牡丹不定根形成相关基因PSARRO-1的克隆与序列分析-硕士论文

分类号密级 河南农业大学硕士学位论文 萝芝文j 题E t ：一g ! Q 坠i 坠g 鱼旦亟S 星g 堕曼n 堡曼卫旦! Y 墨i 墨Q 亟y 曼塾! i ! i Q 坠墨 B Q Q ! 也g 星! 丛星鱼Q 星壁星墨堕Q ：! Q I 鳗星卫星Q 堕Y 导 专 论文提交 日 学位授予 日 ；、 4 Ii1 1 1 1 1 1 1 1 1 11 1 1 11 1 1 1 1 1 11 1111 11111 Y 17 2 8 7 4 2 河南农业大学学位论文独创性声明、使用授权及知识产权归属承诺书 学位论牡丹不定根形成相关基因P S A R R O 1 的克隆及 学位 文题目生物信息学分析 级别 硕士 学生学科导师何松林教授 姓名 吴静园林植物与观赏园艺 专业姓名 李永华副教授 学位论文 如需保密，解密时间年月日 是否保密 独创性声明 本人呈交论文是在导师指导下进行的研究I 作及取得研究成果，除了文中特别加 以标注和致谢的地方外，文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包括为 获得河南农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了 审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并 表示了谢意。 特研究生签名：稀锄私新签名：确誓蜂 日期：j o l o 年口6 月午日日期：为D 年0 6 百# 4 - 日 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本人完全了解河南农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学校 要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷本和电子版本， 并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论 文。本人同意河南农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或 部分内容。 本人完全了解河南农业大学知识产权保护办法的有关规定，在毕业离开河南农 业大学后，就在校期间从事的科研工作发表的所有论文，第一署名单位为河南农业大学， 试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河南农业大学所有，否则，承担相应 的法律责任。 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。 1IF 一_ 研究生签名：稀 导师签名：彳殇p 降衅学院领导签名：卜10 1 日期：2 口睥D 铜J 牛日日期：砷年D 6 月烨日 日期：年月 日 致谢 在论文撰写完成之际，我衷心感谢我的导师何松林教授和李永华副教授，该论 文的撰写是在他们悉心的指导下完成的，在此，谨向我最敬爱的老师表示深深的谢 意与敬意，感谢导师三年来的关心与培养、理解与支持，我将终身铭记。 三年来，他对我的学习和生活给予了精心的指导和热心的帮助。从实验的选题、 查阅文献到实验设计、准备试验材料、实验的操作以及处理数据和撰写论文，无不 凝聚着老师的心血和汗水。导师高尚的品德、渊博的学识、严谨的治学态度、兢兢 业业的工作作风、以及豁达的性格等许许多多方面都给我留下了深刻的印象，并一 直深深影响和感动着我，促使我在困难和挫折面前永不气馁，给了我坚持下去的勇 气，三年来，何老师和李老师的为人处事方式一直深深影响着我，使我受益匪浅， 是我一辈子的财富，再次谢谢我尊敬的老师。 感谢导师组的杨秋生教授、苏金乐教授、孔德政副教授、李永华副教授、黎明 副教授、王献副教授、武荣花副教授、闰双喜副教授，以及林学院的所有老师们， 他们给予我很多学业上的指导和生活上的关心；从开始的实验设计、实验操作到后 来的论文立题、论证等都给予了诸多指导和帮助，再此衷心的表示感谢! 感谢实验过程中农学院汤继华教授和生命科学院王小纯教授给予的无私帮助， 也感谢师兄王政，师姐符珍珠，同学李创、丁义、王海云，师妹逯久幸、徐盼盼、 郭子霞、曹秀亭、陈静，师弟郑卫杰、郑春蕾、李立升、李高飞、杨博的合作和支 持。同时对0 7 级林学院全体研究生同学在生活和学识上给予的帮助和照顾，在此一 并表示感谢。 最后，还要衷心感谢我的父母，感谢他们在我多年的学习生涯中给予的精神上 和物质上的支持、以及思想上的教育和引导，感谢所有关心我、爱护我、鼓励我的 亲人们，正是在他们的支持下我才不断进取。 