高中生物选修专题一基因工程.ppt

基因工程专题复习,近五年，基因工程只要考点：1、基因工程的工具；限制酶，DNA连接酶，运载体单独考察比较少。2、基因工程的操作步骤中，目的基因的获取年年考。重点考察“从基因文库与CDNA文库的构建过程及区别”另外，“基因表达载体的构建”也是考察的重点。经常与限制酶、DNA连接酶一起考察，涉及启动子、终止子、标记基因等。3、导入受体细胞的考察较简单，2010与2013年主要集中在导入动物和植物细胞中。4、目的基因的检测与鉴定是重点考察内容，每年都有涉及，分子水平和个体水平都考察，重点理解分子杂交；蛋白质工程考察较少。,什么叫基因工程？,基因工程又叫基因拼接技术或DNA重组技术。该技术是在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的基因产物。,（一）基因工程的概念,基因拼接技术或DNA重组技术,生物体外,基因,DNA分子水平,人类需要的基因产物,剪切,拼接,导入,表达,（二）DNA重组技术的基本工具,分子手术刀限制性内切酶,分子缝合针DNA连接酶,分子运输车运载体,识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。,主要是从原核生物中分离纯化出来的一种酶。能将外来的DNA切断，由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶。,4000种。,形成两种末端,一、“分子手术刀”限制性核酸内切酶,什么叫黏性末端？,被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。,什么叫平末端？,当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。,限制性内切酶,特点：特异性，即识别特定核苷酸序列，在特定的切点切割。举例：大肠杆菌的一种限制酶（EcoR)能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开形成黏性末端，Sma能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切割形成平末端。,拓展,（EcoR)能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开形成黏性末端，在切开后的序列正着读和反着读碱基序列都一样称之为回文序列,回文对：乾隆客上天然居，居然天上客；纪晓岚人过大佛寺，寺佛大过人。,二、“分子缝合针”DNA连接酶,1、DNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，是把梯子两边扶手的断口连接起来，这样一个重组的DNA分子才能形成。,DNA连接酶分子缝合针：,E.coliDNA连接酶：只能连黏性末端。T4DNA连接酶：还能连平末端，但效率较低。来源：前者源于大肠杆菌；后者源于T4噬菌体。,大肠杆菌,T4噬菌体,不同来源DNA片断结合,双链断开,EcoRI切割,1.作用：,要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物体内进行表达，首先得将这个基因送到乙生物的细胞内去。能将外源基因送入细胞的工具就是运载体。,将外源基因送入受体细胞。,3、分子运输车运载体,2、载体的种类,1、质粒：是一种裸露、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，具有自我复制能力的双链环状DNA分子；2、噬菌体的衍生物；3、动植物病毒等。,作为运载体必须具备的条件,1.能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。2.具有一个或多个限制酶切割点，便于供外源DNA片段插入。3.具有特殊的标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。,3.质粒特点：,三、基因工程的基本操作程序,二、基因表达载体的构建,三、将目的基因导入受体细胞,四、目的基因的检测与鉴定,一、目的基因的获取,一、目的基因的获取,1.基因的结构,2.目的基因的概念,3.目的基因的获取的方法,1.基因的结构,（1）原核生物基因结构,编码区,非编码区,非编码区,编码区上游,编码区下游,编码蛋白质,调控遗传信息的表达,（调控程序）,AATGTGCACGTAGTTAGTTACACGTGCATCAATC,启动子,终止子,编码区,非编码区,非编码区,（能编码蛋白质）,启动子,终止子,真核与原核生物基因结构的比较,外显子,内含子,编码蛋白质,（不能编码蛋白质）,相同点：都是由能够编码蛋白质的编码区和具有调控作用的非编码区。,不同点：原核细胞基因的编码区是连续的；真核细胞的编码区是间隔的，不连续的。,（2）真核生物基因结构,2.目的基因的概念,主要是指编码蛋白质基因，也可以是一些具有调控作用的因子。,目前被广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因（抗病毒、抗细菌)、人胰岛素基因等。,3.目的基因的获取的方法,（3）用化学方法直接人工合成目的基因,（1）从基因库中获取目的基因,（2）应用PCR技术扩增目的基因,（1）从基因库中获取目的基因,基因文库和部分基因文库的慨念,基因组文库和cDNA文库的主要区别,怎样从基因文库中找到我们所需要的目的基因,基因文库和部分基因文库的慨念：,将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库。,基因文库中包含了一种生物所有的基因,这种基因文库叫做基因组文库。,基因文库中包含了一种生物的一部分基因,这种基因文库叫做部分基因文库。如：cDNA文库。,基因组文库的建立方法,提取某种生物的全部DNA,用适当的限制酶酶切,一定大小的DNA片段,将DNA片段与运载体连接,导入受体菌中储存（基因组文库）,目的基因,分离,部分基因文库的建立方法,mRNA,反转录酶,单链DNA,合成,双链DNA（cDNA）,载体,插入,导入,受体菌群（cDNA文库）,分离,目的基因,cDNA合成过程,第一步：反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。