34水培番茄青枯病发生条件及防治研究

华中农业大学2008届硕士学位论文分类号 密级华中农业大学硕士学位论文 水培番茄青枯病发生条件及防治研究Study of conditions and control of tomato bacterial wilt in hydroponics研究生:指导教师:专业：微生物学 研究方向：生物防治获得学位名称：理学硕士 获得学位时间： 2008年6月华中农业大学食品科技学院二八年五月73水培番茄青枯病发生条件及防治研究摘 要青枯病是由青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起，严重危害作物生长的一种细菌性土传病害。至今已发现该病菌可侵染44多个科近300多种植物。青枯病防治困难的主要原因是其发生与多种因素有关，如：植株品种、土壤管理、栽培管理、施肥状况、气候等。因此，青枯病的防治不能单靠某一种方法的作用，而需采取综合防治措施进行防治。目前在番茄青枯病的多种防治方法中，生物防治对番茄生产的可持续发展具有很好的应用前景。因此，本研究在立足于生物防治的基础上，以水培番茄系统作为青枯病研究的媒介，从番茄防御酶、生防菌及营养元素等三方面对番茄青枯病进行了系统、深入的防治研究，取得以下主要研究成果：1. 通过稀释涂布法和菌脓分离法获得强致病力青枯菌株。对两种方法进行比较发现，菌脓分离法是分离青枯菌最理想的方法，此法有利于获得纯培养的强致病力菌株，所用时间短，纯化次数少，且所分离菌株的致病性保持时间长。分离时期以植株发病初期分离的青枯菌株最好。2. 通过单因素试验和均匀试验设计研究了水培条件下番茄青枯病发生的最佳条件。结果表明，青枯病发生的最佳条件为：番茄苗龄45叶期，伤根，营养液pH6.4，温度32，环境湿度80%，EC2.2ms/cm，青枯菌接种浓度6.3108cfu/mL。3. 通过拮抗试验从健康番茄植株根际土壤中获得4株对青枯菌具有强拮抗性的菌株，并用LuxAB和链霉素、四环素进行标记，命名为S59、S8、S57、S43。经进一步拮抗试验、催芽试验、防效测验及在番茄根部的定殖测定试验，筛选出可在番茄根际大量繁殖，具有强定殖力，对导管和根表面青枯菌有强的抑制作用的S59菌株。4. 通过改变营养液Ca2+、K+浓度分别与拮抗菌S59的共同作用，对番茄苗抗性和青枯病发病率进行了研究。结果表明，拮抗菌S59与K+结合施用有利于提高番茄植株抗性，增强防病能力。同时，在拮抗菌S59浓度不变的条件下，番茄青枯病发病率随K+浓度的升高而下降，从40.1%下降到32.4%，与对照相比降低了52.0%，防效上升9.1%，作用显著。而在水培条件下Ca2+浓度的增加对番茄青枯病的防治是不利的，当Ca2+浓度由3.5mmol/L上升到9.5mmol/L时，发病率从39.5%上升到48.7%，其防效下降了11.5%。5. 通过对番茄生理生化分析研究表明，经各浓度K+与拮抗菌处理的番茄苗，苯丙氨酸酶 (PAL)、过氧化物酶(PPO)、多酚氧化酶(POD)活性均在处理后有明显的提高，且随K+浓度的升高而升高；Ca2+与拮抗菌处理的番茄苗三种酶活性，围绕对照3.5mmol/L浓度处理起伏变化，呈无规律性，各浓度间差异不显著。番茄苗超氧化物歧化酶(SOD)活性在经各浓度Ca2+与拮抗菌S59处理后，具有随Ca2+浓度的增加而升高的趋势；各浓度K+与拮抗菌S59处理的番茄苗SOD酶活性无明显变化。从番茄苗四种防御酶活性的动态变化曲线看，拮抗菌的加入使各酶活性的峰值出现时间有所推迟。以上研究结果，对番茄青枯病的持续有效控制、新生防菌剂的开发、番茄栽培管理、施肥管理等均具有十分重要的理论和应用意义，同时对其他植物土传病害的研究也具有十分重要的参考价值。关键词：青枯病；青枯雷尔氏菌；水培；生物防治；番茄Study of conditions and control of tomato bacterial wilt in hydroponicsAbstract Bacterial wilt caused by Ralstonia solanacearum is a soil-borne bacterial disease lead to serious harm crops. The bacteria may infecte over 44 branches nearly 300 varieties of plants so far. The difficult to control bacterial wilt is that its occurrence related to various factors, such as: plant species, soil management, cultivation and management, fertilization conditions and climate variability,et al , these are the main reasons causing control problems. Therefore, the control of bacterial wilt integrated control measures to be taken, rather than using a method. At present, biocontrol is an improming way to control tomato disease in many methods of disease-contronl. Therefore, this study based on the biological control, used hydroponic as a media, three aspects were systematic and in-depth studied from the activities of defense enzymes, nutrition elements and biocontrol to tomato bacterial wilt. The main research results were as follows: 1. The strong virulence of R.solanacearum was obtained by the methods of dilution and bacterial pus separation. Comparing the two methods was found bacterial pus separation is the best way to separate the pathogen, this method with a short time, fewer purification, and pathogenicity of maintaining a long time. The initial infected tomato is the best separation period. 