抗体工程制药.ppt

抗体工程制药,一.概述,抗体(工程)制药生物技术制药领域的重要组成部分,免疫球蛋白的结构,抗体：能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。,抗体的产生过程：机体免疫系统受抗原物质刺激后，B淋巴细胞被激活，增殖和分化为浆细胞，由浆细胞合成和分泌的球蛋白。,免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)分子量范围从150,000到950,000道尔顿。分五类：IgG在血清中含量最高，达7580%,是抗感染的主要抗体;IgM是五类免疫球蛋白中分子量最大的，为五聚体,是对一个抗原作出反应时产生的第一个抗体；IgA在黏膜表面、乳腺、泪腺形成，主要参与局部的免疫反应;IgD在血清中含量很低;IgE在血清含量最少。,免疫球蛋白,IgG,IgM,IgA,IgD,IgE,动物血清中产生抗体的时间示意图,抗原刺激的第一至三周，IgM生成；抗原再刺激后，Ig将取代IgM,抗体研究的发展阶段：以1890年Behring发现白喉抗毒素为代表,用抗原免疫动物来获得多克隆抗体。以1975年Milstein2.免疫动物小鼠(Balb/C,鼠龄6-8周)或大鼠(Lou);,3.常用的骨髓瘤细胞系SP2/0，P3.653细胞，都是次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)的缺乏株。4.免疫方法:体外免疫法；体内免疫法,体内免疫法-颗粒性抗原(如细菌、细胞)的免疫原性强,可不加佐剂,可溶性抗原则按每只小鼠10-100ug抗原与弗氏完全佐剂等量混合后注入腹腔内.弗氏完全佐剂（Freundscompleteadjuvant,FCA）:由矿物油（如降脂烷或液体石蜡等）、乳化剂和灭活的分枝杆菌组成的乳化佐剂。弗氏不完全佐剂不含分枝杆菌,免疫佐剂（adjuvant)（1）定义：先于抗原或同时与抗原混合注射机体可增强抗原的免疫原性的物质。（2）应用弱免疫原性物质；免疫原剂量不足。（3）佐剂种类1)油性乳剂弗氏佐剂（Freundadjuvant）2)无机化合物3)微生物及其产物4)脂质体5)细胞因子,二.细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养1.细胞融合的基本方法(PEG促融)脾细胞骨髓瘤细胞(“永久”细胞)(1108)(23107)聚乙二醇(PEG)37-402mins融合细胞（杂交瘤细胞）用作细胞融合剂的聚乙二醇(PEG)一般选用MW4000，常用浓度为50，pH8.0pH8.2。可加入二甲基亚砜(DMSO)。,2019年12月神舟4号飞船搭载B淋巴细胞和骨髓瘤细胞升空进行细胞融合实验,原理：细胞进行融合时，培养液中只有部分细胞融合成杂种细胞，还有大量未融合的双亲细胞。这就需要选择分离纯化杂种细胞。为此要创造一种只让杂种细胞生长繁殖而亲本细胞死亡的环境。这就要利用杂种细胞和亲本细胞对生长条件的要求和代谢的差异来进行选择。其中最常用的是HAT选择系统。,2、杂交瘤细胞的选择性培养常用的选择培养基为HAT培养基。次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A能阻断DNA合成)、胸腺嘧啶(T)。脾细胞具有次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT),因此脾-瘤融合的杂交瘤细胞可利用HGPRT酶,用次黄嘌呤(H)和胸腺嘧啶(T)合成DNA,使杂交瘤细胞得以生长。