根域限制栽培对‘巨玫瑰’葡萄生长及果实品质的影响-硕士论文

浙江大学农业与生物技术学院 硕士学位论文 根域限制栽培对巨玫瑰葡萄生长及果实品质的影响 姓名：卢彩玉 申请学位级别：硕士 专业：果树学 指导教师：滕元文 20100101 浙江大学硕上学位论文( 2 0 1 0 ) 摘要 巨玫瑰葡萄是以沈阳大粒玫瑰香为母本，以巨峰为父本杂交而成的四倍体品 种。该品种具浓郁玫瑰香味、结果早、丰产、品质好及早熟等特点，现在全国范围内均 有栽培。近年来，该品种在浙江各地得到了迅速的推广，但在江南雨水偏多、光照相对 不足的避雨设施栽培时存在着色较差，品质下降等问题。针对这一问题连续两年对其进 行了根域限制栽培试验。研究根域限制栽培对巨玫瑰葡萄着色及其相关生理、品质组成 成分的影响，以便为该品种在避雨栽培条件下的优质生产提供科学指导。主要结果如下： 根域限制栽培显著降低了巨玫瑰葡萄整个生长季节的光合速率；明显缩短了一年生 枝条第2 节间长度及粗度，抑制了营养生长；使第一花穗节位降低，第3 节位的花穗比 例增多，第5 、6 节位的花穗比例减少，而且明显增加了第二花穗率，对果粒大小和重量 没有显著影响。 始熟期是葡萄栽培中一个非常重要的阶段，果实的很多变化发生在这一时期，例如 果实软化、果皮着色等。本试验结果表明从始熟期开始根域限制栽培可以明显改善果实 着色，增加果皮花青苷、类胡萝卜素、类黄酮和总酚含量，使着色后期叶绿素含量有所 下降。与花青苷合成相关的P A L 酶( 苯丙氨酸解氨酶) 活性也明显升高。 葡萄糖、果糖是巨玫瑰葡萄果实中最主要的两种糖，蔗糖含量不足总糖的5 。A I ( 酸性转化酶) 与葡萄糖积累呈显著正相关( 根域限制r = 0 8 7 1 ，对照r = 0 8 4 2 * O 8 8 2 * ) ，而且也与果糖含量呈显著相关性( 根域限制r = 0 8 3 4 * ，对照r = 0 8 2 7 * ) 。从始 熟期到成熟过程中与其他几种蔗糖代谢酶相比活性均为最高，是另外外两种蔗糖分解酶 N I ( 中性转化酶) 和S S C ( 蔗糖合成酶分解方向) 活性的2 4 倍。与蔗糖合成相关的两 种酶S S S ( 蔗糖合成酶合成方向) 和S P S ( 蔗糖磷酸合成酶) 活性均较低。根域限制栽 培可以显著增加果实中可溶性糖的含量，通过增强A I 活性调节蔗糖代谢是可溶性糖增加 的主要机制。根域限制对果实有机酸含量的影响不明显。另外，根域限制还显著提高了 果皮、果肉和种子中自藜芦醇的含量。 综上所述，根域限制降低了巨玫瑰葡萄的净光合速率，抑制了营养生长，促进了生 殖生长，通过调节影响果皮色泽的各种色素含量，果实品质组成成分及蔗糖代谢，改善 了果实外观及内在品质。 浙江大学硕士学位论文( 2 0 1 0 ) 关键词：根域限制；巨玫瑰葡萄；营养生长；着色；有机酸；可溶性糖；蔗糖代谢 I I I 浙江大学硕士学位论文( 2 0 1 0 ) A b s t r c t J u m e i g u i g r a p ei sat e t r a p l o i dc u l t i v a rd e v e l o p e db yc r o s s i n g S h e n y a n gM e i g u i w i t h K y o h o B e c a u s eo fi t se x c e l l e n tc h a r a c t e r i s t i c ss u c ha Sh a v i n gs t r o n gf r a g r a n c eo fr o s e ， f r u i t i n ge a r l y , h i g hy i e l d ，g o o dq u a l i t ya n dm i d r i p e n i n g ，a n d J u m e i g u i g r a p eh a Sb e e n c u l t i v a t e da l lo v e rC h i n a I nr e c e n ty e a r s ，t h ec u l t i v a rh a sp o p u l a r i z e dt h r o u g h o u tZ h e j i a n g p r o v i n c er a p i d l y H o w e v e r , w h e nc u l t i v a t e du n d e r r a i n s h e l t e rc o n d i t i o n si nt h es o u t ho fC h i n a f r u i to f J u m e i g u i g r a p eu s u a l l yh a v ep o o rc o l o r i n ga n dd e c l i n e dq u a l i t yd u et ot h ee x c e s s i v e r a i n f a l la n da d v e r s el i g h t i n g I no r d e rt os o l v et h e s ep r o b l e m sr o o tr e s t r i c t i o