2. The optimization of tomato bacterial wilt was investigated through Single-factor experiments and Uniform Design in hydroponics. The results show that the optimal conditions for bacterial wilt were the temperature at 32, pH6.4, EC2.2ms/cm, Root-wounding, the relative humidity was 80%, the optimal age of tomato seedling was 4 to 5 leaf stage, the optimal concentration of the pathogen inoculation was 6.3 108cfu/mL.3. 4 strains of antagonistic bacteria were obtained from the rhizosphere soil of healthy tomatos by the antagonize experiment, and with LuxAB and streptomycin, tetracycline marking, named S59, S8, S57, S43. By antagonistic experiment, germination test and disease-control experiment, the results showed that S59 strains could restrain germination of tomato weed, and control plant disease effectively. The colonization study of S59 strains indicated that it could not only colonizate but also maitain a unsiderably population on tomato roots-surface, stems. 4. The incidence of tomato bacterial wilt and resistant were studied by the common role of Ca2+, K+ and S59 strain. The results showed that the integration application of S59 and K+ is conducive to raising tomato plants resistant, to enhance disease prevention. At the same time, under the same concentration of S59 strain, the incidence of bacterial wilt decreased along with the increase of K+ concentration, decreased to 32.4% from 40.1%, compared with the control lower 52.0%, the controlling efficiency increased 9.1%; The increase of Ca2+ concentration is detrimental to the prevention of tomato bacterial wilt in hydroponic. When Ca2+ concentration increased from 3.5 mmol/L to 9.5 mmol/L, the incidence of tomato increased from 39.5% to 48.7%, the controlling efficiency declined 11.5%. 5. The results on the physiological and biochemical analysis of tomato showed that the phenylalanine (PAL), peroxidase (PPO) , polyphenol oxidase (POD) activities has been significantly improved through K+ and S59 strain treatment, moreover, the three defense enzyme activities increased along with the increased of K+ concentration. The activities of the three defense enzyme changes on the ups and downs around 3.5mmol/L concentrations by Ca2+ and S59 