等电点电泳 原理 步骤 详细.ppt

,李莉,等电聚焦电泳IsoelectricFocusingElectrophoresis，IEFE,上海交通大学医学院,讲课内容,上海交通大学医学院,一、IEFE定义,IEFE一种利用具有pH梯度的支持介质分离等电点（isoelectricpoint，pI)不同的蛋白质的电泳技术。Isoelectricfocusing(IEF),isatechniqueforseparatingdifferentmoleculesbytheirelectricchargedifferences.,上海交通大学医学院,等电聚焦(Isoelectricfocusing,IEF)就是在电泳介质中放入载体两性电解质(Carrierampholyte)，当通以直流电时，两性电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加的pH梯度，在此体系中，不同的蛋白质即移动到或聚焦于其相当的等电点位置上，也就是说被聚焦于一个狭的区带中，电泳技术中的等电点聚焦也称为聚焦电泳。,上海交通大学医学院,讲课内容,上海交通大学医学院,二、IEFE的特点,（一）优点HighResolutionHighSensitivityGoodReproduction,上海交通大学医学院,（二）缺点1.要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋白质可能发生沉淀。2.样品中的成分必须停留在其pI，不适用在pI不溶或发生变性的蛋白质。,上海交通大学医学院,分辨率(resolution)较不连续PAGE更高，特别适合于分离分子量(molecuarweight,MW)相同而电荷(electriccharge)不同的生物大分子。,QM=6r,上海交通大学医学院,讲课内容,上海交通大学医学院,三、IEFE的基本原理,上海交通大学医学院,蛋白质分子在不同pH下的解离状态,NH3+NH3+NH2PPPCOOHCOO-COO-pHpIpHpIpHpI,上海交通大学医学院,在电泳介质中放入载体两性电解质(carrierampholytes)，当通入直流电时，两性电解质形成一个由正极(anode)到负极(cathode)逐渐增加的pH梯度，正极附近是低pH区，负极附近是高pH区。,上海交通大学医学院,蛋白质分子的电聚焦过程,+pI1pI2pH=pIpI3pIn-abc蛋白质分子在负极端蛋白质分子在正极端蛋白质样品中各组分聚焦成区带,+,上海交通大学医学院,在这个从正极到负极pH逐渐增加的直流电场中，当蛋白质进入这个环境，不同的蛋白质带上不同性质和数量的电荷，向着一定方向移动，迁移到与其相同的等电点位置上停留下来，即被聚焦于一个狭的区带中，得以分离。TheproteinsbecomefocusedintosharpstationarybandswitheachproteinpositionedatapointinthepHgradientcorrespondingtoitspI.,上海交通大学医学院,上海交通大学医学院,进行IEFE必须具备3个条件：,有一个在电泳条件下基本稳定、重复性良好的pH梯度有一个抗对流的电泳材料，使已经分离的样品不再重新混合电泳后有适当的方法来鉴定分离的区带,上海交通大学医学院,（一）pH梯度的建立,用多种两性电解质(ampholytes)混合物建立稳定良好的pH梯度,上海交通大学医学院,1.理想的载体两性电解质（Carrierampholytes）应具备的特征：,分子量要小，以便与被分离大分子物质分离；化学性质稳定；各成分的pI彼此接近，并在其pI值附近有良好的缓冲能力；在pI处具有足够的电导，导电性均匀；两性电解质载体的数目要足够多；可溶性好；对280nm的紫外光没有或仅有很低的吸光度，不干扰样品的测定。,上海交通大学医学院,2.载体两性电解质的合成,本质：一系列脂肪族(aliphaticampholytes)多氨基多羧酸同系物和异构体，具有很多既不相同又十分接近相互连接的pI值。