过敏性紫癜患儿外周血树突状细胞Toll样受体与共刺激分子表达特性的初步观察

过敏性紫癜患儿外周血树突状细胞Toll样受体与共刺激分子表达特性的初步观察摘 要目的：观察过敏性紫癜(Henoch-Schonlein Purpura，HSP)患JL#I周血中树突状细胞(dendritic cells，DC)表面Toll样受体(TLR)表达状况，探讨TLR表达异常在HSP免疫发病机制中的作用。方法： 随机选择2011年12-2012年7月在青岛大学医学院附属医院住院治疗的HSP患Jb20例为研究对象，20例健康体检儿童为对照组。无菌条件下采集外周静脉抗凝血，Ficoll密度梯度离心法分离获得外周血单个核细胞(PBMC)，经粒一巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)和白介素4(IL4)诱导培养获得DC，采用流式细胞仪(FACS)检测DC表面TLR2、TLR3、TLR4、CD83、CD86的表达。结果：(j：)HSP组DC表面CD83表达率(52394-420)】与对照组【(5244士387)】比较，差异无显著性意义(t=006，p005)；而HSP组DC表面CD86表达率【(73814-475)】明显高于对照组(60474-330)】，差异有显著性统计学意义；忙233，p005)。HSP组DC表面TLR2和TLR3表达率均明显高于对照组分别为【(40244-595)VS(1717士334)，(31314-275)VS(1347a：220)】，差异有显著性(t=239，260，pO0s。HSP组与对照组DC表面TLR2和TLR3表达率与CD86表达率皆呈正相关关系(rO5360941，P005】；HSP children hadremarkably increaSed expression of the CD86 on peripheral blood DC than controlgroup(7381士475)VS(6047士330)，t=233，pO05nle levers ofTLR2、TLR3 of the HSP group were higher than the Control group(4024士595)VS(1717士334)，t=239，pO05；(3131士275)VS(1347士220)，t=260pO05(爹The TLR2 and TLR3 expression rates in HSPchildren and the controls both had positive correlation with the expression ofCD86(PO536加94 1，P005)；T11e TLR4 expression rates had no had nocorrelation、析th the levels of CD86Conclusion The changes of the TLR2，TLR3，TLR4，CD86 on peripheral blood DCof the children with HSP suggest that TLRs may participate in the nosogenesis ofHSP by mediating signal transduction，leading to abnormity of cytokines，theninducing ThlTh2 immune imbalancePostgraduate student：Chen YuxiuDirected by Zhang QiuyeKey words t Henoch-Schonlein Purpura：dendritic cells；Tolllike receptors；cosfimulatory molecules；children目 录引言1第一章材料与方法311主要器材312主要试剂313研究对象314研究方法415统计学处理4第二章结果721 DC体外培养过程中形态学观察与CD83表达率检测722 HSP患儿DC表面TLR表达率变化723 DC表面CD86表达率及与TLR表达率间相关性7第三章讨论1l31过敏性紫癜免疫学发病机制概述1132 Toll样受体的特性1233 HSP患),Toll样受体表达特性及意义探讨14结论16参考文献17综述2l综述的参考文献30攻读学位期间的研究成果36致谢37学位论文独创性声明学位论文知识产权权属声明38引言过敏性紫癜患儿外周血树突状细胞To Il样受体与共刺激分子表达特性的初步观察引 言过敏性紫癜(Henoch-Schonlein purpura，HSP)是一种以全身广泛性小血管炎为主要病理特征的变态反应性疾病，近年来有逐渐增多的趋势。