园艺植物育种学09生物技术育种 (PPTminimizer)

第九章生物技术育种,主要学习内容生物技术的概念和内容组织与器官培养在植物育种中的应用植物原生质体培养与体细胞杂交植物基因工程在育种中的应用分子标记辅助育种,一生物技术的概念和内容,1生物技术的概念以生命科学为基础，利用生物体系和工程原理，生产生物制品和创造具有特定性状的新品系或新物种的科学技术。,一生物技术的概念和内容,2生物技术的内容基因工程染色体工程细胞工程蛋白质工程酶工程发酵工程生化工程,一生物技术的概念和内容,3生物技术在植物育种中应用的重要意义生物技术应用于植物育种，可以解决传统育种的一些特殊困难，扩大育种的基因来源，提高鉴定和选择的可靠性，加快育种进程，加速繁殖，提高育种效率等，对于解决新世纪人口与食物问题，以及生物能源问题，具有十分重要意义。,二组织与器官培养在植物育种中的应用,1组织与器官培养的相关概念1.1组织与器官培养指在无菌条件下，将植物的离体组织、器官、细胞或原生质体在人工配制的培养基上进行培养，使其长成完整的植株。1.2外植体在植物组织培养中，用于培养的各种植物组织、器官和细胞等，称为外植体。1.3继代培养由最初培养的新增殖的组织，继续转入新的培养基的过程称继代培养。,1.4无性繁殖系同一外植体反复进行继代培养后，所得的一系列无性繁殖后代称为无性繁殖系。1.5愈伤组织从植物各种器官、组织的外植体增殖而形成的一种无特定结构和功能的细胞团称愈伤组织。1.6胚状体由外植体或愈伤组织产生的与正常受精卵发育方式类似的胚胎结构体称为胚状体。,二组织与器官培养在植物育种中的应用,二组织与器官培养在植物育种中的应用,外植体,继代培养,二组织与器官培养在植物育种中的应用,愈伤组织,胚状体,二组织与器官培养在植物育种中的应用,二组织与器官培养在植物育种中的应用,二组织与器官培养在植物育种中的应用,2植物组织与器官培养的类型及其应用,2.1茎尖与分生组织培养切取从十到数十微米的茎尖分生组织或更大的芽培养成完整的植株称为茎尖培养。,二组织与器官培养在植物育种中的应用,无菌条件下、在体视显微镜下用解剖刀切取项端分生组织及其下方的13个幼叶原基。要求操作速度快，操作熟练，避免茎尖长时间暴露在空气中失水而死亡。应用：研究枝条的发育和花的形态形成；广泛应用于无病毒植物的培养。,二组织与器官培养在植物育种中的应用,二组织与器官培养在植物育种中的应用,2.2花粉、花药、胚珠和子房培养花粉、花药、胚珠和子房在离体条件下无菌培养，让其进一步发育以至形成幼苗的过程。根据胚珠和子房受精与否分为两类：受精子房和胚珠的培养主要是打破种子的休眠和挽救胚的发育。未受精子房、胚珠及花粉、花药的培养主要为了获得单倍体。,二组织与器官培养在植物育种中的应用,2.3离体受精离体受精也称为植物体外受精，是在人工条件下使卵细胞受精形成合子，再将形成的合子离体培养使之发育成植株的过程。离体受精主要解决远缘杂交不亲和、不孕和不结实。,二组织与器官培养在植物育种中的应用,离体受精程序：花粉和子房（或胚珠）的收集通常是把开花前一天的花蕾取下，经表面消毒，取雄蕊收集花粉，剥出胚珠培养。离体授粉和受精有两种方法用于花粉与卵细胞的体外受精：共培养法：先将花粉撒于一个适宜于花粉萌发的培养基上，再将胚珠置于撒播的花粉中间。,二组织与器官培养在植物育种中的应用,人工受精法：将花粉撒在离体的子房或胚珠上，让其受精。受精后的子房或胚珠继续培养可发育成成熟的种子。