nc u l t i v a t i o nw a s a p p l i e dt o J u r n e i g u i g r a p et oi n v e s t i g a t ei t se f f e c t so nc o l o r i z i n g ，i n t e r i o rq u a l i t ya n dr e l a t e d p h y s i o l o g yo f J u m e i g u i g r a p ei nt w os u c c e s s i v ey e a r s T h ep u r p o s eo f t h i ss t u d yi st op r o v i d e s c i e n t i f i cg u i d a n c ef o rh i g hq u a l i t yp r o d u c t i o nw h e nc u l t i v a t e du n d e rr a i n s h e l t e rc o n d i t i o n s T h em a i nr e s u l t sw e r ea Sf o l l o w s ： R o o tr e s t r i c t i o nc u l t i v a t i o nd e c r e a s e dt h en e tp h o t o s y n t h e t i cr a t es i g n i f i c a n t l yd u r i n g d i f f e r e n td e v e l o p m e n tp h a s e sa n ds h o r t e n e dt h el e n g t ha n dw i d t ho ft h es e c o n di n t e m o d e so f c u r r e n ts h o o t s ；I ta l s or e d u c e dt h ep o s i t i o no fn o d e so c c u r r i n gt h ef i r s ti n f l o r e s c e n c e ，i n c r e a s e d t h ep e r c e n t a g eo ft h e i n f l o r e s c e n c ei nt h et h i r dn o d ea n dt h es e c o n di n f l o r e s c e n c e ss i g n i f i c a n t l y , a n dd e c r e a s e dt h ep e r c e n t a g eo ft h ei n f l o r e s c e n c ei nt h ef i f t ha n ds i x t hn o d e H o w e v e r , t h e r e w a sn os i g n i f i c a n ti m p a c to nt h es i z ea n dw e i g h to fb e r r y T h ev e r a i s o ni sav e r yi m p o r t a n ts t a g ei nv i t i c u l t u r ea n dm a n yc h a n g e so c c u r r e di nt h i s p e r i o d ，s u c ha sb e r r ys o f t e n i n g ，p e e lc o l o r i n ga n ds e c o n dr a p i dg r o w t h T h e r e s u l t si nt h i ss t u d y s h o w e dt h a tt h er o o tr e s t r i c t i o nc o u l di m p r o v eb e r r yc o l o r i n g ，i n c r e a s et h ec o n t e n t so f a n t h o c y a n i n ，c a r o t e n o i d ，f l a v o n o i da n dt o t a lp h e n o l sa n dd e c r e a s ec h l o r o p h y l lc o n t e n ti nt h e b e r r ys k i nd u r i n gt h ev e r a i s o ns t a g e T h ea c t i v i t yo fP A L ( p h e n y l a l a n i n ea m m o n i a l y a s e ) w h i c hi sr e l a t e dt oa n t h o c y a n i ns y n t h e s i sw a sa l s oi n c r e a s e db yr o o tr e s t r i c t i o n G l u c o s ea n df r u c