pH范围：pH310,丙烯酸+多乙烯多胺Ampholine（LKB）,加成反应,上海交通大学医学院,上海交通大学医学院,3.pH梯度的形成,载体两性电解质(Carrierampholytes)是一系列不同分子的两性电解质的混合物,在通电后，它们各自迁移到适当位置形成一个连续的pH梯度(pHgradient)。,上海交通大学医学院,没通电时的变化所有的载体两性电解质(Carrierampholytes)分子都荷电，只是溶液中荷正电和荷负电的基团数目相等，净电荷(netcharge)为零。,上海交通大学医学院,引入电场时的变化载体两性电解质(carrierampholytes)分子将向阴极(cathode)或阳极(anode)迁移，带有最低等电点的分子（荷最多的负电）将最快地向阳极迁移。当它达到净电荷是零的位置时才停止。其次一些低pI的载体两性电解质分子（荷其次多的负电）也将向阳极移动，直到它的净电荷被减少到零才停止。,上海交通大学医学院,电泳结束后的变化所有的载体两性电解质(carrierampholytes)分子以增加pI级数的办法将分别在阳、阴极之间到达它们自己的位置而给出一个pI梯度。,上海交通大学医学院,上海交通大学医学院,电解槽中，通电后，正负两极都会发生电极反应：正极端反应：6H2OO2+4H3O+4e-负极端反应：4H2O+4e-2H2+4OH-在负极引起pH值的升高，在正极pH下降，另外在电极槽的正极端放的是酸性溶液，负极端放的是碱性溶液造成了在电极附近pH的急剧变化,上海交通大学医学院,由于载体两性电解质(carrierampholytes)是一系列不同分子的两性电解质的混合物所组成的，设其中某一成分为A，它的pI=pH，当环境中的pHpH时，它带负电荷，朝正极移动。,上海交通大学医学院,当环境pHpH时，它带正电荷，朝负极移动，直至移动到它的等电点处，在那里聚集。由于两性电解质A在它的pI处具有一定的缓冲能力，因此在它附近形成一个pH稳定区域。,上海交通大学医学院,同样载体两性电解质(carrierampholytes)中各种两性电解质也会各自迁移到它们的等电点(isoelectricpoint,pI)处，由于它们的数量足够多，各自的等电点相差很小，从而形成一个pH梯度。,上海交通大学医学院,上海交通大学医学院,上海交通大学医学院,（二）支持介质(medium)的选择,作用：防止扩散抗对流liquidmedium：蔗糖、Ficollgelmedium：agarose、sephadex、PAG,上海交通大学医学院,（三）聚焦后的检测方法,各种染色法扫描与定量其它检测方法,上海交通大学医学院,讲课内容,上海交通大学医学院,四、IEFE的应用ApplicationsofIEF,1.分析分离制备蛋白质、多肽区分人血清蛋白测出异常免疫球蛋白基因分型csf中寡克隆区带的检测2.测定pI可鉴定蛋白质、多肽3.双相电泳中，IEF作为第一相,上海交通大学医学院,双向电泳（two-dimensionalelectrophoresis,2-DE）,上海交通大学医学院,考马斯亮蓝,银染,上海交通大学医学院,讲课内容,上海交通大学医学院,实验血红蛋白的等电聚焦电泳,Hb具有四条多肽链（、）,上海交通大学医学院,HbA正常成人血中主要的Hb成分。HbA2正常成人Hb中的一个次要成分，当胎儿出生时，其浓度不到1%，以后稍增多，在正常成人中其平均值自2.2%至2.6%左右，最高范围一般不超过3.5%。,上海交通大学医学院,HbF1866年发现，是胎儿和初生儿的Hb的主要成分，足月的初生婴儿血中大约有70-80%为HbF，其余为HbA。婴儿出生后不久，HbF的浓度迅速减少，同时HbA相应增多，绝大多数正常人于出生后6个月至2年后，HbF便降至成人的正常浓度，以后HbF一直存在。,上海交通大学医学院,器材,电泳仪凝胶玻管三角烧杯10cm长针头,上海交通大学医学院,试剂,Acr-BisTEMED、APAmpholine电极缓冲液（5%H3PO4、2%NaOH）,上海交通大学医学院,