2.4离体胚的培养植物的胚培养主要有两种培养方式：一种是以幼胚为外植体诱导愈伤组织細胞，通过器官发生或胚胎发生产生再生植株；另一种是使发育完全的胚直接萌发，获得完整的植株。,二组织与器官培养在植物育种中的应用,应用：克服远缘杂交不育促进核果类植物胚的形成如早熟桃因果实发育时间短，种胚发育不全，可以利用胚培养，使发育不良的种胚发芽。打破种子的休眠期许多植物的种子存在明显的休眠期，有些植物的休眠期很长。由于种子结构而存在的休眠可以用常规方法消除，而由于胚乳抑制物质所引起的休眠只能通过胚的离体培养才能获得理想的效果。,二组织与器官培养在植物育种中的应用,2.5叶、茎段等培养应用：良种的快速繁殖。自交不亲和系、雄性不育系的无性繁殖。突变体的诱导与分离。转基因的材料。,二组织与器官培养在植物育种中的应用,3组织与器官培养的基本条件3.1培养基成分3.1.1、无机成分大量元素：N、P、K、C、H、O、Ca、S、Mg。微量元素：Cu、B、Mn、Zn、Mo、Fe。,二组织与器官培养在植物育种中的应用,3.2.2有机成分糖类：蔗糖、葡萄糖。维生素：VB1、VB6、肌醇。氨基酸生长调节剂生长素类：IAA，NAA，IBA，2，4-D在组织培养中，生长素主要被用于诱导愈伤组织形成，诱导根的分化和促进细胞分裂、伸长生长。,二组织与器官培养在植物育种中的应用,细胞分裂素：6-BA，KT，ZT在培养基中添加细胞分裂素有三个作用：诱导芽的分化促进侧芽萌发生长。促进细胞分裂与扩大。抑制根的分化。因此，细胞分裂素多用于诱导不定芽的分化和茎、苗的增殖，而在生根培养时使用较少或用量较低。植物提取物琼脂,二组织与器官培养在植物育种中的应用,4培养环境条件温度：一般24-25左右光照：一般16h，2000Lux培养环境：无菌PH条件：因培养基而异,二组织与器官培养在植物育种中的应用,5基本设施设备5.1基本设施准备室培养基配制及消毒室。接种室培养室温室,二组织与器官培养在植物育种中的应用,二组织与器官培养在植物育种中的应用,5.2基本设备衡器与量具玻璃器皿显微镜、解剖镜灭菌锅超净工作台培养架空调日光灯,二组织与器官培养在植物育种中的应用,三植物原生质体培养与体细胞杂交,1原生质体培养1.1概念原生质体:用酶法处理去掉植物细胞壁并有生活力的裸细胞。植物原生质体培养:指将植物细胞去壁后，放在无菌条件下，使其进一步生长发育成为完整植株的技术。,三植物原生质体培养与体细胞杂交,1.2原生质体培养的意义由于无细胞壁，原生质体为作物遗传改良和植物学研究提供了有利的实验材料：1.2.1用于细胞杂交改良作物1.2.2遗传转化的对象1.2.3筛选细胞突变体1.2.4用于细胞膜结构、物质运输、激素感应等1.2.5用于分离细胞器和大分子,三植物原生质体培养与体细胞杂交,1.3原生质体研究进展1880年，Hanstein首次起用原生质体(protoplast)一词。1960年，Cocking首次应用酶法制备番茄根原生质体获得成功。1971年，Takebeetal.首次得到烟草叶肉原生质体培养的再生植株。1985年，Fujimuraetal.第一例禾谷类作物水稻原生质体培养再生植株。1986年，Spangenbergetal.单个原生质体培养再生植株在甘蓝型油菜上获得成功。,三植物原生质体培养与体细胞杂交,1.4原生质体的培养程序1.4.1原生质体的分离分离的原则是保证原生质体不受伤害及不损害其再生能力。