t o s ew e r et w ok i n d so fm o s ti m p o r t a n ts u g a r si n J u m e i g u i b e r r i e s S u c r o s ec o n t e n ta c c o u n t e df o rl e s st h a n5 o ft o t a ls o l u b l es u g a r s A I ( a c i di n v e r t a s e ) w a st h e k e ye n z y m ei ns u g a rm e t a b o l i s mo fg r a p e ，w h i c hp o s i t i v e l yc o r r e l a t e dw i t hc o n t e n to fg l u c o s e ( r = 0 8 7 1 半i nr o o tr e s t r i c t i o n ，r = 0 8 8 2 术一0 8 2 4 水i nc o n t r 0 1 ) a n da l s of r u c t o s e ( r = 0 8 3 4 幸i nr o o t 浙江大学硕= ? 学位论文( 2 0 1 0 ) r e s t r i c t i o na n dr = 0 8 4 2 术i nc o n t r 0 1 ) s i g n i f i c a n t l y A Ih a dt h eh i g h e s ta c t i v i t yf r o mt h eb e g i n n i n g o fv e r a i s o nt om a t u r a t i o nw h o s ea c t i v i t yw a st w i c et of o r t ht i m e st h a na c t i v i t yo fN I ( n e u t r a l i n v e r t a s e ) a n dS S C ( s u c r o s es y n t h a s ec l e a v a g ed i r e c t i o n ) T h ea c t i v i t yo fS S S ( s u c r o s e s y n t h a s es y n t h e t i cd e r i c t i o n ) a n dS P S ( s u c r o s ep h o s p h a t es y n t h a s e ) w a sv e r yl o wd u r i n gt h i s p e r i o d T h e r e f o r e ，t h ei n c r e a s e dc o n t e n to fs o l u b l es u g a r sb yt h er o o tr e s t r i c t i o nc o u l dm a i n l y b ea t t r i b u t e dt oe n h a n c et h ea c t i v i t yo fA I T h e r ew a sn os i g n i f i c a n ti m p a c to ft h er o o t r e s t r i c t i o no nt h ec o n t e n to fo r g a n i ca c i d s I tW a sa l s oi n t e r e s t i n g l yn o t e dt h a tt h er o o t r e s t r i c t i o nc o u l dm a r k e d l yi n c r e a s et h er e s v e r a t r o lc o n t e n ti np e e l ，f l e s ha n ds e e do f J u m e i g u i g r a p eb e r r i e s I ns u m m a r y , t h er o o tr e s t r i c t i o nc o u l dd e c r e a s et h en e tp h o t o s y n t h e t i cr a t e ，i n h i b i tt h e v e g e t a t i v eg r o w t h ，a n dp r o m o t et h er e p r o d u c t i v eg r o w t hi n J u m e i g u i g r a p e I ta l s oi m p r o v e d t h ev i s u a lq u a l i t ya n dr a i s e dt h ei n n e rq u a l i t i e so f J u m e i g u i g r a p eb e r r i e sb yr e g u l a t i n g p i g m e n tc o n t e n t ，c o m p o n e n t so ff r u i