毕业论文-流式细胞术分析黄连素对 HepG2 细胞细胞周期的影响.doc

毕 业 论 文题 目：流式细胞术分析黄连素对HepG2细胞细胞周期的影响 学 院： 生 命 科 学 学 院 专 业： 生 物 技 术 毕业年限： 2012 年 学生姓名： 学 号： 指导教师： 流式细胞术分析黄连素对HepG2细胞细胞周期的影响刘秉焱指导教师：刘国安（教授）（西北师范大学 生命科学学院，甘肃 兰州 730070） 摘要：目的 研究黄连素对HepG2肝癌细胞细胞周期的影响。方法 用PI对黄连素处理的肝癌细胞HepG2进行染色，用流式细胞仪检测细胞周期的变化。结果 黄连素作用于HepG2细胞时，可将细胞周期阻滞在G2/M期，并且有“亚G1期”细胞的出现；抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸（N-acetyl-L-cystein，NAC）降低了黄连素诱导HepG2细胞的凋亡率。结论 黄连素可以诱导HepG2细胞发生凋亡,较高浓度的黄连素可以将HepG2细胞细胞周期阻滞在G2/M期，NAC可以降低黄连素诱导的细胞凋亡率，黄连素对细胞的毒性作用可能是通过氧化胁迫引起的。关键词：流式细胞术；HepG2细胞；黄连素；细胞周期；细胞凋亡A flow cytometry study of The effect of berberine on cell cycle in HepG2 cellLIU Bing-YanTutor:LIU Guo-an (Professor)Abstract：objective To study the effected of berberine on cell cycle.Methods PI was used to dye the hepatocarcinoma cell disposed by berberine. The change of cell cycle were detected by flow cytometry.results As disposed by berberine,the cell cycle were arrested in G2/M.There is an apoptotic peak appeared. N-acetyl-L-cystein reduce the apoptosis of HepG2 induced by berberine. Conclusion Berberine can inhibit proliferation of HepG2 by arresting cell in G2/M and inducing apoptosis .NAC could reduce the rate of cell apoptosis induced by berberine.The toxic effects on cells of berberine may be caused by the stress of oxidation. Key words: Flow cytometry; HepG2 cell; Berberine; Cell cycle ;Cell apoptosis 肝癌是一种世界上最常见的恶性肿瘤之一，在我国占居民恶性肿瘤死亡的第二位。全世界每年新发肝癌约26万例，占全部恶性肿瘤的4.0，而42.5的肝癌分布在中国，中国肝癌死亡率为20.4/10万，占全部恶性肿瘤死亡的18.81。由于肝癌起病比较隐匿，一经确诊往往已属晚期，故只能进行姑息性切除或放、化疗。疗效也不理想。因此，临床上肝癌病人急需特异性的、有效的新型抗癌方法。肿瘤发生的原因是相当复杂的，其中一个重要原因可能是细胞凋亡的趋势减弱2。