灰霉AUR1基因的必需性分析.ppt

灰霉AUR1基因的必需性分析,黑曲霉pepB基因缺失菌株的构建,以黑曲霉基因组DNA为模板，用PCR方法分别扩增pepB基因中的上游约1.4kb和下游约1.3kb两段DNA序列，将此两段序列按同一方向分别插入质粒pMW1中潮霉素抗性基因(hph)表达单元的5和3端，构建成重组质粒pMW1pepB，用于通过同源重组靶向破坏基因组中的pepB基因。,1、PCR引物设计和扩增反应,根据pepB全基因序列设计两对引物P1/P2和T1/T2。在P1和P2中分别引入限制性酶切位点Hpa1和Sal1，T1和T2中分别引入限制性酶切位点BamH1和Hpa1。以黑曲霉染色体DNA为模板，使用上述两对引物分别PCR扩增pepB基因中的上游(以后简称为P端)序列与下游(以后简称为T端)序列。,pepB基因阻断质粒的构建,PCR产物P端先用T4DNA聚合酶削平，再用Sal1酶切,载体pMW1先用HindIII酶切，Klenow补平后再用Sal1酶切。将处理后的P端克隆到上述载体，得到pMW1-P。PCR产物T端同样用T4DNA聚合酶削平，克隆到pMW1-P的SmaI位点。获得含pepB阻断基因的pMW1-pepB(图1)，分别用Pst1和EcoR1，Sal1和BamH1双酶切，Hpa1单酶切，均获得与预期相同的酶切片段，证明构建正确。,pepB基因阻断质粒的结构示意图,黑曲霉pepB基因缺失株的筛选及PCR检测,为了通过同源重组构建pepB基因缺失株，以Hpa1酶切Pmw1-pepB阻断质粒，产生4.2kb的线性片段，该片段由pepB基因的P端和T端同源序列片段和插入其间的选择标记hph组成。进而通过原生质体-PEG转化方法将该片段导入黑曲霉在Hgy平板上筛选hph转化子。以转化子基因组DNA为模板，用引物对Phph/PT-out和P3/T3进行PCR检测。,如果4.2kb的线性片段与受体染色体DNA发生同源重组，pepB基因在P端同源序列和T端同源序列之间的203bp染色体DNA将被hph表达单元取代。则以Phph/PT-out为引物的PCR，将得到大小约为1.3kb的特异片段;而以P3/T为引物的PCR检测，将得到大小约为1.8kb的片段(图2)。如果4.2kb线性转化片段随机插入染色体基因组，则pepB基因没有被破坏，以Phph/PT-out引物对各转化子进行PCR检测时就不会有1.3kb特异片段出现或无PCR扩增产物；而以P3/T3引物对各转化子进行PCR检测时，将得到516bp的特异性片段，与出发株相同。,PCR引物设计和扩增反应,根据AUR1全基因序列设计两对引物P1P2和T1T2：P1:CGACCACATATCTGGGTTP2:TACGGTACCAGTATTKpnIT1:CGAATCGATTTACTAClaIT2:GGACCATGGGATCGT,以灰霉染色体DNA为模板，使用上述两对引物分别PCR扩增AUR1基因中的上游(以后简称为P端)序列与下游(以后简称为T端)序列。其中KpnI和ClaI为质粒pTFCM上的单一酶切位点，而在灰霉AUR1中也含有这两个酶切位点。将扩增片段插入到质粒pTFCM的潮霉素抗性表达框的两端，即构建出AUR1基因的缺失载体。,同源重组转化子的检测,以转化子基因组DNA为模板，用引物Phyg：PT-out：进行PCR检测。如果发生同源重组，