1.4.1.1分离方法酶法分离是目前获得原生质体最为常见的途径。常用的酶是果胶酶、纤维素酶及半纤维素酶等。一般采用一步酶解的办法分离。1-3%纤维素酶+0.1-1%果胶酶。,三植物原生质体培养与体细胞杂交,1.4.1.2影响原生质体分离的因素外植体来源刚展开的幼嫩叶片是常用的原始材料。或者用愈伤组织或悬浮细胞，常年供应，操作方便。酶液的组成和浓度不同材料、不同供应商的酶应做专门的试验，找出最佳浓度配比。渗透压在分离过程中考虑一定的渗透压，避免细胞壁去掉后细胞因渗透不平衡而破裂。常用CPW溶液。,三植物原生质体培养与体细胞杂交,处理的温度和时间一般在暗条件下于23-32下进行处理。温度高，处理时间短，但获得的原生质体易褐化，破裂。温度低，处理时间长，不超过24小时。,三植物原生质体培养与体细胞杂交,来源于不同组织的原生质体：A：悬浮培养细胞B：愈伤组织C：叶片,三植物原生质体培养与体细胞杂交,1.4.2原生质体收集、纯化和活力测定1.4.2.1原生质体的收集经酶解处理后，得到的产物是原生质体、细胞团、破裂的细胞碎片组成。需将杂质和酶液去掉，纯化后的原生质体才能用于培养。用40-100um大小孔径的滤网将未酶解的细胞和组织去掉，滤液低速离心和用CPW溶液进行洗涤，离心，重复数次。,三植物原生质体培养与体细胞杂交,1.4.2.2纯化用蔗糖梯度离心法收集。吸出的原生质体用培养基稀释后进行培养。,原生质体,三植物原生质体培养与体细胞杂交,1.4.2.3原生质体活力测定常见的原生质体活力测定是采用FDA法进行。FDA是荧光素双醋酸酯酶，进入活细胞后被酯酶分解为荧光素而在细胞中得以积累，紫外光照射下发出荧光。死细胞则无荧光产生。,FDA检测原生质体活力,三植物原生质体培养与体细胞杂交,1.4.3原生质体培养1.4.3.1原生质体的培养方法常用的原生质体培养基与一般的组织培养一样。采用的培养办法主要有以下三种：液体浅层培养纯化的原生质体与液体培养基悬浮后去少量铺于培养皿形成薄层，密封后培养。固体培养琼脂糖培养法或包埋培养法。将原生质体与液体培养基混合后与低熔点琼脂糖按一定比例混合，倒于培养皿培养。,三植物原生质体培养与体细胞杂交,固液双层培养法结合上述两种方法的优点。,三植物原生质体培养与体细胞杂交,1.4.3.2细胞再生及植株的形成细胞再生原生质体培养后经过一段时间会再生出细胞壁，原生质体在培养初期仍然为圆球形，随着时间的延长，逐渐变为椭圆型，此时表明细胞壁开始形成。不同植物原生质体再生细胞壁的时间不一样，从数小时到几天不等。,三植物原生质体培养与体细胞杂交,原生质体培养细胞壁的形成,三植物原生质体培养与体细胞杂交,植株再生原生质体逐渐分裂形成细胞团，然后发育形成肉眼可见的小愈伤组织团，可转移到分化培养基上进行植株再生。,三植物原生质体培养与体细胞杂交,三植物原生质体培养与体细胞杂交,2体细胞杂交2.1体细胞杂交的概念也叫原生质体融合，是在离体条件下将同一物种或不同物种的原生质体进行融合培养并获得杂种细胞的再生植株。,三植物原生质体培养与体细胞杂交,2.2体细胞杂交的意义2.2.1克服植物种属间存在的生殖障碍，为新种质的创造提供了一条有效途径。2.2.2进行母性遗传的转移。由于传统的杂交方式无法实现两个物种细胞质遗传的结合。如控制细胞质不育基因主要位于线粒体，而抗除草剂基因则主要位于叶绿体。因此，位于不同品种或物种上的两个基因便可通过体细胞杂交的手段得以实现。