吴静 2 0 1 0 年6 月于郑州 河南农业大学硕士毕业论文目录 目录 摘要l 1 文献综述3 1 1 植物不定根发生分子机理的研究进展3 1 1 1 不定根发生的激素调控：3 1 1 2 不定根发生的基因调控4 1 1 2 1 与生长素相关的不定根发生基因4 1 1 2 2 不定根发生起始阶段的特异表达基因5 1 1 1 3 不定根发生的信号传导机制5 1 2 影响木本植物不定根形成的因素6 1 2 1 顽抗6 1 2 2 细胞能力6 1 2 3 束缚生长素6 1 2 4 植龄6 1 3 牡丹试管苗生根研究7 1 3 1 生长调节物质对牡丹试管苗生根的影响7 1 3 2 内源激素对牡丹试管苗生根的影响8 1 4A R R O 1 基因的研究进展一8 2 引言j 一11 3 材料与方法1 3 3 1 试验材料一13 3 1 1 植物材料1 3 3 1 2 菌株与载体：1 3 3 1 3 工具酶及生化试剂l3 3 1 4 主要仪器：13 3 1 5P C R 引物13 3 2 试验方法1 4 3 2 1 总R N A 的提取与鉴定1 4 3 2 2 反转录。1 5 3 2 3 牡丹P S A R R O 1 基因中间片段的克隆：1 6 3 2 4 牡丹P S A R R O 1 基因3 端的克隆1 6 河南农业大学硕士毕业论文目录 3 2 5 牡丹P S A R R O 1 基因5 端的克隆1 7 3 2 6 牡丹P S A R R O 1 基因c D N A 全长序列的P C R 扩增2 0 3 2 7P C R 产物的检测与回收纯化2 0 3 2 8 回收产物与载体的连接2 l 3 2 9 感受态细胞的制备2 l 3 2 1 0 连接产物转化大肠杆菌2 2 3 2 11 碱裂解法小量制备质粒D N A 2 2 3 2 1 2 酶切鉴定点2 2 3 2 13 序列测定2 3 3 3 牡丹P S A R R O 1 基因的序列分析2 3 4 结果与分析2 4 4 1 四种牡丹R N A 提取方法的比较2 4 4 1 1R N A 纯度及浓度的检测2 4 4 1 2R N A 完整性分析2 4 4 2c D N A 第一链合成质量验证2 5 4 3 牡丹P S A R R O l 基因中间片段的克隆2 6 4 4 牡丹P S A R R O 1 基因3 端的克隆2 7 4 5 牡丹P S A R R O 1 基因5 端的克隆2 8 4 6 牡丹P S A R R O 1 基因全长c D N A 序列的拼接3 0 4 7 牡丹P S A R R O 1 基因c D N A 全长序列的克隆3 2 4 8 牡丹P S A R R O 1 基因的序列分析3 4 4 8 1 牡丹P S A R R O 1 基因序列分析。3 4 4 8 2 结构域分析 一3 6 4 8 3 系统发育分析3 6 5 讨论3 7 5 1R N A 的提取，3 7 5 2R A C E 扩增。3 7 参考文献：3 9 A b s t r a c t ：。l I I I I 河南农业大学硕士毕业论文摘要 摘要 本实验以生长健壮的牡丹品种乌龙捧盛大田植株及其腋芽诱导形成的无菌试管苗为材料， 运用R T P C R 和R A C E 相结合的方法克隆出牡丹不定根发生相关基因P S A R R o - 1 的全长序列，并对 其进行了序列分析。为牡丹组培苗生根的分子机制研究提供了基础。本研究的主要结论如下： 1 牡丹R N A 提取方法的优化。以牡丹乌龙捧盛试管苗的根系为材料，分别用改良T r i z o l 法、 改良C T A B 法、改良异硫氰酸胍法及试剂盒这四种方法提取总R N A 。结果显示：改良T r i z o l 法及 改良异硫氰酸胍法均不能从牡丹根系中提取出高质量R N A 。而改良C T A B 法及试剂盒法提取R N A 的电泳结果可见清晰完整的2 8 Sr R N A 、1 8 Sr R N A 及5 Sr R N A 条带，其中2 8 Sr R N A 与1 8 Sr R N A 的亮度比约为2 ：1 ；浓度及纯度检测表明这两种方法提取的R N A 纯度较高，且改良C T A B 法提取 的R N A 浓度( 2 6 9 5 0p g 佗) 是试剂盒法( 8 2 1 4r t g g ) 的3 倍。结合R N A 的提取质量和成本，改 良C T A B 法更适宜于牡丹根系R N A 的提取。 2 牡丹P S A R R O 1 基因中间片段的克隆。根据2 - o x o a c i d d e p e n d e n td i o x y g e n a s e 的氨基酸保守序 列设计特异引的T M W 1 和T M W 2 。从牡丹品种乌龙捧盛中克隆得到牡丹生根相关基因 P S A R R O 1 的中间片段，核苷酸长度为3 0 0b p ，编码9 9 个氨基酸，其G e n B a n k 登陆号为G Q 3 3 0 6 4 4 。 