间接免疫荧光实验.ppt

间接免疫荧光实验,实验原理,固定在载片上的灵长类肝组织和HEp-2细胞与适当稀释的待检血清反应后,如果待检血清中有ANA,就会与细胞核成分特异结合,加入FITC标记的的羊抗人IgG抗体又可与ANA结合,在荧光显微镜下可见细胞核部位呈现荧光。,试剂与器材,1.抗原片2.荧光标记的二抗3.PBS-Tween缓冲液4.阴、阳性参考血清5.封片介质:磷酸盐缓冲甘油6.盖玻片7.器材:荧光显微镜、摇床、脱色缸、吸管、试管等,生物薄片,生物薄片马赛克：将包被有不同基质的生物薄片固定在一个载片反应区中，可同时检测多种抗不同组织或病原体的抗体。,滴定平板技术：使实验操作标准化,将标本或试剂滴加到加样板反应区上，然后把生物薄片载片盖在加样板的凹槽里，所有生物薄片均与液滴接触，反应同时开始.系统的几何结构决定了液滴的位置和高度.,荧光二抗,荧光素及其激发波长和发射波长,荧光显微镜：,载片,生物薄片,加样板,PBS-Tween,PBS-Tween,甘油/PBS,盖玻片,落射式荧光显微镜不需要额外的聚光镜可产生高对比度的暗视野同时进行明视野、暗视野的抗原基质定位可观察两种不同的荧光可改变荧光的强度,IIF操作步骤,准备：检查加样板是否反应区亲水而周边疏水。从试剂盒中取出载片，等平衡到室温时方可打开包装。注意不要触及生物薄片。用笔编号、标记。稀释：用磷酸盐缓冲液1:100稀释血清。注意：阳性和阴性对照不需稀释，使用前要混匀加样：将加样板放在泡沫板上，按顺序分别滴加25ul稀释后的血清至加样板的反应区中，避免产生气泡。滴加完所有待测标本后才开始温育。第一次温育：将载片覆有生物薄片的一面朝下，盖在加样板的凹槽里，反应立即开始。确保每一个标本均与生物薄片接触，且标本间互不接触。室温温育30分钟。清洗：用磷酸盐缓冲液流水冲洗载片1秒钟（注意水流不要太急，不要直接对着基质冲），然后立即将其浸入装有磷酸盐缓冲液的脱色缸中浸洗5分钟。,加样：滴加20ulFITC标记的羊抗人IgG至洁净加样板的反应区中，完全加完所有的二抗后，方可继续温育。注意：标记的IgG使用前需混匀。第二次温育：从磷酸盐缓冲液中取出一张载片，用吸水纸擦一下背面和边缘后，立即将载片覆有生物薄片的一面朝下，盖在加样板的凹槽里。注意：为防止破坏基质，不要擦拭反应区的间隙。检查生物薄片是否与液滴接触良好，注意避免阳光直射载片。清洗：同上。封片：将盖玻片直接放在泡沫板的凹槽里。滴加10ul封片介质至盖玻片每一反应区。从磷酸盐缓冲液中取出一张载片，用纸擦干背面和四边，注意不要擦拭反应区间隙。将载片覆有生物薄片的一面朝下放在已准备好的盖玻片上，立即查看并轻轻调整使盖玻片嵌入到载片的凹槽里。结果判断：荧光显微镜下观察特异的荧光模型。,以HEp-2细胞为基质检测ANA免疫荧光模式,实验报告阴性：检测系统正常，待测标本在合适的起始稀释度下，实验基质没有明显的荧光染色（与阴性对照在同一水平），或没有可以辨认的荧光模式阳性：检测系统正常，待检标本在合适的起始稀释度下，产生明显高于阴性对照的特异荧光，且有明显可以辨认的荧光模式免疫荧光模式：阳性结果应报告滴度：与相同稀释倍数的阴性血清比较，能观测到特异性荧光反应的最高稀释度，报告滴度利于病情监测,阳性标本经系列稀释后可测出其滴度。最适稀释因子为3.162（10的平方根），这样，每隔一步就出现一个10的整数倍数（1:10、1:32