,三植物原生质体培养与体细胞杂交,细胞质融合转移线粒体基因,三植物原生质体培养与体细胞杂交,2.3体细胞融合的方法2.3.1原生质体自发融合当酶解细胞壁时，常常可以发现相邻的原生质体融合在一起形成同核体，即自发融合。2.3.2诱导融合2.3.2.1化学融合多采用高分子量的PEG进行处理，两个不同物种的异源原生质体就会形成粘连的团聚体，然后再用高钙、高PH的溶液处理，形成异核体。,三植物原生质体培养与体细胞杂交,2.3.2.2电融合原生质体悬浮在两极间施加高频交流电场，使原生质体沿电场线方向泳动，并相互吸引形成与电场线平行的原生质体链；再用一次或多次瞬间高压直流电脉冲来引发质膜的可逆性破裂而形成融合体。,三植物原生质体培养与体细胞杂交,A-F：原生质体电融合G-H：同源融合I-J：异源融合,三植物原生质体培养与体细胞杂交,三植物原生质体培养与体细胞杂交,马铃薯野生种体细胞杂种栽培种,三植物原生质体培养与体细胞杂交,番茄与近缘野生物种体细胞融合的杂种,三植物原生质体培养与体细胞杂交,三植物原生质体培养与体细胞杂交,2.4融合体细胞杂种的鉴定2.4.1形态鉴定体细胞杂种植株形态往往介于双亲之间，包括叶形，株形，花器官等。,三植物原生质体培养与体细胞杂交,体细胞杂种植株叶片与亲本比较,三植物原生质体培养与体细胞杂交,2.4.2染色体计数体细胞杂种植株染色体往往是双亲染色体之和或少1至几条染色体。因此，细胞融合可以创造非整倍体、代换系、染色体片段置换系等珍贵的遗传学研究材料，对于基因定位，染色体与分子标记连锁群的关系具有重要的应用价值。,三植物原生质体培养与体细胞杂交,2.4.3分子标记鉴定杂种植株将出现双亲的互补带型。,四植物基因工程在育种中的应用,1基因工程的概念以类似工程设计的方法,按照育种者的意志,通过一定的程序,将具有遗传信息的DNA片段,在离体条件下,用工具酶进行剪切、组合和拼接，再将人工重组的基因，引入适当的受体中进行复制和表达的技术。,四植物基因工程在育种中的应用,植物基因工程是近20年来随着DNA重组技术、基因遗传转化技术及植物组织培养技术的发展而兴起的生物技术。利用基因工程技术可定向改造遗传性状；打破物种间生殖隔离障碍；在园艺植物重要园艺性状的遗传改良、抗逆抗病育种、品质改良与种质创新等方面发挥着巨大的作用。,四植物基因工程在育种中的应用,四植物基因工程在育种中的应用,全球转基因植物种植情况,1995年转基因农作物全球销售额为7500万美元；2000年达到30亿美元；2005年达到80亿美元以上；目前销售额正逐步上升。,2基因工程的基本步骤和方法主要包括以下步骤：目的基因的分离植物表达载体的构建植物的遗传转化转化植株的筛选及转基因植株的鉴定外源基因在植株中的表达与分析转基因植物新品种的选育,四植物基因工程在育种中的应用,四植物基因工程在育种中的应用,四植物基因工程在育种中的应用,2.1目的基因的获得2.1.1根据已知序列进行化学合成2.1.2筛选基因组文库或cDNA文库前提是要获得与目的基因有联系的探针。2.1.3PCR方法已知基因最方便的获得方法。2.1.4图位克隆与染色体步移2.1.5蛋白质序列反向推断获得目的基因。,四植物基因工程在育种中的应用,目的基因图位克隆方法示意图,四植物基因工程在育种中的应用,2.2植物表达载体的构建为使目的基因能够在植物细胞中正常表达，需要对其进行修饰。在目的基因上游加启动子、下游加上终止子。