因些，促进肿瘤细胞凋亡，纠正失衡的机体内环境，是抗肿瘤的一个重要方法。然而，细胞的凋亡受到很多种蛋白质分子调控，这些蛋白质大致可分为促凋亡和凋亡抑制两种蛋白。人体内的细胞注定是要死亡的，有些死亡是生理性的，有些死亡则是病理性的。有关细胞死亡过程的研究，近年来已成为生物学、医学研究的一个热点。细胞的死亡至少有两种方式，即细胞坏死与细胞凋亡。细胞坏死是早已被认识到的一种细胞死亡方式，而细胞凋亡则是近年逐渐被认识的一种细胞死亡方式。细胞凋亡是细胞的一种基本生物象，在多细胞生物去除不需要的或异常的细胞中起着必要的作用。它在生物体的进化、内环境稳定以及多个系统的发育中起着重要的作用。细胞凋亡不仅是一种特殊的细胞死亡类型，而且具有复杂的分子生物学机制以及重要的生物学意义。1965年澳大利亚科学家发现，结扎鼠门静脉后，电镜观察到肝实质组织中有一些散在的死亡细胞，它们的溶酶体并未被破坏，显然不同于细胞坏死。这些细胞体积收缩、染色质凝集、从其周围的组织中脱落并被吞噬细胞吞噬，机体无炎症反应。1972年Kerr等三位科学家首次提出了细胞凋亡的概念，宣告了对细胞凋亡的真正探索的开始。在此之前，关于胚胎发育生物学、免疫系统的研究，肝细胞死亡的研究都为这一概念的提出奠定了基础。 形态学观察发现细胞凋亡的变化是多阶段的3。细胞凋亡往往涉及单个细胞，即便是一小部分细胞也是非同步发生的。首先出现的是细胞体积缩小，连接消失，与周围的细胞脱离，然后是细胞质密度增加，线粒体膜电位消失，通透性改变，释放细胞色素C到胞浆，核质浓缩，核膜核仁破碎，DNA降解成为约180bp-200bp片段；胞膜有小泡形成，膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面，胞膜结构仍然完整，最终可将凋亡细胞遗骸分割包裹为几个凋亡小体，无内容物外溢，因此不引起周围的炎症反应，凋亡小体可迅速被周围专职或非专职吞噬细胞吞噬。 细胞凋亡的一个显著特点是细胞染色体的DNA降解，这是一个较普遍的现象。这种降解非常特异并有规律，所产生的不同长度的DNA片段约为180bp-200bp的整数倍，而这正好是缠绕组蛋白寡聚体的长度，表明染色体DNA恰好是在核小体与核小体的连接部位被切断，产生不同长度的寡聚核小体片段。实验证明，这种DNA的有控降解是一种内源性核酸内切酶作用的结果，该酶在核小体连接部位切断染色体DNA，这种降解表现在琼脂糖凝胶电泳中就呈现特异的梯状Ladder图谱，而细胞坏死呈弥漫的连续图谱。细胞凋亡的生化改变不仅仅是DNA的有控降解，在细胞凋亡的过程中往往还有新的基因的表达和某些生物大分子的合成作为调控因子。细胞凋亡之所以成为人们研究的一个热点，在很大程度上决定于细胞凋亡与临床病毒的密切关系。这种关系不仅表现在凋亡及其机制的研究，阐明了一大类免疫病的发病机制，而且由此可以导致疾病新疗法的出现，特别是细胞凋亡与肿瘤之间的密切关系倍受人们重视。一般认为恶性转化的肿瘤细胞是因为失控生长，过度增殖，从细胞凋亡的角度看则认为是肿瘤的凋亡机制受到抑制不能正常进行细胞死亡清除的结果。肿瘤细胞中有一系列的癌基因和原癌基因被激活，并呈过表达状态。这些基因的激活和肿瘤的发生发展之间有着极为密切的关系。癌基因中一大类属于生长因子家族，也有一大类属于生长因子受体家族，这些基因的激活与表达，直接刺激了肿瘤细胞的生长。这些癌基因及其表达产物也是细胞凋亡的重要调节因子。许多种类的癌基因表达以后，即阻断了肿瘤细胞的凋亡过程，使肿瘤细胞数目增加。因此，从细胞凋亡角度来理解肿瘤的发生机制，是由于肿瘤细胞的凋亡机制，肿瘤细胞减少受阻所致。从细胞凋亡角度和机制来设计对肿瘤的治疗方法就是重建肿瘤细胞的凋亡信号转递系统，即抑制肿瘤细胞的生存基因的表达，激活死亡基因的表达。 近年研究表明4，黄连素具有抗肿瘤作用，可诱导多种肿瘤细胞凋亡。