3 牡丹P S A R R O 1 基因3 端的克隆。根据已分离得到的基因中间片段的核苷酸序列设计特异引 物T M W 一3 ，和锚定引物B 2 6 进行3 - R A C EP C R ，扩增出约3 2 8b p 大小的D N A 片段。经B L A S T 比对发现该序列与苹果、梅花、毛果杨等其他物种的2 - o x o a c i d d e p e n d e n td i o x y g e n a s e 基因有较高的 同源性，分别为7 1 、7 9 和7 3 ；并确定了牡丹P S A R R O l 基因编码区的终止位置。 4 牡丹P S A R R O 1 基因5 端的克隆。根据已知序列设计特异引物T M W 4 和T M W 5 ，按照宝 生物工程( 大连) 有限公司的5 - F u l lR A C EK i t 试剂盒进行5 R A C E P C R 。经过巢式扩增，得到一 条约3 2 8b p 大小的D N A 片段。经B L A S T 比对，该序列与苹果、梅花、毛果杨等其他物种的 2 - o x o a c i d d e p e n d e n td i o x y g e n a s e 基因有较高的同源性，分别为6 9 、7 l 和7 0 ；并确定了牡丹 P S A R R O 1 基因编码区的起始位置。 5 牡丹P S A R R O 1 基因c D N A 全长序列的克隆。根据拼接出来的牡丹P S A R R O 1 基因的全长序 列设计特异引物P S 1 和P s 2 进行c D N A 全长序列的扩增，扩增出约9 2 6b p 大小的D N A 片段。 6 牡丹P S A R R O 1 基因的生物信息学分析。通过D N A M A N 分析表明，P S A R R O 1 基因长度为 l1 3 5b p ，包括9 3b p 的5 一非编码区( U T R ，u n t r a n s l a t e dr e g i o n ) 和1 4 5b p 的3 一非编码区、2 0b p 的p o l y A 尾巴和一个8 9 7b p 的开放阅读框( O R F ，o p e nr e a d i n gf l a m e ) ，编码2 9 8 个氨基酸。牡丹 P S A R R O 1 ( G Q 3 3 0 6 4 4 ) 与G e n e B a n k 中报道的拟南芥( A T 2 G 2 5 4 5 0 ) 、毛果杨( X P0 0 2 2 9 8 9 9 3 ) 、 苹果( A J 2 2 5 0 4 5 ) 和梅花( B A E 4 8 6 5 9 ) 等植物的2 - O D D 基因的氨基酸序列进行B L A S T 比对结果 显示与他们的同源性较高，分别为9 6 、9 6 、9 6 和9 7 。保守结构域分析发现与已报道 2 - o x o a c i d d e p e n d e n td i o x y g e n a s e 相似，存在2 种结构域：2 0 G F e I IO x ys u p e rf a m i l y c 1 0 12 0 6 和 P L N 0 2 3 6 5 P L N 0 2 3 6 5 】，并进行了相关进化树分析，结果表明牡丹P S A R R O 一1 基因与木本植物毛果 河南农业大学硕士毕业论文摘要 杨、苹果、梅花的亲缘进化关系较近，与草本植物拟南芥的亲缘关系较远。 关键词：牡丹；R N A 提取；生根基因P S A R R O 1 ；基因克隆；序列分析 2 河南农业大学硕士毕业论文文献综述 1 文献综述 1 1 植物不定根发生分子机理的研究进展 随着现代生物技术的迅速发展，植物组织培养和扦插等技术取得巨大成就。在取得相关进展 的同时，也出现了很多问题，如有些物种外植体或插条生根困难等。在外植体或插条根系再生过 程中，形成的主要是不定根和侧根。植物非根组织( 如嫩茎、枝条、地上茎、地下茎等) 上形成的 根叫不定根，它的发生方式有两种，从插穗( 茎、枝条、叶等) 直接形成不定根的方式称为直接发 生；而从插穗上先产生愈伤组织，再形成拟分生组织，最后产生不定根原基的方式称为间接发生。 植物依不定根发生方式的不同而产生了生根难易程度的极大差异，所以研究植物不定根发生的机 制问题，对于解决无性繁殖中某些物种难生根问题十分重要，又为揭示植物生长和发育的机理提 供了理论依据。 不定根发生机制的研究最早从形态学观察开始，随着显微技术的不断改进，人们逐步了解了 根在细胞内的发生过程。生长素作用的发现及其作用机制研究的深入，为从生理生化水平上开展 不定根发生的研究提供了理论基础。