PCR技术及注意事项.ppt

,PCR技术应用及注意事项,威斯腾生物技术中心TEL：40067567582014.9.1,PCR:聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术。1971Khorana等最早提出核酸体外扩增的设想；1983年Mullis发明并申请专利。,背景,根据DNA的半保留复制。,原理,双链DNA单链复制两分子拷贝。在体外实验中，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。,缓冲液4种dNTP混合物（终浓度）引物（终浓度）模板DNATaqDNA聚合酶（耐热DNA聚合酶-Taq酶的发现对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本。）Mg2+（终浓度）双蒸水,反应体系,变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成。模板DNA的变性：模板DNA经加热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板-引物结合物在72、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环变性-退火-延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。,步骤,RT-PCR：首先提起RNA，然后用逆转录酶与mRNA为模板进行cDNA第一链的合成，然后的原理和PCR就一样了！RT-PCR是个半定量的实验，可以确定在mRNA水平的表达差异。免疫PCR(immunopolymerasechainreaction,IPCR）原理：是用一段已知DNA分子标记抗体作为探针,用此探针与待测抗原反应,PCR扩增粘附在抗原抗体复合物上的这段DNA分子,电泳定性,根据特异性PCR产物的有无,来判断待测抗原是否存在。巢式PCR：是用内外两对引物扩增拷贝数较低的片段。先用外引物进行第一轮反应,将产物适当的稀释,然后用内引物继续扩增.比较适合微量DNA或者石蜡组织抽提的DNA。,分类,原位PCR技术：原位PCR就是在组织细胞里进行PCR反应，它结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PCR技术的优点，是细胞学科研与临床诊断领域里的一项有较大潜力的新技术.。实时荧光PCR：利用荧光来检测PCR产物，PCR每循环一次就收集一个数据，通过实时扩增曲线，准确确定CT值，从而确定DNA拷贝数。除此之外，还有锚定PCR、反向PCR、不对称PCR、长距离PCR、降落伞PCR、梯度PCR等30几种PCR。,分类,模板：避免污染，提高质量，浓度适宜（25-100ng）。浓度过高增加非特异性；浓度过低会降低扩增效率，使PCR产物量少。,注意事项,引物：设计得当，特异性高。长度：15-30bp碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。引物3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。尤其避免错配！引物量：每条引物的浓度0.11umol或10100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。必要时，引物上可以加入合适的酶切位点，有利于分子克隆。,dNTP：多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50200umol/L，浓度过低会降低PCR产物的产量。尤其是注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。,Taq酶：扩增产物随酶用量的增加，呈增多的趋势。浓度在10-15U效果较好。若太高，则降低扩增的特异性；若太低，则会影响PCR扩增反应。,Mg2+：作用是1.促进polymerase的活性；2.核苷酸进入聚合酶的活性中心也需要镁离子来消除dna骨架上磷酸基团的负电荷。浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。,温度：变性温度：达不到变性温度就不会产生单链DNA模板，PCR也就不会启动。变性温度低则变性不完全，DNA双链会很快复性，因而减少产量。一般取9095。样品一旦到达此温度宜迅速冷却到退火温度。DNA变性只需要几秒种，时间过久没有必要；反之，在高温时间应尽量缩短，以保持TaqDNA聚合酶的活力，加入TaqDNA聚合酶后最高变性温度不宜超过95。退火温度：温度高特异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合，DNA扩增效率下降；温度低产量高，但过低可造成引物与模板错配，非特异性产物增加。一般先由37反应条件开始，设置一系列对照反应，以确定某一特定反应的最适退火温度。延伸温度：引物延伸温度温度的选择取决于TaqDNA聚合酶的最适温度。一般取7075，在72时酶催化核苷酸的标准速率可达35100个核苷酸/秒。每分钟可延伸1kb的长度，其速度取决于缓冲溶液的组成、pH值、盐浓度与DNA模板的性质。,循环数：循环数过少，PCR产物得率低；循环数过多，增加非特异性。循环次数常规PCR一般为2540个周期。在保证产物得率前提下，应尽量减少循环次数。