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喹诺酮类（QNs）及食品中 QNs 残留 检测方法研究 冯晓方 刘苗苗 国贸食品科学研究所 摘 要：喹诺酮类（4-quinolones），又称吡酮酸类或吡啶酮酸类，是近年来一类人工合成的抗菌药，具有抗菌谱广、抗 菌力强、口服吸收好、组织浓度高、与其它抗菌药物无交叉耐药性、不良反应少等特点，已成为临床细菌感染性疾病的常用 药物。随着 QNs 在家禽类动物中的大量使用，很多地方出现滥用该类药物的情况，使得 QNs 在动物性食品中残留的现象普 遍存在，QNs 在人体内累积后能产生毒副作用，而低浓度的 QNs 残留能导致病原微生物产生耐药性，从而危害人类健康，本 文分析了多种喹诺酮类（QNs）及食品中 QNs 残留检测方法，以便更好地监控食品中 QNs 残留，确保食品安全性。 关键词：喹诺酮类（QNs）；药物残留；检测方法；食品安全 等 ) 烂鳃病、溃疡病、弧菌、出血性 肠炎病；鳖皮肤溃疡病、红脖子病、 出 血 性 败 症、 水 肿 病； 鲟 Acipenser sinensis 肠炎病、气泡病、细菌败血症、 爱德华氏病、表皮溃疡病；牛蛙 Rana catesbeiana 红腿病、链球菌病等 5。 2 食品中喹诺酮类药物的残留 限量规定 目前我国已经批准恶喹酸 (oxolinic acid, OXA) 、 氟 甲 喹 ( flumequine, FLU)、诺氟沙星 (norfloxacin，NOR)、 二氟沙星 (difloxacin，DIF)、单诺沙星 ( 达 氟 沙 星，danofloxacin，DANO)、 沙 拉 沙 星 (sarafloxacin，SARA)、 恩 诺 沙 星 (enrofloxacin，ENRO)、 环 丙 沙 星 (ciprofloxacin，CIPRO)、 氧 氟 沙 星 (ofloxacin，OFL)、 洛 美 沙 星 1.3 在水产养殖中的应用 喹诺酮类药物作为一种广谱高效 的抗菌药物，最早应用于水产养殖细 菌病的防治始于 20 世纪 70 年代 1， 初期该类药物在我国南方养鳗业中开 始使用 2 , 随着药物价格的下降 , 目 前已被广泛应用于水生动物的疾病治 疗 3, 4。喹诺酮类药物适用于多种水产 动物的疾病防治，淡水类出血性败血 症、烂鳃病、肠炎病、赤皮病、打印 病等；弧菌性肠炎、鳗爱德华氏病、 鳗赤鳍等；黄鳝 Monopterus albus 出血 病；对虾立克次氏体病、烂眼病、黄 鳃病、红鳃蟹的烂鳃病、甲壳溃疡病、 细菌性抖抖病；海水养殖类 ( 大黄鱼 P seudosciaena crocea 、鲈 Lateolabrax japonicus、美国红鱼 Sciaenops ocellatus 1 喹诺酮类药物的应用 喹诺酮药物与其他抗菌药的作用 点不同，它们通过选择性地抑制细菌 DNA 促旋酶，阻断 DNA 的复制而产生 抗菌作用。喹诺酮药物目前已广泛用 于医药、畜禽养殖以及水产养殖。 1.1 在医药中的应用 目前临床主要应用抗菌活性强、 毒性低的第三、四代喹诺酮类药物。 广泛用于泌尿生殖系统感染、肠道感 染、呼吸道感染、中枢神经系统感染、 骨骼系统感染、 皮肤与软组织感染等。 1.2 在畜禽养殖中的应用 在兽医临床上，第三代喹诺酮类药 物的应用非常广泛，主要用于敏感菌所 致的呼吸道、消化道和尿道感染，同时 可促进动物的日增重和饲料转化率。 Dec 2014 CHINA FOOD SAFETY 61 分析与检测 留分析的研究报道也有很多，总结其 方法主要有：微生物法、免疫分析法、 色谱法。 3.1 微生物法 微生物法是一种利用对 QNs 药物 敏感的微生物的抑菌效果来达到快速 检测 QNs 残留的方法。该方法的优点 是操作简便、成本低、检测快速，但 灵敏度不高，特异性差。