黄连素又称小檗碱，是从黄连、黄柏、三棵针、唐松草等植物中提取的季胺类化合物，是存在于小檗科、罂粟科、毛茛科、芸香科、防己科、鼠李科植物中的异喹啉类生物碱，现已能够人工合成，具有抗菌谱较广、毒性和副作用较小等特点，临床常作为抗肠道细菌感染类药物应用。黄连素作为抗菌药在临床上已应用多年，其疗效确切，是一种广谱抗菌药物，对多种革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌及真菌、霉菌、病毒、原虫、线虫具有抑制或杀灭作用。近年来在动物实验研究及临床疗效观察中发现黄连素在临床上还有许多新用途，特别是肿瘤科、心内科、器官移植方面的研究应用有新的发现。有学者研究黄连素对人宫颈癌Hela细胞株的体外作用，探讨其可能的作用机制5。方法采用MTr法测定细胞生长抑制率；原位末端标记技术法(TUNEL)检测细胞凋亡率；免疫细胞化学法检测药物作用前后细胞COX-2和Bcl-2蛋白水平表达的变化。结果黄连素在体外对宫颈癌Hela细胞产生细胞毒作用并诱导其凋亡；免疫细胞化学法证实黄连素作用Hela细胞后Bcl-2蛋白表达下调，COX-2的表达无明显变化。得出结论，黄连素在体外对宫颈癌Hela细胞具有生长抑制作用，并可诱导细胞凋亡，其诱导凋亡作用可能与Bcl-2蛋白表达下调有关。有人探讨黄连素联合腺病毒介导的胞嘧啶脱氨酶自杀基因(Ad-CD)对直肠癌细胞的体外杀伤作用。结果发现黄连素可以增强自杀基因系统对直肠癌细胞的杀伤作用，可作为一种增效剂应用于直肠癌的治疗。史海岭等研究对黄连素作用后的肺腺癌A549细胞的增殖、迁移及黏附能力进行了检测，结果发现黄连素能够抑制A549细胞的迁移和黏附能力，其机制可能与下调MMP2和MMP9的mRNA表达，从而降低其活性有关。流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)是七十年代发展起来的高科学技术,它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体,同时具有分析和分选细胞功能。它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,可对群体细胞在单细胞水平上进行分析,在短时间内检测分析大量细胞,并收集、储存和处理数据,进行多参数定量分析;能够分类收集(分选)某一亚群细胞,分选纯度大于95%。在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。 细胞凋亡检测方法很多，应用流式细胞仪技术可根据细胞在凋亡过程中发生一系列形态、生化变化从多个角度对细胞凋亡进行定性和定量的测定6。（1）细胞形态变化 通过流式细胞仪测定细胞光散射的变化来观察细胞凋亡。在细胞凋亡早期，细胞前向角光散射的能力显著降低，90角光散射的能力增加；在细胞凋亡晚期，前向角和90角光散射的信号均降低。此方法特异性不强，目前使用较少。（2）细胞膜功能改变 磷脂酰丝氨酸（phosphatidyl serine ，PS）异位：正常情况下，PS位于细胞膜内层，细胞发生凋亡时PS从细胞膜内翻转并暴露在细胞膜外层，是细胞发生凋亡的早期事件。PS与Annexin（一种具有强力抗凝作用的血管蛋白）具有高度亲和力。应用流式细胞仪采用FITC-Annexin/PI双染法进行细胞凋亡检测，可同时描述三群不同状态细胞：FITC-Annexin-/PI-细胞，即正常活力细胞；FITC-Annexin+/PI-细胞，即凋亡细胞；FITC-Annexin+/PI+细胞，即已死亡细胞。此种方法操作过程简单，指标敏感，应用者越来越多。 