tq u a l i t ya n d s u c r o s em e t a b o l i s m K e yw o r d s ：r o o tr e s t r i c t i o n ；J u r n e i g u i g r a p e ；v e g e t a t i v eg r o w t h ；c o l o r i n g ；o r g a n i ca c i d ； s o l u b l es u g a r ；s u c r o s em e t a b o l i s m V 浙江大学硕士学位论文( 2 0 1 0 ) 缩略语 A b b r e v i a t i o n s A IA c i di n v e r t a s e酸性转化酶 B S AB o v i n es e r u ma l b u m i n牛血清白蛋白 C mC e n t i m e t e r厘米 d d a y ( s ) 天 D T T 1 4 - D i t h i o t h r e i t o l 二硫苏糖醇 E D T A e t h y l e n e d i a m i n et e t r a c e t i ca c i d 乙二胺四乙酸 F 6 P F r u c t o s e - - 6 - p h o s p h a t e 6 磷酸果糖 F Wf r e s hw e i g h t鲜重 gg r a m ( s ) 克 G AG a l l i ca c i d没食子酸 g l u G l u c o s e葡萄糖 N 一2 一H y d r o x y e t h y l p i p e r a z i n e - N - 2 一e t h a n e s u l f o n i cN 一( 2 羟乙基) 哌嗪- N 2 H E P E S a c i d乙烷磺酸 H i g hp e r f o r m a n c e 高效液相色谱 H P L C l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y m gM i l l i g r a m 毫克 m LM i l l i l i t e r 毫升 m l n M i n u t e ( s ) 分钟 N IN e u t r a l i n v e r t a s e中性转化酶 P A L P h e n y l a l a n i n ea m m o n i al y a s e 苯丙氨酸解氨酶 P V P P P o l y v i n y l p o l y p y r r o l i d o n e 聚乙烯聚吡咯烷酮 r p m r e v o l u t i o n sp e rm i n u t e转数分 S S e c o n d ( s ) 秒 S P SS u c r o s ep h o s p h a t es y n t h a s e 蔗糖磷酸合成酶 S SS u c r o s es y n t h a s e蔗糖合成酶 S S CS u c r o s es y n t h a s ec l e a v a g ed i r e c t i o n蔗糖合成酶分解方向 S S SS u c r o s es y n t h a s es y n t h e t i cd i r e c t i o n蔗糖合成酶合成方向 U F G T U D P G a l a c t o s e ：f l a v o n o i d - 3 - g l y c o s y l t r a n s f e r a s e 类黄酮半乳糖苷转移酶 u L M i c r o l i t r e微升 V l 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的 研究成果，也不包含为获得逝塑太堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢 意。 学位论文作者签名：卢智 ，五 签字日期：2 酬。年弓月纠日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解盘江太堂有权保留并向国家有关部门或机构送交本 论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权澎婆太堂可以将学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或扫描等复制手 段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 声身必 导师签名： 签字日期： 抄I D 年弓月上1 日 签字日期：年月 日 浙江大学硕士学位论文( 2 0 1 0 ) 致谢 将近三年的时光，转瞬即逝，成功的喜悦，失败的落寞都将成为我永恒的记忆，因 为正是经历了这些，才使我不断成长。在此即将毕业之际，向众多在我的科研道路上给 予我帮助和关怀老师，同学，亲人和朋友表示衷心的感谢! 首先要感谢的是我的导师滕元文教授。