选择对 QNs 敏感的菌是检测技术的关键，我国行 业标准 SN/T1751.1-2006 微生物抑制 法，利用 QNs 药物对大肠杆菌 E. coli ATCC8739 敏感菌的抑制作用判别样 品中是否含有环丙沙星等 7 种 QNs， 检测限为 40500g/kg，适用于肉、 蛋、鱼和虾中的 QNs 筛查检测。国外 Okerman L7报道了用改进的欧洲四平 皿法 (Four-Plate Test, FPT) 检测市场 零售肉中恩诺沙星和环丙沙星的残留， 可检测高浓度的 QNs 残留。 3.2 免疫分析法 免疫分析法（Immunoassays, IAs） 基于抗原抗体间的特异性反应，具有 敏感、准确、快速、简便等优点，非 常适用于复杂基质中痕量组分的快速 沙星、 麻保沙星、 二氟沙星、 恩诺沙星、 恶喹酸、达氟沙星、奥比沙星、萘啶 酸等 9 种喹诺酮类药物在牛、猪、家 禽以及鱼中的 MRL。我国 2002 年发布 的农业部第 235 号公告动物性食品 中兽药最高残留限量也规定了达氟 沙星、 恩诺沙星、 沙拉沙星、 二氟沙星、 恶喹酸和氟甲喹等 6 种 QNs 药物在动 物肌肉组织中的最高残留限量。 3 食品中喹诺酮药物残留的检 测方法研究 目前我国已发布的食品中喹诺酮类 药物残留检测方法标准有十几项，其中 有 GB/T 23412-2009，蜂蜜中 19 种喹 诺酮类药物残留量的测定方法 ，液相 色谱 - 质谱 / 质谱法； SN/T 3027- 2011 出口蜂王浆中氟喹诺酮类残留量 测定方法 酶联免疫法；SB/T 10925- 2012 动物组织中氟喹诺酮类药物残留 的快速筛查检测；GB 29692-2013，牛 奶中喹诺酮类药物多残留的测定 高效 液相色谱法；农业部 2086 号公告 -4- 2014 饲料中氟喹诺酮类药物的测定 液 相色谱 - 串联质谱法等等。 此外，国内外有关食品中 QNs 残 (lomefloxacin，LOME) 和 培 氟 沙 星 (pefloxacin，PEF) 等 11 种喹诺酮类药 物（QNs）可应用于畜禽和水产养殖 6。 国际食品法典委员会、美国、欧盟、 日本等都已制定了多种喹诺酮类药物 在动物组织中的最高残留限量。如： CAC/MRL2-2011 Maximum Residue Limits of Veterinary in Foods中规定 了单诺沙星、沙拉沙星、氟甲喹 3 种药 物在牛、猪、禽的肌肉、肝、肾、脂 肪以及鲑鱼中最高残留限量（maximum residue limit, MRL）； 欧 盟（EU） 在 1999 年 3 月公 布 的 NO.508/1999 号 法规中对恩诺沙星、环丙沙星、二氟 沙星、单氟沙星、沙拉沙星、马波沙 星、氟甲喹和恶喹酸作了限量规定， 其中牛奶中最高残留限量为：单诺沙 星 30g/Kg, 氟甲喹 50g/Kg，马波 沙星 75g/Kg，恩诺沙星和环丙沙星 总限量为 100g/Kg；美国Electronic Code Federal Regulations中规定单诺 沙星在牛的肌肉和肝脏中的 MRL 应小 于 0.2ppm，恩诺沙星在牛和猪的肝脏 中 MRL 应分别小于 0.1 和 0.5ppm；日 本肯定列表中规定了米洛沙星、诺氟 62 食品安全导刊 2014年12月 T echnology 科技 分析与检测 Dec 2014 CHINA FOOD SAFETY 63 分析与检测 高通量分析，目前已广泛用于 QNs 药 物的多残留分析。目前主要有酶联免 疫分析法（ELISA），胶体金免疫层析 法，免疫传感器分析法，时间分辨荧 光免疫分析法和高效免疫亲和色谱法 （HPIAC）。 