PI/Hoechst33342双染法：Hoechst33342（HO）是一种DNA的特异性荧光染料，可通过完整细胞膜，应用PI/Hoechst33342可将细胞分为三群：正常活细胞（HO强/PI-），凋亡细胞（HO弱/ PI-），（由于凋亡细胞发生DNA降解和丢失，导致HO荧光减弱），死亡细胞（HO弱/PI+）。此种方法再结合凋亡细胞前向角光散射能力降低的特点，能更好地鉴定凋亡细胞，但HO须紫外光激发，由于很多流式细胞仪不配有紫外激光，故此法应用受限。 吖啶橙(AO)/溴化乙啶(EB)双染法:AO是一种异染性荧光染料,可通过完整的质膜,它与核酸的结合主要是嵌入DNA双链的碱基之间，其发射峰为530nm，呈绿色荧光。EB的理化特性与PI相似，不能通过完整质膜。应用AO/EB双染法也可以将细胞分成三群：正常活细胞（AO强/EB-），凋亡细胞（AO弱/EB-），死亡细胞（AO弱/EB+），原理与PI/Hoechst33342双染法相似，不同的是AO/EB双染法所的激发光是被广泛使用的氩激光（488nm），而不须紫外光，其缺点是染色过程较复杂，且AO易污染设备管道，因此使用此法者较少。 放线菌素D(7-AAD)染色法：7-AAD是一种核酸染料，它不能通过正常质膜，随着细胞凋亡、细胞死亡过程，质膜对7-AAD的通透性逐渐增加，结合细胞凋亡中DNA的有控降解，最后通过7-AAD标记DNA的强弱，将细胞分为三群：7-AAD强为死亡细胞，7-AAD弱是凋亡细胞，7-AAD-为正常活力细胞。此法具有染色快速、简便、价格便宜等优点。另外，由于此法不破坏细胞膜，故还可联合使用FITC、PE标记的膜蛋白,对特殊细胞群及亚群进行多色荧光分析(虽然AO/EB双染法也不破坏被检细胞膜,但由于AO及EB的发射光波谱分别与FITC和PE的发射光波谱相似，故AO/EB法不能与FITC和或PE联合使用)。此法是应用核酸染料测定细胞凋亡的流式细胞仪法中十分实用的方法。（3）细胞器改变 线粒体膜APO2.7蛋白表达：早期凋亡细胞的线粒体膜出现APO2.7蛋白表达，利用荧光标记的单克隆抗体，运用流式细胞术可以检测早期凋亡细胞。（4）DNA含量变化 主要是PI染色法，由于凋亡细胞DNA发生有序降解，被降解的低分子量DNA片段从变性细胞膜（经乙醇及透膜剂处理）漏出细胞外，使得凋亡细胞内的DNA含量减低，在流式细胞仪测定细胞DNA含量直方图中G1峰前可出现亚二倍体峰，即所谓凋亡峰。通过测定凋亡峰百分含量，便可知凋亡细胞比例。此法简便、快速，是目前常用的、经典的测量凋亡细胞的方法。此法存在问题：少量的正常的低DNA含量细胞、由于机械损伤产生DNA含量减低的坏死细胞、染色体丢失的分裂相细胞以及细胞碎片和微核等都可能出现在亚二倍体峰内。因此，此法的特异性较低。（5）DNA断裂点标记 细胞凋亡时发生DNA断裂,利用末端转移酶可以将dUTP标记到断裂点上,称作原位缺口末端标记（TUNEL）技术。此法有直接标记和间接标记两种，前者的标记物是FITC-dUTP，后者的标记物是生物素标记的dUTP,需要再用FITC标记的亲和素与生物素标记的dUTP结合，使标记反应倍增，故间接标记法灵敏度高，但操作较复杂。TUNEL还可以配合其它单抗同时进行细胞表型分析，或与DNA含量同时分析。TUNEL法因其灵敏度高而被广泛采用。（6）细胞凋亡相关基因产物检测细胞凋亡是一个多种基因参与的复杂过程,目前已知与bcl-2基因、c-myc基因、P53基因等有关，这些基因都有相关产物，目前针对这些相关产物已有单克隆抗体生产，应用这些单抗，通过流式细胞仪可检测造血细胞凋亡相关基因蛋白表达水平，相互关系。流式细胞仪测定细胞凋亡方法、层次众多，且具有快速、准确特点，应用十分广泛。在实际应用中应注意采用多种方法结合使用，使结果更加可靠准确。1.材料与方法1.1 材料与试剂 人肝癌细胞株HepG2引自兰州大学生命科学学院，培养基RPMI1640（美国Gibcobrl），小牛血清（杭州四季青）。