本研究及学位论文是在滕老师的悉心指导和 亲切关怀下完成的，他严肃的科学态度，严谨的治学精神，精益求精的工作作风，深深 地感染和激励着我。从课题的选择到最终完成，无不倾注了导师大量的心血。试验期间， 滕老师每次都会从百忙中抽出时间，带我们去德清采样并耐心指导，4 0 多度的高温下， 滕老师与我们一起在田间试验，您头戴遮阳帽，汗如雨下的形象深深的定格在我的脑海 中，您忘我的工作精神，豁达的为人风范一直指引着我前进，即使遇到挫折与困难也不 会放弃。两年多来，滕老师不仅在学业上给我精心的指导，同时还在生活，思想上给我 无微不至的关怀，在此，谨向滕老师致以诚挚的谢意和崇高的敬意! 此外，还要感谢浙江大学果树所许多帮助过我的老师和同学。尤其是贾惠娟老师， 不仅给我很多帮助和建议，而且还冒着大雨亲自陪我到德清葡萄园指导试验。还有朱长 青老师，孙崇德老师，在仪器的操作和数据处理等方面给予的耐心的指导。同时还要感 谢在一起愉快地度过研究生生活的1 6 1 实验室的各位同门一郑小艳、黄春辉、蔡丹英、 俞波、陈露露、刘晶、张东、刘冬峰、胡春云、李国鹏和周泓等同学在试验与生活过程 中无私的帮助，是你们让我在他乡感受到了家庭的温暖。还有德清葡萄研究所的卢如国 经理及工人为试验提供的材料和便利。还要感谢我的室友们在生活中给予的关心和照顾。 最后，更要感谢我亲爱的父母、朋友和男友，是你们默默的支持、理解和关爱我才 能在人生的道路上不断的前进，你们是我奋斗的全部源泉和力量。 在大爱面前，所有的语音都显得苍白无力，但我仍要对那些支持和帮助过我的人真 诚的说一声：谢谢! 声形玉 2 0 0 9 年1 2 月于浙大华家池 浙江大学硕j j 学位论文( 2 0 1 0 ) 第一章 第一章文献综述 葡萄( 1 4 t sL ) 是世界上最主要的水果之一，2 0 0 8 年的总产量已超过6 7 7 x 1 0 7 n 屯 ( F A O s t a t ，2 0 0 8 ) ，主要用于鲜食、酿酒、制汁和制干。鲜食葡萄年产量为2 0 6 x 1 0 7 多吨， 其中亚洲是最主要的鲜食葡萄生产地区，约占总产量的5 5 9 ( O V I ，2 0 0 8 ) 。随着人们 生活水平的提高，消费者对葡萄品质的要求也越来越高。因此如何改善和提高鲜食葡萄 的品质不仅是生产者需要解决的问题，也是摆在葡萄研究工作者面前的重要课题。葡萄 鲜食品质主要包括果粒大小、形状、风味和色泽等，近年来，香味和葡萄果实中的功能 性成分也越来越受到关注。 葡萄果实的发育过程呈双S 曲线，这两个S 曲线被一段滞后阶段分离，共分为三个 时期。第1 期为浆果快速生长期，此时期浆果体积和重量都迅速增加。第1 I 期为浆果缓 慢生长期，此期浆果生长极为缓慢，主要是种皮的硬化和种子储藏养分的积累。第1 I I 期 为浆果第二个快速生长期，自始熟开始浆果变软，褪绿上色，体积和重量继续增加( 许 雪峰等，1 9 9 5 ) 。第三个时期开始常被称为始熟期，法语为v e r a i s o n ，这个时期的主要 特点是果实的软化、着色以及果实内含物的变化。虽然在葡萄果实的整个发育过程中果 粒的大小、形状、色泽及内在成分都会变化，但最主要的变化发生在果实软化阶段，也 就是从始熟期到成熟期，果实从果粒小、坚硬、酸含量高、糖和芳香物质含量低转变为 果粒大、软化、酸含量降低、糖和芳香物质含量增加。这些变化决定了葡萄的品质及经 济价值。 1 1 葡萄果实的外观品质 1 1 1 葡萄花青苷的组成与生物合成 1 1 1 1 花青苷的结构及葡萄主要花青苷的种类 色泽是果实外观品质的重要指标，直接影响到果实的商品价值。果皮的色泽是叶绿 素、类胡萝卜素、类黄酮和花青苷等色素综合表现的结果( L a n c a s t e re ta 1 ，1 9 9 4 ) ，其中 花青苷含量是决定葡萄果实外观品质的重要指标。而且可以阻止食物中蛋白质和油脂的 浙江大学硕士学位论文( 2 0 1 0 ) 第一章 氧化来改善加工食物的营养价值( K o n ge ta 1 ，2 0 0 3 ) ，抗氧化、抗癌、消炎、抗血管增生 等功能而有利于人体健康( N i k k h a he la 1 ，2 0 0 8 ) 。花青苷由花色素和糖苷组成，花色素在 结构上属于黄酮类化合物，是2 一苯基苯并吡喃阳离子的衍生物，以c 6 一c 3 一c 6 为基 本骨架( 图1 1 ) ，在C 3 或( 和) C 5 位结合糖苷成单糖苷或双糖苷( C l i f f o r de ta l ，2 0 0 0 ) 。 花青苷的颜色表现主要由R 1 和R 2 上的取代基决定，而与糖苷的类型和位置无关，但糖 苷可以使花青苷的结构更加稳定。 H O 0 R 4 O H R 2 图1 1 花青苷的基本结构 F i g1 1G e n e r a ls t r u c t u r eo f a n t h o e y a n i n ( M a r j aa n dM a r i n a ，2 0 0 3 ) 不同种类的花青苷在其基本结构的基础上有3 个方面的主要差异：基本花色素骨 架不同：羟基和羟甲基替代物的数量和位置；连接在骨架上的糖的种类、数目和位置； 糖的酰基化程度及与其酰基化的物质种类( C l i f f o r de ta 1 ，2 0 0 0 ) 。