3.3 色谱分析法 3.3.1 高效液相色谱法（HPLC） 高效液相色谱法主要是用高效液相 色谱系统来改变流动相的组成去调节色 谱柱的保留值范围及选择性，能使用不 同样品的分离分析需求。QNs 药物分子 机构的基本骨架均为氨（杂）双并环结 构，并在 C3 位有羧基。因此一般根据 其酸碱性、极性和荧光性的差异优化色 谱条件，更多采用梯度洗脱和程序波长 技术反相色谱柱，以实现同时检测十几 中喹诺酮类。根据 FQs 的紫外吸收波长 或荧光发射波长的特性配备紫外检测器 (UV)、二极管阵列检测器 (DAD) 或荧 光检测器 (FLD)，使用 DAD 或 FID 可弥 补 UV 的不足且灵敏度、选择性显著提 高。Roybal 等 8 用荧光 HPLC 检测了鲶 鱼、虾、鲑鱼组织中的环丙沙星、恩诺 沙星、沙拉沙星和二氟沙星残留量。将 鱼组织用酸化乙醇提取，在阳离子交换 固相萃取柱中离析，甲醇洗脱，用荧光 检测器的进行分析。 流动相为乙腈-2% 醋酸 (16：84)，激发波长为 278nm，发 射波长 450nm。检测限可达 20g/kg， 回收率为 56%93%。李海燕等 9 报道 克 HPLC-FID 同时检测鸡蛋中 9 种喹诺 酮和氟喹诺酮类药物 （噢啉酸、 氟甲喹、 麻保沙星、 诺氟沙星、 甲磺酸培氟沙星、 单诺沙星、恩诺沙星、二氟沙星和沙拉 沙星） 。 样品经PBS提取， HLB小柱净化， 用不同比例的甲醇 - 水洗涤洗脱，检 测麻保沙星的定量限 (LOQ ) 为 2g/ kg，其他药物的 LOQ 均为 1g/kg。 目前，各国对于 QNs 药物残留的 检出线要求越来越低。HPLC 虽然检测 结果稳定，具有较好的灵敏度和回收 率，但由于方法和仪器自身的限制， 检出限难以进一步将低，而且前处理 过程比较繁琐。 3.3.2 液相色谱 - 质谱联用技术 液相色谱 - 质谱联用方法 (Liquid chromatography/Mass Spectrometry LC- MS) 是 QNs 多残留检测方法及标准中 应用最多的，是同时检测和确证十几 种 QNs 残留的有效方法之一。QNs 种 类繁多，有些喹诺酮对紫外和荧光检 测器的灵敏度不高，质谱检测器具有 高灵敏度和选择性，定性、定量准确， 更适合对QNs进行多组分的确证检测。 我国国标中应用液相色谱 - 电喷雾电 离质谱 / 质谱技术建立同时检测十几 种喹诺酮类药物的分析体系，其方法 检测限低于 10g/kg，适用于水产、 蜂蜜、蜂王浆、畜禽肌肉组织等多种 样品。包晓丽等 10 采用固相萃取方法 进行样品前处理，结合超高压液相色 谱四极杆串联质谱联用技术，可同时 检测牛奶中 22 种 QNs，综合技术的最 优化达到同时检测 QNs 种类数之最。 李雅丽等 11 建立了选择 C18 反相色 谱柱 (1502.1mm，3m)，0.1% 甲酸水溶液 - 甲醇梯度洗脱的色谱条 件，采用四级杆串联质谱，电喷雾电 离 (ESI)、正离子、多反应监测 (MRM) 模式，检测鸡肉和鱼肉中 19 种喹诺酮 类药物残留的 HPLC-ESI-MS/MS 检测 64 食品安全导刊 2014年12月 T echnology 科技 分析与检测 方法。方法的线性范围为 0.350g/ kg， 相 关 系 数 (r) 大 于 0.9956，19 种喹诺酮类药物在鸡肉和鱼肉的平 均 回 收 率 分 别 为 75.3%96.3%、 79.7%94.2%，日内和日间的变异系 数小于 10%。 3.3.3 高效薄层色谱法（HPTLC） HPTLC 是在 HPLC 的理论和实践的 基础上，结合经典的薄层色谱法发展 起来的，在药物残留分析上，因其分 析速度快，对样品预处理要求低，操 作简单，现在应用也较为广泛。国内 的研究较少，最近国外在动物性食品 安全的残留分析上已有报道，Juhel- Gaugain 等 12 建立了测定猪肉中 7 种 QNs 的 HPTLC 快 速 分 析 法， 待 测 物 包括 ENR、CIP、DAN、NOR、FLU、 OXO、NAL。 