2 0 世纪末，植物分子生物技术的应用，又为其提供了新的研 究手段，对不定根发生机制的认识也逐步深入到分子及基因水平，特别是与生长素生物合成调控 和不定根发生相关基因的分离和鉴定，极大地丰富了生长素调节不定根发生中信号传导机制的内 容。 1 1 1 不定根发生的激素调控 不定根的发生受许多因素影响，其中生长素类物质起着重要的调控作用。目前离体器官或组 织在诱导不定根发生时，大多需要添加外源吲哚丁酸、萘乙酸等生长素类生长调节剂。研究表明： 它们在施用后会影响和改变内源生长素的水平，进而达到调节植物形态发生的目的。对核桃、杨 树、苹果( 郑钧宝等，1 9 9 9 ) 、猕猴桃等植物的研究已印证了上述结论。核桃子叶经外源I B A 诱导， 内源吲哚乙酸水平明显提高，进而促进了不定根的发生，所以初步推断诱导初期认A 水平的增高， 在启动根原基分化中发挥着重要的作用( 裴东等，2 0 0 3 ) 。不定根原基的诱导与局部I A A 水平的升高 同时发生，一旦根原基形成，I A A 含量随之降低，例如，幼年型和成年型白花泡桐无根试管苗经 过1 B A 诱导后，测得的I A A 浓度峰值与根原基的出现时间相吻合，其作用机制尚不十分清楚( 秦新 民等，1 9 9 6 ) 。 I B A 对生根的作用是通过认A 起作用的，在一定的浓度范围内，I B A 浓度增加，内源I A A 含 量也随之增加。近年发现，I B A 是比I A A 生根作用更强的一类生长素，原因是I B A 比I A A 稳定。 李静等( 2 0 0 7 ) 研究了植物激素对毛白杨叶片不定根再生的影响，结果表明I B A 诱导毛白杨叶片 生根比I A A 的效果要好( 李静等j2 0 0 7 ) 。 乙烯在不定根形成的诱导期和起始晚期起促进作用( 王金祥等，2 0 0 4 ) 。当处于深水中的水稻完 全被水浸没时， 由于乙烯在水下植物部分积累诱导根的发生( S t e f e n sB ，e ta l ，2 0 0 5 ) 。赤霉素单独使 用时并不能促进根的生长，但是如果它与乙烯配合使用，将会增加根的数量且提高根的生长速度。 3 河南农业大学硕士毕业论文文献综述 通过对赤霉素生物合成抑制剂的研究揭示根的发生需要赤霉素的活性，脱落酸是赤霉素活性的竞 争性抑制剂。不定根的发生和伸长属于两个不同阶段，这两个阶段由乙烯、赤霉素和脱落酸相互 作用所形成的网络来调控。不定根的发生与根原基表皮细胞的程序性死亡密切相关。表皮细胞死 亡是由乙烯、 赤霉素和脱落酸来调控。相同激素的不同相互作用方式一方面保证了细胞程序性死 亡的时间；另一方面可以调整不定根发生的生长速率。 1 1 2 不定根发生的基因调控 分离和鉴定植物不定根发生相关基因，是目前研究不定根发生调控机制的一个热点。随着分 子生物学技术和手段的不断改进，从不定根中分离鉴定了许多特异表达基因，它们参与物质运输、 信号传导、细胞壁形成、细胞分裂周期和细胞代谢等一系列活动，从植物系统发育学角度来看， 这些与不定根发生有关的基因是彼此协调作用的，它们有序地控制着不定根的发生。 1 1 2 1 与生长素相关的不定根发生基因 生长素对不定根发生的调控作用非常重要，因此在对不定根发生的机理研究中，发现有许多 基因参与生长素合成、运输、信号传导等生理过程，进而影响了不定根的发生。从根癌农杆菌 ( A g r o b a c t e r i u mf u m e f a c t i o n s ) 和假单孢杆菌( P s e u d o m o n a s s y r i n g a e ) r # 分离并鉴定了两个关键基因，即 色氨酸单加氧酶基因( i a a M ) 和吲哚乙酰胺水解酶基因( i a a H ) ，后来发现此途径也可能存在于拟南芥 ( r a b i d o p s i st h a l i a n a ) d p 。在转i a a M 和i a a H 的烟草( N i c o t i a n at a b a c u m ) 中，结合态和游离态的认A 含量比对照株增加了十倍左右，表现出形态异常，如茎和叶子上产生不定根、顶端优势显著、木 质化增强以及发育过程延迟等( S i t b o nF ，e ta l ，1 9 9 2 ) 。 生长素结合蛋白( a u x i nb i n d i n gp r o t e i n s ，A B P s ) 是目前植物激素调控研究中的前沿和热点，己 鉴定和分离出一系列A B P s ，有些观点支持A B P s 是生长素的受体，与生长素结合促发生长素信号 的原初信息，信息经过传导后调控基因表达，继而引起各种细胞反应，然而目前还缺乏足够的证 据。