,HAT选择培养机制,主要途径糖氨基酸氨甲喋呤（A）次黄嘌呤(H)GMP核苷酸DNAHGPRT核苷酸前体TK(胸苷激酶)胸腺嘧啶核苷(T)dTMP,HAT培养基：H为次黄嘌呤，是HGPRT的底物，为DNA合成提供原料（核苷酸旁路合成原料）A可阻断正常的DNA合成（嘌呤及TMP合成受抑制）T在胸苷激酶（TK）的作用下生成胸腺嘧啶核苷酸，为DNA合成提供原料,含有饲养细胞的24/96孔板内悬浮培养，23天换液一次(HAT的培养液7天内),第714天改用HT培养液（对照阻的骨髓瘤细胞已死亡）14天以后用普通的RPMI1640完全培养液。常用的饲养细胞有小鼠腹腔巨噬细胞、脾细胞和胸腺细胞等。89天可对所有克隆生长孔的培养上清进行抗体检测,筛选出产生抗体的阳性克隆.,培养板,B细胞杂交瘤的技术流程,三.筛选阳性克隆与克隆化1.筛选方法：免疫酶技术放射免疫技术免疫荧光技术,（1）免疫酶技术,原理：将抗原和抗体的免疫反应和酶的催化反应相结合的技术。酶与抗体或抗原结合后，既不改变抗体或抗原的免疫学反应的特异性，也不影响酶本身的酶学活性，在相应而合适的作用底物参与下，使基质水解而呈色，或使供氢体由无色的还原型变为有色的氧化型，从而表明某种抗原或抗体的存在。,（2）免疫荧光技术,原理：将抗原抗体反应的特异性和敏感性与显微示踪的精确性相结合。以荧光素作为标记物，与已知的抗体（或抗原）结合，然后将荧光素标记的抗体或抗原作为标准试剂，用于检测和鉴定抗原或抗体。免疫荧光技术用于细胞抗原的抗体检测,特别是检测患者活检组织标本。,（3）放射免疫技术,原理：将同位素分析的高灵敏度与抗原抗体反应的特异性相结合，以放射性同位素作为示踪物的标记免疫测定方法。放射免疫测定原理示意图,2.克隆化为提高筛选出来的阳性克隆的稳定性，将单个细胞通过无性繁殖而获得细胞集团的整个培养过程。有限稀释法：通过一系列稀释，使每个细胞培养孔平均只含一个细胞，而分离细胞软琼脂法：将杂交瘤细胞悬液分散在半固体营养琼脂糖上，使呈单个细胞定位生长繁殖，以达到克隆化的目的。,四.杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定1.杂交瘤细胞借助染色体分析鉴定多数为端着丝粒染色体,染色体数目接近两种亲本细胞染色体之和。2.抗体鉴定Ig类和亚类鉴定：免疫扩散或ELISA法亲和力鉴定,抗体类别鉴定（Ig类和亚类鉴定）抗体分子因有大小、带电量、溶解度及其与抗原的作用不同，可分为不同的类和亚类。IgG（IgG1、IgG2、IgG3、IgG4）IgA（IgA1、IgA2）IgM（无）IgD（无）IgE（无）,1）免疫扩散,指可溶性抗原与相应抗体在液相中特异结合后，形成的免疫复合物受电解质影响出现的沉淀线现象。单向免疫扩散双向免疫扩散,（2）酶联免疫吸附法(ELISA),原理：先将抗体或抗原包被到某种固相载体表面，再将待检样本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应，用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离的未结合成分，最后加入酶反应底物，根据底物被酶催化产生的颜色及其吸光度(A)值的大小进行定性或定量分析的方法。,ELISA,ELISA,五.单克隆抗体的工业化生产单克隆抗体的生产包括细胞培养、提纯和制剂等工艺过程。1.杂交瘤细胞的大规模培养生物反应器：气升式发酵罐，中空纤维培养罐，微囊发酵罐培养基：牛淋巴液，血清,2.单克隆抗体的大量制备的方法体外培养法(收获10-400ug/ml抗体)酶标板上培养微载体悬浮培养（固体颗粒用DEAE-SephadexA50等材料）。动物体内诱生法用0.5ml降脂烷/液体石蜡注入腹腔,然后注射1106杂交瘤细胞，再收获52Omg/ml抗体。,支原体污染！,3.单克隆抗体(McAb)的纯化,纯化单克隆抗体流程(大鼠),单抗纯化方法:超滤法盐析法离子交换法凝胶过滤法HPLC法等,三.