临床上以皮肤可触性紫癜(非血小板减少性)、腹痛伴或不伴便血、关节肿痛和肾脏受累等为主要表现。病因和发病机制迄今尚未完全明了。众多的资料显示感染是HSP的重要诱因，T和B细胞功能紊乱与HSP的发病机制密切相关。研究证实，B淋巴细胞多克隆活化为过敏性紫癜的重要特征，T细胞功能异常在其中起着关键作用。在炎症反应过程中，活化的CD4+T细胞通过过度表达膜蛋白CD40L，可使B细胞单核细胞CD40配体(CD40L)过度表达，促进B淋巴细胞分泌大量IgA和IgE cI21。既往研究发现HSP急性期外周血ThlTh2免疫应答失衡，即Thl功能降低，Th2优势活化口1，此与B淋巴细胞多克隆活化明显相关。树突状细胞(dendritic cell，DC)作为最强的抗原递呈细胞之一，CD83成熟DC的标志。Dc能够促进T、B淋巴细胞增殖，调节ThlTh2免疫平衡，在免疫应答中具有独特地位，包括激活天然免疫系统，启动更持久的适应性免疫，诱导胸腺清除自身反应性T细胞、分化调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)起到维持自身免疫耐受的作用H1。生理情况下Th细胞分化由树突状细胞(dendritic cells，DC)所调控，DC在ThO细胞分化中起重要作用H1。Dc通过3一种信号通道协同调控Th细胞功能啼61，对ThlTh2平衡分化起重要的作用。这3种信号包括：抗原特异性信号，主要为DC表面高表达的姗CII类分子递呈的外来抗原，HLA-DR为MHCII的特异性识别片段；协同刺激信号，CD86、CD80是DC表面的最主要的共刺激分子，决定受抗原刺激的T细胞成为效应细胞，或进入无反应状态；分化或极化信号，其中DC分泌的IL-12、IL一10的水平是影响Th细胞分化结果的最重要因素。目前儿童HSP患儿DC功能状态及在发病机制中的地位仍未完全清楚。陈永兴等研究发现，HSP病儿DC表面共刺激分子CD86表达显著增高而CD80表达明显降低，同时IL一12分泌水平明显降低；HSP病儿DC表面CD86表达率与血浆IL-4水平显著正相关，CD80表达率与血浆IFN-Y水平也呈正相关。结果提示HSP病儿外周血来源Dc功能异常且与ThlTh2应答失衡密切相关口1。青岛大学硕士学位论文Toll样受体是近年来发现的机体感知微生物病原体并激活细胞直接产生免疫防御的天然免疫受体，它们能够特异性地识别病原微生物，通过耦连信号传导途径，激活免疫细胞，或直接触杀，或诱生细胞因子和化学激活因子扩大非特异防御作用，或提供共刺激信号诱导特异免疫，最终引起一系列的炎症反应随引。Toll样受体不仅能激活天然免疫，而且也为激活获得性免疫提供刺激信号，在天然免疫与获得性免疫中起着重要的桥梁作用。基础免疫学研究发现，Tol 1样受体表达状态与ThlTh2免疫应答密切相关n们。近年来国内外研究资料显示，TLRs及其信号通路在自身免疫性疾病(如SLE、川崎病)、超敏反应(如支气管哮喘)、炎症反应、细胞凋亡及移植排斥反应中发挥重要的作用。迄今有关HSP儿童DC表面Toll样受体表达特性的研究资料较少，国内李媛嫒等研究发现HSP患几急性期外周血单个核细胞TLRl、TLR2、TLR6、TLR5、TLR3、TLR7、TI瓜9及其信号途径相关分子MyD88、TRAF6、TRIFmRNA表达明显升高】，其在HSP免疫发病机制中的地位尚未完全阐明。为此本研究通过体外诱导培养HSP患儿外周血DC细胞，检测DC表面TLR2、TTLR3、LR4和CD83的表达，以探讨DC表面TLR表达状态在HSP免疫机制中的意义。