在高等植物中最主 要的有以下六种花色素：矢车菊色素( c y a n i d i n ) 、飞燕草色素( d e l p h i n i d i n ) 、芍药色素 ( p e o n i d i n ) 、矮牵牛色素( p e t u n i d i n ) 、锦葵色素( m a t v i d i n ) 和天竺葵色素( p e l a r g o n i d i n ) ( K o n ge t a l ，2 0 0 3 ) 。花色素很少为游离状态，主要以糖苷形式存在，常见的花色素的糖苷 有四种：3 一单糖苷，3 ，5 一双糖苷，3 一双糖苷和3 ，7 一双糖苷，其中3 一单糖苷出现 的机率比3 ，5 一双糖苷高2 5 倍。单糖苷最普遍的是葡萄糖苷( g l u c o s i d e ) ，除此之外也 有半乳糖苷( g a l a c t o s i d e ) 、鼠李糖苷( r h a m n o s i d e ) 和芸香糖苷( m t i n o s i d e ) ( G i l l i ne ta 1 ， 2 0 0 1 ) 。而在欧洲葡萄( 矿v i n i f e r aL ) 中最常见的花色苷是失车菊色素( c y a n i d i n ) 、飞燕 草色素( d e l p h i n i d i n ) 、芍药色素( p e o n i d i n ) 、矮牵牛色素( p e t u n i d i n ) 、锦葵色素( m a l v i d i n ) 在c 3 上与葡萄糖结合成单糖苷，其中一少部分与乙酰基( a c e t y l ) 、p 一香豆酸( p - c o u m a r o y l ) 或咖啡酸( c a f f e o y l ) 衍生物酯化( P o m a re ta 1 ，2 0 0 5 ) ，在欧洲葡萄中含量最多且最稳定 的是锦葵色素3 单葡萄糖苷( M a R i V ie la 1 ，2 0 0 6 ) 。 花青苷的组成主要是由遗传基因决定的，不同葡萄种中花青苷的含量组成不同，颜 浙江大学硕士学位论文( 2 0 1 0 ) 第一章 色特征也差别很大。欧洲葡萄( 矿v i n i f e r a ) 中只含有单糖花色素而没有双糖苷花色素， 最主要的花青苷是锦葵色素一3 单糖苷，主要颜色是紫红色；美洲葡萄( 矿l a b r u s aL ) 主 要颜色是蓝色或黑色，少数为白色或红色，花青苷含有一定量的双糖苷类型，且显著遗 传给后代；圆叶葡萄( 矿r o t u n d i f o l i a ) 果实大多数为黑色，极少数为红色和绿色，花色素 几乎全部为天竺葵色素( D p ) 、矢车菊色素( C y ) 、矮牵牛色素( P t ) 、芍药色素( P n ) 、 锦葵色素( M v ) 的3 ，5 双糖苷，仅有个别株系为3 单糖苷；山葡萄( 矿a m u r e n s i sR u p r ) 中花青苷的种类研究还不够深入，初步确定含有单、双糖苷两种类型，且双糖苷所占比 重较大，以矮牵牛色素为最多( 刘树文等，1 9 9 9 ) 。 1 1 1 2 葡萄花青苷的生物合成途径 花青苷是通过苯丙烷类代谢合成途径由苯基丙氨酸合成，受酶活性和基因表达的调 控( B o s se ta 1 ，1 9 9 6 b ) 。从来源上看花青素的碳原子分别来自苯丙氨酸和乙酸。同位素示 踪揭示了这一生化过程，A 环由三分子乙酸转化而来，B 环和C 环中的2 、3 、4 号碳原 子来自苯丙氨酸。图1 2 是葡萄中主要的几种花青苷的生物合成途径。苯丙氨酸是花青 苷及其他类黄酮生物合成的直接前体，苯丙氨酸解氨酶( P A L ) 是花青苷合成途径中的 第一个酶，它催化苯丙氨酸合成肉桂酸( C i n a m i ca c i d ) ，再在肉桂酸羟化酶( C 4 H ) 催化 下合成对香豆酸( P c o u m a r i ca c i d ) ，这种物质在对香豆酸酰C o A 连接酶( 4 C L ) 的作 用下将C o A 加到对。香豆酸( p - c o u m a r i ca c i d ) 上生成对- 香豆酸一C o A ( p - c o u m a r o y l C o A ) 。 查尔酮合成酶( C H S ) 催化对一香豆酸C o A ( p c o u m a r o y l C o A ) 与三分子的乙酰C o A 合成 查尔酮( C h a l c o n e ) ，它是花青苷合成过程中第一个类黄酮产物。查尔酮( C h a l c o n e ) 在查 尔酮异构酶( C H I ) 的作用下生成黄烷酮( F l a v a n o n e s ) ，这个反应也可以在自然条件下 发生，但是比在有查尔酮异构酶( C H I ) 催化的条件下慢很多( K u h ne t a l ，1 9 7 8 ) 。黄烷酮3 羟化酶( F 3 H ) 使黄烷酮羟基化形成黄烷酮醇( D i h y d r o f l a v o n o l s ) 。