同时，为了实现对转化细胞的有效筛选，需要插入筛选标记基因与目的基因表达盒连锁。,植物表达载体结构示意图,四植物基因工程在育种中的应用,金色水稻基因表达载体示意图,四植物基因工程在育种中的应用,常见的植物遗传转化筛选标记基因：抗卡拉霉素基因（NPTII）抗除草剂基因（Bar）抗潮霉素基因（hpt）GUS基因绿色荧光蛋白基因（GFP）,四植物基因工程在育种中的应用,2.3植物的遗传转化利用生物及物理手段，将外源基因导入植物细胞以获得转基因植株。目前最常见的转化方式是：农杆菌转化方法和基因枪法。其他的诸如电激法、显微注射法、花粉管通道法使用较少。2.3.1农杆菌转化法植物能够被农杆菌浸染。双子叶植物容易，单子叶难度较大。待转化植物具有高的离体再生能力。,四植物基因工程在育种中的应用,四植物基因工程在育种中的应用,农杆菌介导法转化植物示意图,四植物基因工程在育种中的应用,2.3.2基因枪转化法物理转化方法。常用于单子叶的遗传转化。,四植物基因工程在育种中的应用,四植物基因工程在育种中的应用,2.4转化细胞的筛选及转基因植株鉴定植物外植体经过农杆菌转化或DNA的基因枪直接转化后，实际只有少数细胞能够被转化，需要采用特定的方法将转化细胞筛选出来，并在适宜的条件下使转化细胞再生成转基因植株。,四植物基因工程在育种中的应用,常用的筛选方法：利用筛选标记基因筛选或报告基因筛选。针对NPTII、Bar基因，可在培养基中分别加入卡拉霉素或PPT。凡是能够在一定浓度正常再生的为转化细胞，否则为非转化细胞。,转化子,四植物基因工程在育种中的应用,也可利用GUS、GFP等报道基因进行筛选。,转基因,转基因,非转基因,GFP基因,四植物基因工程在育种中的应用,3转基因技术在园艺植物育种中的应用3.1改良品质主要集中于与营养品质相关的基因的表达。如特殊蛋白质、VC、源于鱼类的不饱和脂肪酸于植物中表达等。最突出的例子就是富含胡萝卜素的“金色水稻”的基因工程育种,四植物基因工程在育种中的应用,3.2提高抗病虫能力通过转基因手段实现对各种危害园艺植物的昆虫、细菌、真菌、病毒等抗性，减少农药的大量使用。,豆类、棉花抗虫基因工程,木瓜抗病毒,四植物基因工程在育种中的应用,3.3花卉色素基因工程通过对花卉色素合成途径的基因调控，创造自然群体所缺乏的新的花卉颜色。最经典的例子是兰色玫瑰的基因工程育种被日本科学家投入巨资在2006得以突破。,基因工程兰玫瑰,四植物基因工程在育种中的应用,改变花色的转基因矮牵牛花,四植物基因工程在育种中的应用,3.4改善植物的抗逆性植物对外部环境的适应能力可通过基因工程技术大幅度提高。如抗旱、抗涝、耐低温、高温及耐盐碱等。,番茄耐盐基因工程,四植物基因工程在育种中的应用,3.5提高果实耐贮藏及保鲜能力通过对果实成熟、衰老过程相关基因的调控，实现果实保鲜、延长货架寿命。目前成功的例子主要是番茄、草莓等。,四植物基因工程在育种中的应用,3.6创造植物雄性不育材料通过将细胞毒性蛋白基因如barnase于雄配子发育过程中特异表达，使正常花粉发育失败，从而产生雄性不育。或者通过反义RNA技术实现雄配子发育过程中相关基因的抑制而得以实现。,四植物基因工程在育种中的应用,4转基因植物的生物安全问题4.1食品安全性和伦理学问题4.1.1抗性选择基因可能编码出对人体有直接毒性的蛋白质。目前选择标记基因可以通过技术手段加以解决。4.1.2一些转基因植物表达的蛋白质与已知过敏蛋白在免疫学上具有同源性，由此产生过敏性。