第二步：核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链降解，使之变成单链的DNA。第三步：以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。,26,基因组文库和cDNA文库的主要区别,小,大,无,有,无,有,某种生物的部分基因,某种生物的全部基因,可以,部分基因可以,怎样从基因文库中找到我们所需要的目的基因,根据目的基因的有关信息例如，根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA，以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。,（2）应用PCR技术扩增目的基因,定义：,原理：DNA复制,PCR是多聚酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术，在短时间内大量扩增目的基因,DNA分子热变性（在9095OC时，解旋，双链分开温度降低又结合成双链）因此，在PCR技术中不需要解旋酶（与复制不同之在处),仪器：,PCR扩增仪（自动调控温度的仪器）,条件：,有一段已知的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物，脱氧核苷酸，酶等。,过程：,a.DNA热变性（9095OC)：,b.复性或退火（5560OC)：,c.延伸（7075OC)：,d.重复a.b.c步骤：,双链DNA模板在热的作用下，氢键断裂形成单键DNA,系统温度降低，引物结合到互补DNA链上，形成局部的双链DNA,在Taq酶作用下，合成与模板互补的DNA子链，形成双链DNA,每重复一次，目的基因增加一倍,PCR扩增为指数形式扩增2n(n为扩增循环的次数），在短时间内扩增大量目的基因。,(3)用化学方法直接人工合成目的基因,蛋白质氨基酸序列mRNA的核苷酸序列目的基因序列目的基因针对：基因比较小，核苷酸序列又已知,推测,化学合成,推测,1.目的：,二.基因表达载体的构建核心,IMN,2.组成：,使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代。,同时使目的基因能表达和发挥作用。,(3)终止子,(4)标记基因,(2)启动子,(1)目的基因,不同受体细胞，目的基因导入受体细胞的方法不同，基因表达载体的构建有所差异。,质粒,DNA分子,限制酶处理,一个切口两个黏性末端,两个切口获得目的基因,DNA连接酶,重组DNA分子（重组质粒）,同一种,基因表达载体的构建,33,三、将目的基因导入受体细胞,1.转化：,目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的工程,2.常见转化方法：,农杆菌转化法：双子叶植物和裸子植物。,（1）将目的基因导入植物细胞,基因枪法：单子叶植物。,花粉管通道法,（3）将目的基因导入微生物细胞感受态细胞法。,（2）将目的基因导入动物细胞显微注射法。,特点:,农杆菌转化法：,（1）将目的基因导入植物细胞,能感染双子叶植物和祼子植物,对大多数单子叶植物没有感染能力,过程：,Ti质粒的TDNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上,适用生物：,双子叶植物、祼子植物。,基因枪法：,利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法,操作方法：,金属粒：,将目的基因导入单子叶植物细胞,钨粉粒子和金粉粒子，粒子的直径一般在0.64um。,适用：单子叶植物,旧式的基因枪靠火药为动力，将子弹头上粘的打出。其原理和声音都与鸟枪相仿，成功率仅为千分之八。小图为子弹,新式的基因枪靠高压氦气为动力，将微粒载片上的送出，成功率在左右。小图为微粒载片和阻挡网。,手提式基因抢,花粉管通道法：,将目的基因导入植物细胞,操作方法：,特点：,在植物花受粉后，花粉形成花粉管还末愈合前期，剪去柱头，然后，滴入DNA（含目的基因）使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞,十分简便经济,例：,转基因抗虫棉,细胞类型：,操作程序：,_显微注射法：,（2）将目的基因导入动物细胞,发育成新性状动物,移植到子宫或输卵管,培养成早期胚胎,显微注射,取受精卵（体内或体外受精）,提纯含目的基因表达载体,受精卵,倒置显微注射仪,德国莱卡公司,将目的基因导入动物细胞：,常用法：,常用菌：,微生物作受体细胞原因：,繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少,过程：,大肠杆菌,Ca2+处理获得感受态细胞,Ca2+处理大肠杆菌,感受态细胞,表达载体与感受态细胞混合,感受态细胞吸收DNA,_感受态细胞法,（3）将目的基因导入微生物细胞,四目的基因的检测与鉴定,（1）DNA分子与DNA分子的之间杂交,（2）DNA分子与RNA分子的之间杂交,（3）蛋白质分子（抗原与抗体）之间杂交,2.个体生物学水平的鉴定：,抗虫、抗病结种实验，活性比较实验,1.检测方法：,分子杂交技术：,1.检测,转基因生物的DNA,探针,15N,15N,14N,14N,（1）检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因,基因探针：,放射性同位素等标记的DNA分子,方法：,DNA分子杂交技术,变性,变性,变性,方法：,DNA分子杂交技术,（2）检测目的基因是否转录出了mRNA,探针,15N,15N,转基因生物的mRNA,14N,14N,如果显示出杂交带，就表明待测样品目的基因已经转录。,提取,（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质,方法：抗原-抗体杂交,Bt毒素