体植株。剩余的1 株芽黄株表现程度远比原始芽黄亲 本深得多，形态学鉴定结果证明这一黄化株是单体株。另外在( H 1 v 1 6 v 。，) 单体株 与v 。v 。，回交所得后代群体6 株芽黄苗中，有5 株芽黄表现同亲本芽黄一致的二体株 和1 株表现黄化的单体株。从表现型和细胞型可知：二体芽黄植株的基因型是 v 。v 。v ，v 。，而黄化单体株的基因型是v 。v 。，v 。，( 2 n = 5 1 ) 。与v ，。v ，芽黄基因位于同一 同源转化群的v 。v 。芽黄系的单体测验，未见这一现象( K o h e lRJ ，1 9 7 3 ) 。S e a r s 已经证实小麦单基因隐性遗传的芽黄品系单体测验中有剂量效应表现( 张天真 等，1 9 8 9 ) 。重叠芽黄基因的剂量效应，在小麦、棉花上都是首次发现。 1 2 芽黄突变性状与棉花杂种优势利用 生物界普遍存在杂种优势，利用杂种优势是提高农作物产量和品质的有效途 径。棉花同水稻、玉米和高粱等作物一样，在产量、品质等经济性状上存在着杂 种优势。 1 2 1 棉花杂种优势利用现状 目前棉花杂交制种大都采用人工去雄授粉法，由于棉花具有不断现蕾、开花 成铃，杂交成铃率低，每铃种子数又少，劳动强度大、持续时间长、成本高。雄 性不育系可以省略人工去雄，曾受到普遍关注。但一些不育系的育性受环境条件 影响较大，有的不育系一般配合力低，理想的恢复系很难找到，难以选出强优势 组合供生产利用。美国哈克尼西棉胞质的质核互作型雄性不育系尽管不育性稳 3 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 定，但其不育胞质使杂种F ，减产5 一1 0 。目前国内规模生产棉花杂种种子主要利 用核雄性不育系“一系两用法 和人工去雄授粉法。前者在制种时要拔去5 0 左 右处于花期的可育株，浪费人力、物力，限制了制种产量；后者完全靠人工操作， 不可能实现大面积生产。 1 2 2 利用指示性状生产杂种种子的可行性 发挥棉花杂种优势利用增产潜力的前提是提高杂交棉种子生产效率。制种技 术的突破是棉花杂优利用的关键。国内外学者对指示性状应用于棉花杂交制种进 行过探讨 华兴鼐等，1 9 6 3 ；许馥华等，1 9 8 3 ) 。根据指示性状辨别真假杂种，以 提高杂优制种效率。芽黄性状主要在苗期表现，稳定且容易鉴别，遗传方式简单， 大多受一对隐性基因控制，是理想的指示性状( D u n c a nEN 等，1 9 6 7 ) 。 芽黄性状大多受1 对隐性基因控制，将其转育到强优势杂交组合的母本中作 为指示性状，不去雄人工辅助授粉，F 。苗期结合间苗剔除伪杂种。利用方法有： ( 1 ) 通过回交，将芽黄性状转育到强优势杂交组合的母本中，利用指示性状进行 杂交制种；( 2 ) 以优良品种系为轮回亲本，连续回交，将芽黄性状转育到优良 品种系中，培育出有芽黄标记、综合性状优良的亲本，广泛配制杂交组合，筛 选强优势杂交种供生产应用。闵留芳等( 闵留芳等，1 9 9 6 ) 认为以常规品种为父 本，芽黄品种为母本，不去雄直接用花粉授粉，在芽黄株上收种子，F 。中根据芽 黄性状去除假杂种，这种方法特别适用于育苗移栽。许馥华等( 许馥华等，1 9 8 3 ) 研究认为芽黄等指示性状品种不去雄辅助人工授粉，后代杂交率为 4 9 6 9 一6 8 9 8 。何金龙报道，芽黄品系不去雄人工辅助授粉异交率可高达 7 3 2 9 6 2 5 。由此可见，以芽黄作为指示性状实现棉花杂种优势利用是简便 可行的。 1 2 3 芽黄指示性状的杂种优势利用 肖松华等( 肖松华等，1 9 9 6 c ) 通过芽黄近等基因系和轮回亲本的比较发现， 同一芽黄基因导入不同遗传背景对陆地棉农艺性状影响的范围和程度明显不同。 陆地棉芽黄品系与常规品种、品系杂交，F 。具有明显的杂种优势。就中亲 优势和高亲优势而论，产量性状优势最大，产量构成因素和早熟性次之，纤维品 4 棉花航天诱变芽黄突变体中棉所5 8 V s p 的遗传及基因表达差异分析 质性状也存在明显的优势。王学德等( 王学德等，1 9 8 9 ) 经亲本的配合力分析发 现，彭泽芽黄和湖北芽黄为较好的芽黄亲本。何金龙研究指出：常规品种与芽黄 品系之间的杂种表现出显著的杂种优势，F 。产量结构和常规品种差别不大。v 。v 。： 和彭泽芽黄的一般配合力效应在产量、早熟性等重要农艺性状