二氢黄酮醇还原酶( D F R ) 催化从二氢黄酮醇( D i h y d r o f l a v o n o l s ) 到花青苷( A n t h o c y a n i n s ) 的第一步反应，使黄烷 酮醇( D i h y d r o f l a v o n o l s ) 形成无色矢车菊素和无色飞燕草色素，在无花色素二氧化酶 ( L D O X ) 或花青苷合成酶( A N S ) 作用下分别生成矢车菊素和飞燕草色素，然后在尿苷 二磷酸葡萄糖U F G T 的作用下在C 3 位置上与葡萄糖结合生成矢车菊素3 葡萄糖苷和飞 燕草色素3 葡萄糖苷，R 1 、R 2 位置上可甲基化形成芍药色素、矮牵牛色素、锦葵色素3 葡萄糖苷( B o s se ta 1 ，2 0 0 9 ) ，他们即为葡萄中最主要的五种花青苷，这些花青苷储存 浙江大学硕士学位论文( 2 0 1 0 ) 第一章 在液泡中使葡萄呈现出特有的颜色。 粉H E t i o d i a y 0 1 _ I _ 一 C y 锄i d i n 圈 伽 C 嘲j d l I I 3 - g l u c o s i d c 毒圈 H a r l a g 胁i nc h a l c o m 囤 N a r i n g e n i nf h v a n o n , I | 圈 D i h y d r n k a e m p f e 砝 m P e o n i d i n - 3 g l 埘o s i d , F 3 s H _ I 卜 擎分s l 张 - I 卜 柏 P e t t m i d 靠， $ 1 u c o s l d e 鲢 l t n t a h # r o x , ：f l a 懒 圈 D i h y d r o m y r i c a i n 回 1 正 u c o d e l p h i n i d i n 圈 1 卿物默溯 隗蜥n k l i n 而司 t 。一 蚰 D d 曲i n l d l n - ； g l u c c 炼t d c M a l v i d i t t - 3 g h “o f i d * 图1 2 葡萄果实花青苷生物合成过程简化图( B o s se t a l ，1 9 9 6 a ) P A L 一苯丙氨酸解氨酶；C 4 H 一肉桂酸羟化酶；4 C L 一对香豆酰C o A 连接酶；C H S 一查尔酮合成酶； C H I 一查尔酮异构酶；F 3 H 一黄烷酮3 羟化酶；F 3 H 一类黄酮3 羟化酶；D F R 一二氢黄酮醇还原酶； A N S 一花色素合成酶；U F G T 一尿苷二磷酸葡萄糖：类黄酮一3 D 糖基转移酶 F i g 1 2S i m p l i f i e ds c h e m a t i co ft h ea n t h o c y a n i nb i o s y n t h e t i cp a t h w a y ( B o s se ta l ，l9 9 6 a ) P A L P h e n y l a l a n i n ea m m o n i al y a s e ；C 4 H C i n n a m a t e4 - h y d r o x y l a s e ；4 C L 一4 - C o u m a r a t e ：C o Al i g a s e ； C H S C h a l c o n es y n t h a s e ；C H I C h a l c o n ei s o m e r a s e ；F 3 H F l a v a n o n e3 - h y d r o x y l a s e ；F 3 H F l a v o n o i d 3 - h y d r o x y l a s e ；D F R 。D i h y d r o f l a v o n o lr e d u c t a s e ；A N S 。A n t h o c y a n i d i ns y n t h a s e ；U F G T 。U D P g l u c o s e ： f l a v o n o i d3 - 0 g l y c o s y lt r a n s f e r a s e 4 I 蛳 回椭圆蛐圜一 |，郴。V掣lV。 蚋 粼 泌 浙江大学硕士学位论文( 2 0 1 0 ) 第一章 1 1 3 葡萄花青苷合成的关键酶类及相关基因的表达 正如前文所述P A L ，C 4 H ，C H S ，C H I ，F 3 H ，D F R , A N S ，U F G T 是花青苷合成过程中最 主要的几种酶，其中研究最多的是P A L 、C H S 、U F G T 。这些酶的活性又受到结构基因和 调节基因的控制( H o l t o ne t a l 。，1 9 9 5 ) 。结构基因包括以厶C H S , C 觚F 3 最D F R , L D O X 和 U D P G 等( B o s se ta 1 ，1 9 9 6 c ) ，编码花青苷生物合成途径中所需的酶；调节基因编码的 转录因子调控结构基因的时空表达，目前已经分离出了三类花青苷合成的转录因子： M Y B 蛋白；M Y C 族的b H L H 蛋白；W D 4 0 蛋白( R a m s a ye t a l ，2 0 0 5 ) ，其中M Y B 基因 是控制葡萄果实花青苷合成的主要调节基因，它通过时空表达调节U F G T ，从而使花色 素苷在葡萄发育的不同阶段和不同部位表达( 张传义等，2 0 0 7 ) 。 