W i l m o t h 等在拟南芥中研究发现，A R F 4 和A R F l 9 基因双突变导致侧根和不定根的发生能力减 弱，从而初步推测生长素诱导侧根发生过程中激活了A R F 4 和A R F l 9 基因的表达( W i l m o t hJ C ，e t a l ，2 0 0 5 ) o G e 等报道水稻根形成相关基因O s R A A l ( O r y z a s a t i v aR o o tA r c h i t e c t u r eA s s o c i a t e d1 ) 经外源生长 素诱导具有促进水稻根系发育的功f 毙( G eL ，e ta l ，2 0 0 4 ) 。通过原位杂交技术鉴定出该基因在根顶端 分生组织、根尖伸长区、分支区的中柱及幼嫩的侧根中均有表达。构建玉米泛素启动子控制的 O s R A A t 组成型表达载体，并进行转基因研究发现：主根生长被削弱，不定根和主根卷曲的数量增 多，而且还抑制根的向地性反应；超量表达该基因，发现与对照植株相比，不定根的起始阶段和 生长阶段均对生长素更加敏感。对转O s R A A l ：G 基因植株进行N o r t h e r nb l o t 分析及G U S 活性检测， 证实该基因是由生长素诱导表达的，超量表达O s R A A l 导致内源姒含量的增加。因此，这些现 象说明O s R A A l 通过对L A 合成代谢的正反馈调节来促进水稻根的发育。 A I u l ( A d v e n t i t i o u sR o o t l e s s1 ) 基因是最近从水稻中分离的，编码的蛋白属于细胞核内蛋白， 含有侧生器官分支( L a t e r a lO r g a nB o u n d a r i e s ，L O B ) 结构域，主要在侧根和不定根的根原基、分蘖根 原基、微管组织及幼茎中表达，且在根中的表达模式与生长素分布规律一致( L i uHJ ，e ta l ，2 0 0 5 ) 。 4 河南农业大学硕士毕业论文文献综述 研究表明：A I U l 属于与生长素介导的细胞脱分化相关的生长素响应因子，它能促进茎中维管柱附 近的中柱鞘细胞的早期分化。 除单个基因外，还有一些生长素诱导早期表达的基因家族，如A u x I A A 基因家族、A I R 7 、A I R 9 、 A I R l 2 等。G o l d f a r b 等在裸子植物火炬松( P i n u st a e d aL ) 中鉴定出A u x I A A 基因家族中五个成员， 它们编码的蛋白质有四个高度保守域，外源生长素诱导可以显著提高A u x I A A 基因转录活性 ( G o l d f a r bB ，e ta l ，2 0 0 3 ) 。 1 1 2 2 不定根发生起始阶段的特异表达基因 S m i t h 等在拟南芥中分离出侧根原基发生基因( L a t e r a lR o o tP f i m o r d i u m 1 ，L R P l ) ，并证实该基因 在不定根原基分化早期表达量增高，随后大大降低，因此，将L R P l 基因作为不定根原基分化早期 阶段的分子标记( S m i t hDL ，e ta l ，1 9 9 5 ) 。研究表明：L R P l 基因在拟南芥的侧根和不定根原基发育的 早期活跃表达，一旦根原基形成，便关闭其表达机制。 酪蛋白激酶可以使酪蛋白磷酸化，经过油菜素类固醇( B r a s s i n o s t e r o i d ，B R ) 诱导的水稻中分离 出该酶的基因O s C K I I ，研究发现该基因在水稻的不同组织中均有表达，经过B R 和A B A 处理后其 表达量会增加。通过转入反义基因研究其生理功能，结果发现转基因植株的根发育异常，如侧根 和不定根数量减少，主根变短。用C K I 的抑制剂C K I 7 来处理野生型植物，进一步证实了O s C K I I 的功能。有趣的是，经外源I A A 诱导处理，转反义O s C K I I 基因水稻和C K I 7 处理的野生型水稻可 以恢复根的正常发育；检测C K I 缺陷型植株，发现主根和不定根中游离I A A 的浓度发生改变，表 明O s C K l l 与生长素代谢有关，或者说O s C K l l 可能影响并改变生长素的浓度水平，进而影响了根 的异常发育。 B u t l e r 等报道，编码依赖于含氧酸的双加氧酶基因( A d v e n t i t i o u sR o o t i n gR e l a t e dO x y g e n a s e ， A R R O 1 ) ，在生长素诱导下，苹果砧木J o r k 9 不定根发生的早期阶段上调表达，目前初步将该基因 定为木本植物不定根发生的分子标记，其功能还有待于进一步深入研究( B u t l e rED ，e ta l ，2 0 0 0 ) 。 最近报道，将拟南芥A t F P F l 基因通过农杆菌转入水稻愈伤组织中，结果发现转基因水稻表现 出与拟南芥相同的表型症状，如开花期缩短，而且还可以增强不定根的发生率。