2材料与方法第一章 材料与方法11主要器材(1)SW-CJ-1F型净化工作台(苏州净化设备厂)；(2)Microfuge Lite离心机(美国Beckman公司)；(3)LD5-2A型低速离心机(北京医用离心机)；(4)3111型C02培养箱(美国Forma Scientific公司)；(5)IX-70型倒置显微镜(日本Olympus公司)；(6)Epics-XL流式细胞仪(美国Beckman Coulter公司)；(7)移液器(法国Eppendorf公司)；(8)24孔培养板(美国Costar公司)；12主要试剂(1)RPMI-1640培养基(Hyclone公司)；(2)特级胎牛血清(Hyclone公司)；(3)淋巴细胞分离液(加拿大Cedarlane公司)；(4)重组人白细胞介素一4(rhIL-4，美国Peprotech公司)；(5)重组人粒一巨噬细胞集落刺激因子(rhGMCSF，美国Peprotech公司)；(6)重组人肿瘤坏死因子一a(rhTNFQ，美国Peprotech公司)； 一(7)藻红蛋白(PE)标记的鼠抗人TLR2、TLR3、TLR4单克隆抗体及其同型对照抗体(法国Immunotech公司)；(8)FITC标记的CD83、CD86(法国Immunotech公司)；13研究对象131 HSP组：选择2011年12月至2012年7月在青岛大学医学院附属医院住院治疗的过敏性紫癜患)h20例，其中男12例，女8例，年龄5-13岁(中位年龄9岁)。采血前一个月内未使用糖皮质激素以及免疫增强或抑制剂等药物。132对照组：选自青岛大学医院附属医院门诊体检的健康同龄儿童20例，男11例，女9例，年龄414岁(中位年龄lO岁)。既往均无过敏性疾病，采血前1个月内无特殊药物使用史。3青岛大学硕士学位论文14研究方法141标本采集：无菌操作条件下采集HSP患儿和健康对照组儿童外周静脉血3-4mi，肝素抗凝(肝素20um1)。1。42外周血单个核细胞(PBMC)的制备：采用密度梯度离心法分离PBMC。严格无菌操作，所用器皿均经高压蒸汽灭菌。(1)将抽取的外周血加入等体积RPMI-1640培养液混匀。(2)用吸管吸取稀释血液，在距淋巴细胞分离液面上约Icm处，沿管壁慢慢加入。以1：l比例将稀释血液悬浮于淋巴细胞分离液上，室温下用水平离心机以2000rpm离心12分钟。(3)离心完成后液体分三层，上层为血浆，中层为分层液，下层为红细胞，在上层与中层交界面呈现浑浊带(白膜层)，此层内含有大量单个核细胞。用吸管轻插至白膜层，沿管壁周缘吸出界面层细胞，移入离心管中。(4)用RPklI一1640培养液混匀，于2000rpm离，i),10分钟，弃去上清，重复洗涤2次。(5)末次离心后，弃去上清，加入含10灭活小牛血清的RPMI一1640培养液Iml，混匀，取一滴计数。143 IX；的诱导培养：(1)用不含细胞因子的RPMI-1640培养液(含10灭活小牛血清、青霉素及链霉素)调整单个核细胞悬液浓度为2106ml。(2)取24孔培养板，用移液器取lml细胞悬液加入一孔中，并做好相应标记。(3)放入培养箱，在37。、饱和湿度、5C02条件下孵育3-4h。(4)取出后轻摇培养板，去除非粘附细胞，获得贴壁的单个核细胞。然后再加入含细胞因子(rhGMeSF终浓度为100ngml，rhIL-4终浓度为100ngm1)的RPMI-1640完全培养液Iml。(5)在37。、饱和湿度、5C02条件下培养8天，培养过程中通过倒置显微镜观察细胞的生长情况。隔日半量换液，全量加因子，维持细胞因子浓度为rhGM-CSF终浓度为100ngml，rhIL一4终浓度为100ngml，培养至第6天，每孔加入TNFa至终浓度20ngml。第8天时收获，以2000rpm离心5分钟，弃上清液，剩余细胞悬液调适当浓度后测DC表面CD83、CD86和TLR表达率。4材料与方法144峨面CD83、CD86和TLR表达率检测(1)将所获Dc细胞PBS沈涤2遍，弃上清，混匀，再加入一定量的PBS配制成浓度为Ixl05ml的细胞悬液。(2)各取100ul细胞悬液加入流式细胞仪测定管，再分别加入20Itl PE标记的鼠抗人CD83、CD86、TLR2、TLR3和TLR4单克隆抗体和小鼠IgGl抗体(阴性对