样 品 经 乙 腈 -0.1mol/ LNaOH(10+1) 提 取， 离 心 后 取 上 清 液浓缩，残留物溶解于磷酸盐缓冲 液 (0.5mol/L,pH7.4)， 样 品 液 通 过 C8(Sep-Pak) 柱， 甲 醇 -0.1mol/L 氨 水（75+25） 洗 涤， 甲 醇 -0.1mol/L 氨水（75+25）洗脱，浓缩后溶于甲醇， 点样测定，方法检测线低于 515g/ kg。Vega 等 13 报道了测定鱼饲料和 组织中 OXO、FLU 的高效薄层色谱法 (HPTLC)。 饲 料 经 乙 腈 -0.02mol/ LKOH( 含 1%KCl)(10+1) 提 取， 离 心 后取上清液浓缩点样测定；用磷酸盐 缓冲液 pH8.0 提取组织样品，向样 品 液 中 加 入 乙 腈 -0.02mol/LKOH 沉 淀蛋白质，上清液经无水硫酸钠脱 水， 浓 缩 后 溶 解 于 乙 腈 -0.02mol/ LKOH 中， 点 样 测 定。HPTLC 板 为 硅 胶 60F254，展开剂为甲苯 - 乙酸乙 酯 -90% 甲酸 (60+30+10)，光密度 法扫定量 (320nm)。饲料样品的回收 率为 97%99%，变异系数 1%2%。 测定组织样品时需在样品展开后喷以 硫酸 - 高氯酸试液，灵敏度可提高 10 倍，检测限达 10g/kg。 3.3.4 高效毛细管电泳分析法 （HPCE） 高效毛细管电泳法是近年发展起 来的新技术，与常用的 HPLC 法相比， 它不受运行缓冲液酸、碱性和其中的 表面活性剂等添加剂的影响，具有样 品用量少、分析速度快、分析效率 高、适用范围广等特点，有利于实际 样品的分析。Hernandez 等 14 应用非 水毛细管电泳法 (non aqueous capillary electrophoresis，NACE) 对猪肾样品中 的恩诺沙星、环丙沙星、达氟沙星、 二氟沙星、麻保沙星、氟甲喹、恶 喹酸进行分析，用 20mmol 醋酸铵， 0.004%HDB (polycation hexadimethrine bromide)，含 4% 乙酸 (pH5.4) 的乙腈 溶液为流动相，分离效果很好。前处 理用盐酸作为提取剂，Baker C18 柱固 相萃取，回收率大于 80%。 王艳红 15 建立了同时检测鸡肉中洛美沙星、 氧氟沙星、恩诺沙星、培氟沙星多残 留的基质固相分散萃取法 - 高效毛细 管电泳法（HPCE）及液相 - 质谱联用 (LC-MS) 验证方法。 采用 pH 值为8.8 的 35mmol/L 硼砂缓冲液，乙腈沉淀 蛋白，基质固相分散萃取时用正己烷 淋洗，4% 氨水甲醇洗脱。4 种药物的 回收率为 75.9%91.6%，最低检测限 范围为 51100g/kg。 4 结语 综上所述，检测喹诺酮类在动物 食品中的残留，应选择特异性强、灵 敏度高、高效、快速的检测方法，其 中微生物法检测限过高， 特异性不强、 不够灵敏，适合于快速筛选；色谱法 具有高效、快速、灵敏、准确的特点， 而且是目前应用最多的一种，但该方 法前处理复杂， 所需仪器也较为昂贵， 不适合大量样品的快速检测；免疫分 析技术特异性强，简单、灵敏、快捷 非常适用于大量样品的快速检测及现 场快速监控，因此，多残留 ELISA 检 测试剂盒的研制将成为今后研究的一 个热点，随着科技的进步，很有可能 取代色谱仪器分析成为分析药物残留 Dec 2014 CHINA FOOD SAFETY 65 分析与检测 的最常用方法。 参考文献： 1 ENDO T, OGISHMA K, HAYASAKA H, et a.l. 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