根据实验结果初 步推测，A t F P F I 基因不仅能促进单子叶和双子叶植物开花，而且在水稻不定根发生的起始阶段具 有一定的作用( X uML ，e ta l ，2 0 0 5 ) 。 1 1 1 3 不定根发生的信号传导机制 自1 9 9 8 年一氧化氮州i t r i cO x i d e ，N O ) 是心血管系统的信号分子这一研究成果获得诺贝尔生理 学和医学奖之后，发现其在植物发育和适应性反应过程中起重要作用( B e l i g n iMV ，e ta l ，2 0 0 1 ； P a g n u s s a tGC ，e ta l ，2 0 0 2 ) 。P a g n u s s a t 等指出，在黄瓜( C u c u m i ss a t i v u s ) 不定根诱导反应中，N O 不仅 参与了从A 信号传导，而且N O 属于I A A 信号传导途径下游的信号分子，通过激活鸟苷酸环化酶 产生次级信使c G M P ( P a g n u s s a tG C ，L a n t e r iML ，e ta l ，2 0 0 3 ) ，然后通过促分裂原活化激酶( M A P K ) 级 联反应，影响细胞的有丝分裂过程。 总而言之，不定根形成的研究过程由简单的结构解剖学逐渐深入到基因和蛋白的调节水平， 虽然在分子水平上取得了一些进展，但到目前为止，针对不定根形成的分子机制仍然存在许多疑 5 河南农业大学硕士毕业论文 文献综述 问，还需要更进一步地深入研究。 1 2 影响木本植物不定根形成的因素 无性繁殖是大多数园艺作物商业化生产采用的最重要方法( D a v i e s ，e ta l ，1 9 9 4 ) ，显然不定根 是一个植物成功克隆的前提。木本植物由于生理原因无法形成不定根，导致必须采用嫁接的方式 繁殖。虽然这种技术有利于繁殖，但无法使它们形成自己的根系。7 0 的园艺作物依赖于嫁接的繁 殖体系，这证明了不定根已成为现代园艺生产发展的障碍。 1 2 1 顽抗 生命的多样性和复杂性要求所有生物体进行分化。植物体中的这些细胞具有独特的决定性， 可以再分化形成新器官。植物细胞全能性的概念并不都可以理解为所有植物都可以持续的繁殖。 即使条件十分优越，许多细胞和组织仍无法获得再生能力，形成新的组织或器官( E s a u ，1 9 7 7 ) 。植 物不能再生这个问题被称为顽抗。形态可朔性( 生物对环境的适应性) 无法维持通常与植物细胞 有关。这意味着这些顽抗的植物无法再繁成功。虽然微繁殖是植物在体外进行无性繁殖的一种可 行性方法，但同木本植物的传统繁殖一样，由于植物形成不定根能力的下降而受限( M u l l i n s ，1 9 8 5 ) 。 自从克隆作为许多植物复制遗传的首选方法后，如果能最终从基因水平上操纵不定根形成，它将 会产生较大的实用和商业利益。虽然在草本及木本植物不定根形成中生长素的作用已成为许多研 究的重点( D i a zS a l ae ta l ，1 9 9 6 ；B l a z k o v ae ta l ，1 9 9 7 ) ，但这个过程仍然令人难以理解，特别是木本 植物。 1 2 2 细胞能力 脱分化被定义为分化的细胞失去原有的结构和功能变为具有恢复未分化细胞特性的过程。例如 恢复形成不定根原基的能力( W i l s o n 1 9 9 4 ) 。W i l s o n ( 1 9 9 4 ) 认为细胞之间存在很大差异，有的细胞 具有形成根原基的能力，而同一类型的细胞有些则不具备这种能力。如果一个细胞具有形成不定 根原基的能力，那么就称这个细胞具有生根能力。威尔逊认为细胞之间的差异是由于基因、年龄 和相对位置的不同，这一观点得到了亚希克和德克勒克( 1 9 9 7 ) 的支持，他们认为许多细胞分裂 受生长素影响，但只有少量细胞可以分裂形成根部分生组织。 1 2 3 束缚生长素 在生长素动态平衡的状态下，束缚生长素控制着不定根的形成，据B l a k e s l e y 等( 19 91 ) 观察 黄栌扦插过程，在生长的早期，生根比较容易，且具有较高的自由生长素水平；相反，在生长的 后期，不定根形成能力下降，这表明束缚生长素能通过改变植物体内的自由生长素水平来影响生 根能力。N o r d s t r o m 等( 1 9 9 1 ) 经过相关实验初步认为，豌豆插穗中生根区的自由生长素的积累被 生长素与束缚物的结合所阻止。 1 2 4 植龄 植物生长可分为不同的童期和成熟期，这些阶段可被一些形态和生理特征区分开，例如叶片 6 河南农业大学硕士毕业论文文献综述 形状、叶序数和着色( H a c k e t t , 1 9 8 5 ) 。植物生长的童期特点是无法启动开花，而在苹果中这个阶段 要持续4 - 8 年( C 1 a r k l 9 8 3 ) 。