在花青苷合成过程中，苯丙氨酸解氨酶( P A L ) 是催化合成反应的第一个关键酶。 但这种酶与葡萄果实中花青苷合成的相关性仍没有统一定论，不同学者在不同材料上的 研究结果差异很大。S p a r v o l i 等( 1 9 9 4 ) 认为光照影响葡萄花青苷的形成不是通过P A L 基因表达，而可能是影响了后面基因的表达。但是，对O l y m p i a 葡萄花青苷合成和P A L 活性关系的研究却发现P A L 参与了花青苷的积累，新合成的P A L 同工酶在葡萄果皮花青 苷形成过程中起重要的作用( H i r a t s u k ae ta 1 ，2 0 0 1 ) 。据B o s s 等( 1 9 9 6 b ) 报道，在葡萄 组织中只有果皮合成花青苷，但是P A L 基因在大多数器官中都能表达。这说明，P A L 所 催化的反应并不仅为花青苷合成提供前体，也为其他物质的合成提供前体，因此他认为 只有在个别情况下，P A L 才是花青苷合成的关键酶，这也正是许多学者对于P A L 是否为 花青苷合成过程的关键酶存在争议的原因。 查尔酮合成酶( C H S ) 是合成类黄酮类物质的第一个关键酶，类黄酮类物质与植物 的抗氧化能力有关，因此，C H S 对抗氧化能力有一定影响( T i a ne t a l ，2 0 0 6 ) ，但是对花 青苷合成影响并不大。乙烯利可以促进类黄酮含量的增加，但却不能诱导花青苷的积累， 也没有影响C H S 的活性( J u e ta 1 ，1 9 9 5 ) ，因此不是关键酶。G o t o Y a m a m o t o 等( 2 0 0 2 ) 从赤霞珠葡萄( C a b e r n e tS a u v i g n o n ) 克隆得到了3 个C H S 基因：C h s l 、C h s 2 、C h s 3 ， 比较了它们的结构以及在葡萄果皮和其他组织中m R N A 的积累表达情况。R T P C R 分 析结果显示，C h s 3 主要在红色品种果实着色期的果皮中表达，而C h s l 和C h s 2 不仅在红 色品种的果皮中表达也在叶片和白色葡萄果皮中表达，说明C H S 基因的表达并不总是- 9 花青苷含量相关，所以花青苷合成的基因调控位点不是C H S 。 U F G T 是花青苷合成过程中最后一个酶，它催化不稳定的花色素与糖结合成稳定的 浙江大学硕士学位论文( 2 0 1 0 ) 第一章 花青苷，与花青苷的关系最密切，因而也是研究的热点。B o s s 等( 1 9 9 6 b ) 以黑色果皮葡 萄品种S h i r a z 的不同组织为试材，检测有关花青苷生物合成的几个相关基因的表达情 况，发现U F G T 基因只在果皮上特异表达，而其它的基因在各组织中均有表达，进一步 利用一些芽变，如白色品种的红色芽变或者是黑色品种的白色和紫色芽变，研究发现白 葡萄中不能合成色素的主要原因是U F G T 没有表达，而其它合成类黄酮的基因均可表达， 这说明U F G T 是葡萄果皮着色的关键基因。而且他又用N o r t h e r n 分析在果实发育过程中 花青苷合成相关基因的表达，发现在果实发育早期除了U F G T 外，其它所有基因均高度 表达，之后在果实缓慢生长阶段表达量均降低，果实始熟后所有基因包括U F G T 都受到 协同诱导，而且与葡萄果皮中花青苷的累积相符，这表明U F G T 与花青苷合成途径中的 其它基因有着不同的调节机制( B o s se ta 1 ，1 9 9 6 c ) 。K o b a y a s h i 等( 2 0 0 1 ) 利用白葡萄品 种及其红皮芽变，检验了包括U F G T 基因在内的与花青苷合成相关的几个基因的表达情 况，发现在红皮芽变中这几个基因的表达强度均比白皮品种高，因此推测从白色到红色 的表型的差异是由于控制U F G T 表达的调控基因发生了突变。后来也有学者利用定量 P C R 法( J e o n ge ta 1 ，2 0 0 4 ，C a s t e l l a r i ne ta 1 ，2 0 0 7 a ) 或者微矩阵技术( P i l a t ie ta 1 ，2 0 0 7 ) 研究葡萄果实发育过程中花青苷结构基因表达的水平，均表明U F G T 的表达与葡萄果实 中花青苷的积累相关。 需要指出的是P A L ，C H S 、D F R 和U F G T 都是光调节酶( J ue ta 1 ，1 9 9 5 ) ，都以光敏 色素为光受体，但是这种色素尚未分离出来，调控模式还不清楚，所以对于光敏色素的研 究极为重要。而且果实花青苷的合成途径是一个复杂的、多因素协同作用的过程，仅考 虑单一酶的影响存在局限性，因此注重花青苷代谢途径中的多种酶协同作用将是研究花 青苷合成的重点。 1 1 2 栽培和环境对葡萄花青苷合成的影响 葡萄果皮中的花青苷的含量主要基因控制，但也会受到栽培措施与环境的影响。 1 1 2 1 温度 花青苷合成是一系列酶促反应，与温度有关，温度过高，酶钝化，不利于花青苷的积 累。昼夜温差大，利于碳水化合物的积累，使果实