,Real-timeQuantitativePCRDetectingSystem,QPCR,实时检测（在对数扩增时期）而不是终点检测敏感性高需要样品少特异性高（Taqman）精确定量,Real-timeqPCR和常规PCR的区别,基线（BaseLine）：指在PCR扩增反应的最初几个循环里，荧光信号变化不大，接近于一条直线。这样的直线，即是基线。荧光域值（threshold）：一般是指PCR反应的前15个循环的荧光信号，这是作为荧光本底信号。荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。设定在PCR扩增的指数期。Ct值：是指每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。Ct值与起始模板的关系：研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。扩增曲线：在PCR过程中，以循环数为横坐标，实时荧光信号强度为纵坐标所做的曲线。,该技术以美国ABI公司为代表。PCR扩增时，在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针。该探针为一直线型的寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，PCR仪检测不到荧光信号；PCR扩增时（在延伸阶段），Taq酶的53外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，这也是定量的基础所在。,Taqman技术：,TaqMan引物、探针设计：首先选择探针序列探针的Tm值为6870度，长度不应超过30碱基探针的5端不应是G，G有可能会淬灭荧光素引物应尽量靠近探针，扩增片断不超过400bp，通常为80150bp引物的Tm值为5960度，长度约20碱基避免引物、探针之间的二级结构,该技术以美国人Tagyi为代表。也是加入了荧光探针，但它是环状的寡核苷酸探针，分别由茎部和环部组成，两端分别标记荧光报告基团和荧光猝灭基团，在无靶序列的情况下，探针始终是环状，报告基团的荧光被猝灭基团猝灭，使荧光检测仪检测不到荧光信号；而在有靶序列时，即在PCR的退火阶段探针与靶序列结合，使荧光报告基团和猝灭基团分开，这样荧光仪可以检测到荧光，荧光信号的强弱代表了靶序列的多少。,Beacon技术：,上两种方法特异性强，但是成本较高，探针设计要求较高。,SYBRGreen是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料，与双链DNA结合后，其荧光大大增强。,SYBRGreen,从实验成本来讲，SybrGreen是最好的，基本上就是普通PCR加上SybrGreenI荧光染料即可，其信号强度也很好，还可以进行融解曲线分析等，但缺点是只能在一个反应管内进行一种PCR反应的检测，另一个问题是非特异性扩增会影响实验结果，当然也有一些技术解决这些问题。对于研究人员来讲，如果需要检测的基因很多，而每个反应管中进行一种PCR反应的检测可以满足实验要求，则SybrGreen是最好的选择。,溶解曲线分析可以用来确定不同的反应产物，包括非特异性产物。扩增反应完成后，通过逐渐增加温度同时监测每一步的荧光信号来产生溶解曲线，随着反应中双链DNA变性，荧光染料又回复到游离状态导致荧光信号降低，用荧光信号改变的负的一次导数与温度作图，在扩增产物的溶解温度上有一特征峰（Tm，DNA双链解链50的温度），用这个特征峰就可以将特异产物与其它产物如引物二聚体区分开，因为它们在不同的温度溶解.这个一般是用SYBYGreen作为荧光染料的时候需要做的工作！,溶解曲线,1.无Ct值出现检测荧光信号的步骤有误:一般SG法采用72延伸时采集，Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。引物或探针降解:可通过PAGE电泳检测其完整性。模板量不足:对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。模板降解:避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。,QPCR常见问题分析,2.Ct值出现过晚（Ct38）扩增效率低:反应条件不够优化。设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。PCR产物太长:一般采用80-150bp的产物长度。,QPCR常见问题分析,3.标准曲线线性关系不佳加样存在误差:使得标准品不呈梯度。标准品出现降解:应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。引物或探针不佳:重新设计更好的引物和探针。模板中存在抑制物，或模板浓度过高。,QPCR常见问题分析,4.负对照有信号引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix试剂盒。模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。,QPCR常见问题分析,5.溶解曲线不止一个主峰引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix试剂盒。模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组D