单克隆抗体药物的现状,250多种抗体类药物在临床试验中1/3已进入三期临床1/4已通过临床III期试验美国市场上有13种治疗用的抗体药物抗体药物的销售额97-99年由4.68亿美元增长到13亿美元03年抗体类药物总销售额达到50亿美元,抗体药物市场销售额,2019,全球有超过200家上市或未上市公司正在研发用于临床诊断和治疗的单克隆抗体正在进行临床试验的抗体公司（38家）：,AbgenixAlexionPharmAltarexAppliedMolecularEvolutionBASFBiogenBioTransplantCAT(CambridgeAbTech)CelltechCenteonCentocor(Johnson在具备亲本单抗可变区的cDNA克隆时，可用定点突变法在其两端造成适当的内切酶位点，与人工合成的连接肽编码序列连接，组装到表达载体中;如果从杂交瘤细胞系构建单链抗体，可用PCR方法扩增可变区基因，再组装到适当的表达载体上。,单链抗体最常用的表达体系是大肠杆菌，有2种方式:一是表达为包涵或非包涵体的不溶蛋白。产量高，可达细菌蛋白总量的5%-20%，但需进行变性复性，使其形成正确的立体结构，恢复抗体活性;二是分泌型表达，将细菌的信号肽序列与单链抗体的氨基端相连，单链抗体分子就可分泌到质周腔和细菌体外，进行折叠后成为有活性的分子。但产量不及前者，一般实验室培养条件下每升细菌的产量仅在数毫克左右。,即为VH，约为完整分子的1/12。它只由一个结构域构成，故称单域抗体。单域抗体尽管亲和力有所降低，但仍保持着原单抗的特异性。,(3)单域抗体,VH,约为完整分子的1/80-1/70大小，一般由一个CDR构成，它也保持着抗体的特异性。,(4)最小识别单位,CDR,4双特异抗体和多价抗体,双链抗体（Diabody）一词最早由Hollinger等于1993年提出。乃是一种小分子的双价双特异性抗体片段。,双特异性抗体(bispecificantibody,BSAb)是指能同时识别2种抗原的抗体。1种为对应肿瘤相关抗原。另1种为对应效应成分。即能结合靶肿瘤细胞又能结合高细胞毒性的效应细胞,将效应细胞富集在肿瘤周围,而且可以模拟天然配体的作用,与细胞表面引发分子结合,激活效应细胞,实现对肿瘤细胞的杀伤和裂解。,抗体的一部分被非抗体序列替代，所形成的融合蛋白具有新的特性,称之为抗体融合蛋白。根据构建方式，抗体融合蛋白主要分两种形式：Fc融合蛋白（Fcfusionprotein,FcFP）抗原结合融合蛋白（antigen-Bindingfusionprotein,ABFP）,抗体融合蛋白,Fc融合蛋白由抗体的Fc段与某些具有特定功能的蛋白结构域融合而成。如CD4免疫粘附素（immunoadhesin）就是由抗体的Fc段与2个CD4分子的Ig同源区重组而成。抗原结合融合蛋白由具有抗原结合功能的抗体结构与其他功能性蛋白融合构成。如免疫毒素，抗体部分主要包括嵌合抗体、单链抗体形式。,抗体融合蛋白,一、免疫粘附素定义将人抗体恒定区(主要是Fc段)N-端连接于人细胞表面的受体分子或细胞粘附分子上，在真核细胞中表达出正确折叠的融合抗体蛋白分子，这种分子可同时发挥抗体的效应功能及其它相应的效应功能，这种分子被称为免疫粘附素(immunoadhension)或新效能抗体。,二、免疫毒素免疫毒素又称生物导弹，是由导向性的载体分子与具有毒性的弹头蛋白交联而制成，属于导向药物的一种。,三、催化抗体天然抗体体现的是结合活性，而酶发挥的是催化活性。如何把这两者的特点集为一体，从而使抗体也能成为具有催化活性的物质，同时也能使酶与有关的抗原结合。即催化抗体(catalyticantibody)催化抗体的构建主要是把具有催化作用的基团与抗体分子进行重组。,噬菌体抗体,噬菌体抗体库(phageantibodylibrary)技术定义：通过PCR将全套人抗体重链和轻链V区基因克隆出来，并在噬菌体表面表达、分泌，经筛选后获得特异性抗体。