1.2 仪器 高速冷冻离心机（Beckman L-860M，美国），冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂），电热恒温水浴锅（上海医疗器械五厂），CO2培养箱（Forma Scientific，美国），超净工作台（苏净集团，江苏），流式细胞仪（Beckman Coulter Cell Lab Quanta SC Flow Cytometer，美国），细胞培养板（Costar，美国）。1.3 PI染色流式细胞术检测黄连素对HepG2的影响1.3.1 原理流式细胞术就是利用流式细胞仪对处于快速直线流动状态中的单列细胞或生物颗粒进行逐个、多参数、快速的定性、定量分析或分选技术。DNA含量检测是流式细胞仪最早且最为广泛的应用之一。处于增殖周期中的细胞，根据所处的不同细胞周期（G0/G1、S、G2/M），其DNA含量分布在2n-4n之间。发生凋亡的细胞由于核内DNA裂解成许多小片段，被乙醇固定后，乙醇能迅速溶解细胞膜中的脂质，对细胞产生通透作用（即在细胞膜上形成小孔），导致小分子量的DNA片段穿过胞膜至乙醇溶液中而丢失，仅剩下大片段DNA，最终导致凋亡细胞内DNA含量减少。经DNA荧光染料染色后，因与荧光染料结合的DNA已减少，致使荧光强度减少，从而形成一个DNA含量小于2n（即小于G1 期细胞）的分布区，称为“亚G1（Sub G1）峰”。PI（propidium iodide，碘化丙啶）属嵌入性核酸荧光染料，可嵌入到DNA、RNA的碱基对中，无碱基特异性7。为了获得特异的DNA分布，染色前必须用RNA酶处理细胞，排除双链RNA的干扰。大量研究表明,活性氧(reactive oxygen species，ROS)在多种抗肿瘤药物诱导凋亡过程中起着介导和调节作用8。抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸（N-acetyl-L-cystein，NAC）可以抑制细胞中的ROS对细胞凋亡的调节作用。同实验室的宋静进行了黄连素和NAC对肝癌细胞HepG2的毒性作用研究，测得黄连素处理HepG2细胞24h的IC50值为 44.1molL-1，5mmolL-1的NAC对肝癌细胞HepG2的增殖影响不大。1.3.2 方法 (1)接种 取对数生长期的HepG2细胞，用常规胰酶消化制成单细胞悬液，并用含10%新生小牛血清的RPMI-1640培养液调整细胞浓度为105ml-1接种于6孔培养板，每孔3 ml。将各细胞培养板置于37、5.0 %CO2的饱和湿度培养箱中培养24h。 (2)加药 培养约24小时后，依次加入黄连素（44.1molL-1），黄连素（160molL-1）、NAC（5mmolL-1），NAC（5mmolL-1）+黄连素（44.1molL-1），空白对照组不加药品，以相同体积的培养基代替,继续培养24h。 (3)处理 各组细胞培养24h后取出，用常规胰酶消化贴壁细胞，将消化液移入标有对应标签的试管中，用预冷的PBS洗2次，弃去上清，调整沉淀物约为0.2ml，每个样品加入2ml4预冷的70%乙醇，吹打均匀，在20下固定至少24h。测量前以1500rmin-1离心5min，去上清，PBS洗2次后去上清，再重悬于455lPH7.3的PBS中，加入25lRNase A，终浓度为100g/ml，37孵育30min。每个样品加20lPI至终浓度为40g/ml，避光染色20min。(4)检测 用260目（孔径约50m）尼龙网过滤后，用488nm的氩离子激光管，测前向、侧向三色光和红色荧光。