4.1.3转基因表达的一些蛋白质是否会潜移默化影响人类免疫系统，人类摄食大量转基因食品是否会影响人类及其后代的健康。,四植物基因工程在育种中的应用,4.1.4外源基因随机引入后，是否会影响其他植物重要的调节基因，从而影响其营养价值。4.1.5将动物蛋白质基因转入农作物中，是否回侵犯素食者或宗教信仰者的权益？把人的基因转入作物，是否违反了人类的伦理道德等？,四植物基因工程在育种中的应用,4.2生物和环境安全问题4.2.1转基因植物是否会造成生态学灾难。部分转基因植物被赋予新性状，成为某一区域竞争优势物种。4.2.2转基因技术广泛应用是否会导致难以消灭的新病原物出现？病虫产生抗性，难以防治。4.2.3广泛使用的除草剂筛选标记基因可通过花粉与亲缘关系近的杂草发生天然杂交，从而出现超级杂草。,四植物基因工程在育种中的应用,4.3理性看待转基因技术4.3.1尽管存在上述风险，但目前未有详实的证据表明释放使用的转基因植物造成了上述问题。相对传统的植物育种来说，转基因植物带来的巨大价值是不容忽视的。4.3.2转基因农产品可能成为国家之间的贸易争端产生的借口。4.3.2我国于1996年由农业部颁布了农业生物基因工程安全管理实施办法和2002年颁布的农业转基因生物标识管理办法对转基因农作物的管理作出了理性的规定。,四植物基因工程在育种中的应用,转基因生物标识,五分子标记与育种,1遗传标记1.1遗传标记的概念遗传标记是基因型特殊的易于识别的表现形式.理想遗传标记的特点：多态性高遗传稳定能检测到整个基因组不受内外环境影响操作经济简单。,五分子标记与育种,1.2遗传标记的种类1.2.1形态学标记形态学标记直观明确,易于在育种中被识别,是最早应用于育种实践中的遗传学标记。包括叶形、叶色、植株高矮等性状。如番茄植株矮黄性状与抗TMV连锁。形态学标记在植物中分布少，而且部分标记常与不良性状相互连锁，大大影响了它在育种中的应用。如萝卜ogrua细胞质不育基因常与低温黄化连锁在一起，必须经过改良才能在生产上得以利用。,五分子标记与育种,1.2.2细胞学标记以染色体数目的变化和染色体结构变异等为基础的细胞学标记。即染色体核型分析。在包括番茄等作物在内的基因定位、连锁遗传图谱构建、染色体操纵以及外源基因导入的鉴定中起到重要的作用。但该标记在某些物种中由于染色体较小，染色体核型分析易受条件影响而表现不稳定等，限制了它的应用范围。,五分子标记与育种,染色体核型分析,五分子标记与育种,1.2.3生化标记生化标记主要指同功酶与贮藏蛋白，在一定程度上可以反映基因型差异。如种子贮藏蛋白的电泳分析已被广泛用于作物品种鉴别和纯度分析。生化标记的缺点表现多态性位点少，标记数目有限，受植株发育阶段与环境条件及温度、电泳条件等影响。,五分子标记与育种,过氧化物酶电泳蛋白质电泳,五分子标记与育种,1.2.4分子标记随着分子生物学技术的发展，一种基于DNA水平的多态性遗传标记分子标记出现。DNA分子标记出现后很快在植物遗传图谱构建、重要性状的标记定位、种质资源遗传多样性分析与品种指纹图谱及纯度鉴定等方面得到广泛的应用。,五分子标记与育种,1.2.4.1分子标记的特点直接以DNA形式表现，在植物的各个组织、各发育时期均可检测到。不受季节、环境限制、不存在表达与否的问题。数量多，遍及整个基因组；多态性高；不影响目标性状的表达,与不良性状无必然的连锁；许多分子标记表现为显性或共显性能够鉴别出纯合和杂合的基因型。由于这些特点，