,噬菌体表面展示文库技术的要点:,外源基因表达多肽以融合蛋白形式展示在外壳蛋白N端,将基因组合文库插入噬菌体编码膜蛋白的基因g3或g8的先导系列的紧靠下游,随机克隆入相应载体形成组合文库,从免疫或未被免疫的B细胞中PCR扩增抗体全套基因片段,用固相化抗原经“亲和结合一洗脱一扩增”数个循环直接、方便、简捷、高效地筛选出表达特异性好、亲和力强的抗体噬菌体库。,使翻译出的抗体分泌到细菌的周质腔内，形成游离的抗体片段，经过纯化即可获得目的抗体。,筛选到的噬菌体再将基因g3或g8切除后，转入大肠杆菌，,该项技术的优点:将抗体的基因型和表型紧密联系起来;可绕过杂交瘤技术，不需要复杂的基因工程技术;抗体基因筛选的范围广;技术稳定、可靠、生产周期短;可规模化生产;适用范围广，既可用于抗体制备，也适用于其它蛋白如激素、酶、药物、随机多肽等的生产。不经过细胞融合及动物免疫等步骤,噬菌体抗体库的分类（一）按抗体基因的性质分1.DNA文库2.cDNA文库（二）按抗体基因的来源分1天然抗体库(nativeantibodylibrary)2免疫抗体库3半合成抗体库4全合成抗体库,用SCID小鼠制备人单抗,SCID小鼠,移植入人淋巴细胞（人鼠嵌合模型）,抗原免疫,杂交瘤技术,基因工程,人单抗,人抗体鼠将小鼠Ig基因灭活，然后转入人Ig基因，生产出人单抗,遗传工程鼠,基因工程抗体真核细胞高效表达流程图,单抗研发的演变历程,鼠单抗100%鼠源OKT-3PanorexZevalin,鼠/人崁合单抗(66-75%人源)ReoPro,RituxanRemicadeSimulect,人源化单抗(90-95%人源)Zenapax,Mylotarg,Herceptin,CampathSynagis,100%人源,抗体在体外人源化存在的问题,操作过程复杂需付出昂贵的代价抗体的亲和力降低抗体不是人体免疫系统天然产生异源抗体与免疫系统的配合,最理想的单克隆抗体,100%人源人类免疫系统自然产生,全人抗体的理论基础,癌症细胞、病毒、细菌对人机体而言均为异己物人体不断受异己物攻击，但免疫系统通常有清除能力免疫系统通过体液免疫和细胞免疫对异己物做出反应体液免疫就是针对异己物天然地产生抗体,全人抗体面临的关键问题,持续分泌抗体的人B细胞抗体分泌细胞的保持,30年来的全人抗体的尝试,鼠骨髓瘤不适合与人B细胞融合-稳定性差-抗体产量低非洲淋巴细胞瘤病毒(EBV)保存抗体分泌细胞-细胞株不稳定-抗体的产量低-不能特异性地保存抗体分泌细胞很难获得人类骨髓瘤细胞株,全人抗体技术的最新突破,成功建立人骨髓瘤细胞系，人源抗体的研究进入新的里程用途：能稳定的保持人B细胞分泌抗体的能力发明人：英国剑桥大学的Dr.Karpas教授意义：1在整体水平上研究人类产生的抗体2开创人类抗体基因组学的研究评价：诺贝尔奖得主Dr.Milstein推荐发表在PNAS，世界权威杂志“科学”发表了新闻评述，剑桥大学开了新闻发布会,人人杂交瘤技术,开发针对未知抗原的全人治疗用抗体的唯一技术分离、保存稳定分泌天然抗体的B细胞先进方法。寻找新型肿瘤相关抗原的捷径,人人杂交瘤技术的优势,（1）迅速高效的生产天然人类单克隆抗体抗原选定和抗体产生都由人类免疫系统完成，不会引起自身免疫反应，与人体免疫系统配合良好能获得最佳亲和力和中和活性的抗体更合理的自然选择药物设计方式加速抗原的发现和抗体的开发过程,人人杂交瘤技术的优势,（2）简便、低费用的抗原抗体研究生产方式与其他抗体改良技术相比操作更简便起始抗体分泌水平较高，可直接用于工业规模生产避免了改良技术引起的抗体失活无需发现抗原和对抗原进行功能确定,人人杂交瘤技术的优势,（3）唯一研究全人抗体图谱的技术。确定人类免疫识别系统，确定人类免疫系统在不同的生理、病理以及发育条件下得到的抗体图谱。（4）研究癌症免疫学和抗原基因组的最新技术。寻找人类癌症抗原，将找到的抗原作为癌症疫苗和抗体药物开发的靶