木本植物不定根的形成与植物发育的年龄也存在着内在的联系，在许 多处于发育期的木本植物中，不定根形成的能力会随着树龄的增加而有所变化。众所周知，大多 数成熟的木本植物不易生根，原因尚不清楚，但成熟植株内源激素水平不是其限制因素 。( M u l l i n s 1 9 8 7 ) 。成熟植株经过复壮可以恢复形成不定根的能力，这说明不能形成不定根的能力不 是永久性的，是可以逆转的。W h i t e 和L o v e l 于1 9 8 4 年研究成熟的茱萸科植物的不定根形成时发 现，对其进行生根诱导的时间较短时生根效果较差，且靶细胞的反应能力也小于幼小的植株。 G e n e v e 等于1 9 9 1 年研究发现，成熟的常春藤叶柄细胞的生根能力与细胞进行细胞分裂、感知生根 刺激的能力有关。这些研究的结论为年幼的植株具有较高的生根潜力。 影响木本植物生根的还有许多其他因素。T a jB o R o n 于1 9 8 4 年发现1 6 种木本植物较差的生根 能力与木栓形成层的发生有关，植物细胞壁中木质素和纤维素的积累也影响生根。F a v r e 于1 9 7 0 年指出，过多或过少的木质化导致葡萄扦插生根率低。而德莱和尔田在对樱桃的研究中发现木质 化延迟不定根的出现。B e a k b a n e 发现一些苹果品种生根的难易与厚壁细胞环的连续性呈现反比关 系，从而指出生根困难与成熟木本植物细胞壁的纤维素化有关。 1 3 牡丹试管苗生根研究 1 3 1 生长调节物质对牡丹试管苗生根的影响 牡丹试管苗生根培养最有效的生根诱导剂是I B A ( H a r r i sRAe ta 1 1 9 9 1 ； A l b e r sMRJ 甜 a 1 1 9 9 2 ；B o u z aLe ta 1 1 9 9 2 ；B o u z aLe ta 1 1 9 9 4 ； B e r u t oMe ta 1 2 0 0 4 ；) 。也有使用N A A 或认A 诱导生根的报道。 李玉龙等认为牡丹试管苗生根所需的生长素种类专一，使用I A A 或N A A 不能诱导生根。B o u z a 等用7 5 9 MI B A ( 约1 0m g L d ) 暗处理1 0 d ，M m ed eV a t r y 生根效果最好。张子学等对风丹无根苗 诱导生根的研究表明，在M S 培养基中单独添力n I B A 或I B A + N A A 均能诱导生根，其中以单独添加 I B A 0 8 m g - L 。1 和1 2 m g L 。1 生根率最高，分别达N 8 0 和8 1 5 ；I B A + N A A 虽能诱导生根，但生根率 仅为15 之2 ，达不到工厂化生产的要求。 B e r u t o 用I B A 诱导生根，发现没有使用I B A 也能生根，但是使用I B A 诱导生根率高出5 0 ( B e r u t o M e ta 1 2 0 0 4 ) 。陈笑蕾用I B A 、认A 也成功诱导牡丹根系的发生，生根率最高为8 3 3 ；结果表明 I B A 和认A 配和使用，效果较好。安佰义以1 2 W P M 培养基为基本培养基研究不同浓度N A A 和I B A 对不定芽生根的影响，结果表明：添力D I B A 的培养基根发生的时间要早于添力H N A A 的培养基；诱导 根发生的I B A 最佳浓度为2 0 m g L ，诱导率达6 0 ，N A A 的最佳浓度为1 0 m g L 一，诱导率达4 5 。 李志军等在1 2 M S 中单独添力I N A A0 1 m g L 。1 诱导大胡红无根苗生根获得成功，每个嫩茎生根3 5 条，长约2 3 c m ，生根率达到了1 0 0 。贺丹在研究外源激素对牡丹生根的影响时发现：以1 0 0 0 m g L d I B A + I S S F l 3 0 0 m g L 。1I B A + 1 0 m i n 处理的生根效果较好，且平均生根数较高。在太平红材料中，1 0 0 0 m g L JI B A + 1S 的处理生根率达到最大值8 0 ，乌龙捧盛10 0 0m g L - 1 I B A + IS 的生根率为3 5 ( 贺 丹2 0 0 9 ) 。 7 河南农业大学硕士毕业论文文献综述 也有人认为单一的激素无法使牡丹试管苗生根。张桂花等采用了两种方案：按常规的根诱 导方法进行，培养基为M S + N A A ( 0 1 - 4 ) 5m g L d ) 、M S + I B A ( 0 2 o 5m g L 。1 ) 、M S + I A A ( O 2 o 5 m g L 。1 ) ；在无菌条件下将无根试管苗在生根激素浓度分别为N A A0 2 m g L 、I B A 0 4 m g L 1 、I A A0 3 m g L 。1 的溶液中处理2 3 h ，再分别转入I 2 M S + N A A ( 0 1 0 2 m g L 。) 