2 结果2.1 PI染色流式细胞术检测黄连素对HepG2的影响2.1.1 黄连素作用培养24h对HepG2细胞细胞周期的影响 黄连素作用24h后，PI染色流式细胞术检测发现，160mol.L-1黄连素处理的HepG2细胞周期发生明显改变，表现为G0/G1期细胞比例减少， G2/M期细胞比例增加，与对照组相比，经方差分析，P0.01，差异极显著。如图1。图1.不同浓度黄连素作用培养24h对HepG2细胞周期的影响（注：与对照组相比，P0.01）2.1.2 黄连素作用培养24h对HepG2细胞细胞凋亡的影响 流式细胞术检测发现，44.1molL-1黄连素作用24h的HepG2，在Gl峰前出现亚倍体峰(Sub-Gl)即凋亡小峰。经分析，其凋亡率为14.87%0.45%，见图4。44.1molL-1黄连素和5mmolL-1NAC联合作用24h的HepG2，也在Gl峰前出现亚倍体峰(Sub-Gl)即凋亡小峰。经分析，凋亡率为11.73%0.67%。见图5。对照组培养24h后检测，无Sub-Gl凋亡小峰。见图2。5mmolL-1NAC作用24h的HepG2，检测亦未出现Sub-Gl凋亡小峰。见图3。 图2.培养24小时后的对照组HepG2细胞细胞周期分布情况 图3.经5mmolL-1NAC作用培养24h后HepG2细胞细胞周期分布情况 图4.经44.1molL-1黄连素作用培养24h后HepG2细胞细胞周期分布情况 图5.经5mmolL-1NAC+44.1molL-1黄连素作用培养24h后HepG2细胞细胞周期分布情况 3 讨论与分析原发性肝癌(简称肝癌)是由肝细胞或者肝内胆管上皮细胞发生的恶性肿瘤，在我国的恶性肿瘤发病中居第二位，全世界肝癌新发病人的42.5%分布于中国大陆。肝癌极具侵袭性。目前肝癌主要是手术干预(肝切除和肝移植)和局部射频消融,这些方法只能对早期局部的小肿瘤疗效好，而更晚期的肿瘤则很难治愈9。现行肝癌治疗药物以阿霉素和5一氟尿嘧啶等最为常用，但是这些药物对患者的治疗有效率低且无明显延长寿命效果，因此寻找和开发新的特异性高疗效好的抗肿瘤药物对于肝癌治疗具有重大意义。黄连素是我国应用已久的一种中药，以往临床上主要用来清热解毒，抗菌消炎。近年来有研究表明，黄连素还有抗肿瘤作用。据报道10，黄连素对肝癌、结肠癌、白血病、食管癌等有不同程度的抑制作用，本实验的检测结果与此相符合。PI染色流式细胞术检测细胞周期，结果显示160mol.L-1黄连素作用培养24h后，HepG2细胞周期发生明显改变，表现为G0/G1期细胞比例减少，G2/M期细胞比例显著增加。张卫东等也发现11黄连素作用48 h后HepG2细胞周期发生明显改变，也表现为G0/G1细胞比例减少，S期、G2/M期细胞比例增加。并且随着黄连素浓度的增加，这种改变愈加明显。而贺志云研究发现12，1.0mol.L-1、10mol.L-1、100mol.L-1黄连素作用72h后，HepG2细胞表现为GO/G1期细胞比例明显增加，S期、G2期细胞比例显著下降。表明黄连素可以通过对肝癌细胞HepG2细胞周期产生阻滞而抑制其增殖，并且该阻滞可能随黄连素的处理时间和浓度不同而异。 黄连素可以诱导HepG2细胞凋亡，但其具有复杂的机制，其中黄连素可能通过ROS诱导HepG2细胞凋亡。本实验发现，黄连素诱导的HepG2细胞凋亡可以被抗氧化剂NAC显著抑制，但是NAC这种逆转作用不是完全的，其中机制有待进一步查明。综上所述,黄连素可对肝癌细胞HepG2产生周期阻滞,这种阻滞具有时间依赖性和浓度依赖性；并且黄连素能够诱导HepG2细胞凋亡,最终使HepG2细胞的体外增殖受到抑制。说明黄连素具有治疗肝癌的潜能。参考文献1 邓敬桓，秦雪原发性肝癌发生机制的研究进展J环境与健康杂志，2007，24(11)：924926.2 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