、1 2 M S + I B A ( 0 2 - 4 2 5m g L d ) 、1 2 M S + I A A ( 0 2 0 5 m g L 。1 ) 生根培养基中诱导生根。两种方案均未能诱导根的产 生( 张桂花等，2 0 0 1 ) 。 在牡丹组织培养过程中，暗期和生长调节物质互作对试管苗生根也有一定的影响，大多数试 验采用2 步生根法。即将试管苗接种到附加有高I B A 浓度的培养基中，放置到暗环境中进行培养 1 0 d 左右，再转入到不含任何激素的基本培养基中，放置到正常的生长环境条件下进行培养，这 种方法能提高生根率。B e r u t o 等人先用2 。C 低温对未生根苗进行一周的冷处理，然后再按两步生根法 进行生根培养，发现生根率明显高于未经冷处理的材料。王永伟在研究生根培养时指出，低温暗培 养优于常规培养，生根率最高的处理为1 2 W P M + N A A 3 0 m g L 。1 + P V P l 0 9 L J + G e l l a nG u m2 0 g L - l 培养条件为低温暗培养，生根率最高可达到6 0 6 7 ( 王永伟，2 0 0 8 ) 。 暗期处理对试管苗的生根有一定的抑制作用，其原因可能是因为在采用正交设计的过程中暗 期处理和高浓度的生长调节剂之间存在互作的缘故。暗环境为根生长提供一个自然的生长环境， 另外，还可以降低生长素类物质在光环境中的分解，从而提高植物体内生长素浓度。但长时间的 高浓度生长素对生根诱导有抑制作用，因此要想获得良好的试管苗根系，I B A 和I A A 浓度要在 2 0 m g L 1 以下。 1 3 2 内源激素对牡丹试管苗生根的影响 目前关于牡丹生根时内源激素的变化研究还很少，Z e n gD u a n x i a n g 研究了牡丹生根期内源激 素I A A 、A B A 、G A 、C T K 及I A A 与它们三种的比值对生根的影响。研究指出，I A A 与A B A 、G A 、 C T K 的比值在根原基形成初期增加，在根原基生长期却有很低的水平，而在根产生期又恢复到原 有的水平( Z e n gD u a n x i a n g ，2 0 0 6 ) 。贺丹研究牡丹试管苗生根过程中内源激素变化，结果表明第3 天根原基诱导开始，吲哚乙酸含量升高，脱落酸含量下降，细胞分裂素含量开始下降。在不定根 突出表皮之前，吲哚乙酸含量变化波动较大，脱落酸含量有所回升；不定根突出表皮之后，根伸 长期吲哚乙酸含量变化趋势平缓；根伸长前期，脱落酸含量降低，后期趋于稳定，生根基本结束 后脱落酸含量大幅度回升。在根原基基本形成和伸长期，细胞分裂素含量升高。根伸长后期细胞 分裂素含量有所下降，生根基本结束后开始回升。 1 4A R R O 1 基因的研究进展 木本植物中根部分生组织形成过程中基因表达情况尚不太清楚，为此，V a n d e rK r i e k e n 等于 1 9 9 3 年利用苹果易生根品种J o r k9 的茎片诱导不定根的形成，从而调查研究不定根形成过程中基 因的表达情况( V a nd e rK r i e k e nW M ，e ta l ，1 9 9 3 ) 。研究中发现，将茎切片( 约Im m 厚) 置于含有7 3 8 g MI B A 的生根培养基中5h 后转入无I B A 的培养基中，约4 8h 后细胞分裂引起不定根分生组织形 成。E o i nDB u t l e r 和T h o m a sFG a l l a g h e r 于1 9 9 9 年利用I B A 诱导茎切片与非I B A 诱导茎切片提取 8 河南农业大学硕士毕业论文文献综述 m R N A ，构建了c D N A 文库，得到一条在I B A 诱导的茎切片中高量表达的一个片段( E o i nD B u t l e r , e t a l ，1 9 9 9 ) 。经过核苷酸序列分析发现，这个基因片段编码一种依赖含氧酸的双加氧酶，这种双加氧 酶参与羟基化和环氧化催化反应，并参与各种不同的生物合成途径( P r e s c o t ，e ta l ，1 9 9 8 ) 。这个分 离得到的c D N A 最终被命名为A R R O - l ( A d v e n t i t i o u sR o o t i n gR e l a t e dO x y g e n a s e ) 。 同其他植物双加氧酶进行序列对比发现，A R R O 1 的e D N A 在N 端缺失将近2 0 0b p 。利用巢 式P C R 从e D N A 文库中得到了A R R O 1 的序列全长。A R R O 1 序列全长1 2 8 2b p ，其中包含9 2 1b p 的开放阅读框，推导编码3 0 7 个氨基酸，预测分子量为