strain, the enzyme activities of the dynamic curves were no regularity, and the difference between the concentration is not significant. Superoxide dismutase (SOD) activity would be increased with the increase in Ca2+ concentration. But SOD activity was no significant changes while the concentrations of K+ and S59 strain treament. From the dynamic curves of the four defense enzyme activities of tomato seedlings, the peak activity would be delay after the entry of antagonistic bacteria.These Conclusions have important theoretical and applied significance on the sustainability control of tomato bacterial wilt, the development of new anti-microbial agent, tomato cultivation and management, fertilizer management, moreover, other plants on soil-borne diseases is also very important reference value.Key wards: Plant bacterial wilt；Ralstonia solanacearum；Hydroponics；Biocontrol; Tomato缩略语表英文简称英文全称中文全名cfucolony-forming units菌落形成单位cmcentimeter厘米CKcheck对照Cacalcium钙dday天数ECelectricity conductance电导率hhour小时ggram克Kgkilogram千克Kpotassium钾Lliter升minminute分钟mmmillimeter毫米mLmilliliter毫升rrevolution转数gmicrogram微克mmicron微米PALphenylanine ammonia lyase苯丙氨酸解氨酶PPOpolyphenoloxidase多酚氧化酶PODguaicol peroxidase过氧化物酶SODsuperoxide dismutase超氧化物歧化酶第一章 文献综述1.1 青枯病的发生1.1.1 青枯病的危害青枯病是流行于全世界严重危害作物生长的一种细菌性土传病害，在热带和亚热带地区发生普遍，一旦发生难以控制，严重时造成作物大面积死亡甚至绝收。1864年印度尼西亚首先报道了青枯病在烟草上引起的毁灭性损失。随后，美国、澳大利亚也相继报道了马铃薯和番茄上青枯病害的发生。到目前为止，该病菌已发现可侵染44多个科近300多种植物(任欣正，1981)。在我国上世纪50年代始发现有该病发生(何礼远，1985)。近些年在我国的华东、华中、华南、中南和西南部分地区均有不同程度的青枯病害的报道。在广东省，该病在每年的69月份发生最为严重。1.1.2 青枯病的感染病原青枯病的侵染病原菌为青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum，简称青枯菌)，属细菌界(Bacteria)，变形细菌门(Proteobacteria)，乙型变形细菌纲(Betaproteobacteria)，假单胞杆菌目(Burkholderiales，Pseudomonadales)，假单胞杆菌科(Burkholderiaceae)，青枯菌属(Ralstonia)(王金生，2001)。菌体形态为短杆状两端钝圆，大小0.92.00.50.8m，有端生鞭毛13根，革兰氏染色反应阴性。该菌在环境中变异较多，目前被 国际公认的亚分类系统就有5个生理小种和5个生化变种。1.1.3 青枯菌的侵染及植株表现症状青枯菌是一种寄生植物维管束组织的病原菌，主要危害茄科蔬菜，对烟草、花生、芝麻、大豆、香蕉等经济作物也有侵染。青枯菌侵染主要从寄主根部或茎基部伤口侵入，也可从没有受伤的次生根的根冠侵入。侵入后先破坏细胞间的中胶层，使寄主植物的细胞发生质壁分离，细胞器变形，形成空腔，以便青枯菌分布于薄壁细胞和空腔内。青枯菌还可侵入导管，首先导管附近的小细胞受刺激形成侵填体，膨大并进入导管，细菌移动进入侵填体，然后破裂，释放进入导管。青枯菌在导管内大量繁殖产生以胞外多糖(Extracellular polysaccharide，EPS)为主的大分子物质，堵塞导管。同时，青枯菌还向胞外分泌多种细胞壁降解酶，破坏导管组织，影响和阻碍植物体内水分运输，从而引起植株萎蔫，最终枯萎死亡。 侵染后的植株，在幼苗期一般较少显症，多在植株开花坐果期表现急性显症。外部表现症状为：染病植株比健株稍矮，叶色较淡，在晴天高温的日间，病株茎和叶片自上而下萎垂，先是顶部叶片萎垂，以后下部叶片凋萎，中部叶片萎蔫最迟，一般晚间和清晨尚可恢复，经34天或更短时间全株茎叶萎蔫枯死，但病株在短期内仍保持青绿颜色，叶片亦不脱落。病株的茎部下端往往表皮粗糙，并常出现12cm水浸状斑块，病斑后期变褐。剖茎可见病茎木质部变褐，新鲜时用手挤压有白色汁液渗出，这是体内寄生病原细菌的溢脓，可用此方法快速诊断青枯病。除以上症状外，有些植株还表现叶片的向上性生长和不定根的形成等。1.1.4 青枯病的发生规律 青枯菌生长的最适温度为3037，最高温度41，最低10，致死温度52，10min，属高温型。最适土壤含水量为30%40%。 在田间，高温高湿多雨是诱使青枯病发生和流行的主要因素，尤其是雨后转晴，太阳暴晒，土温升高，气温达3037时，青枯病的发生最为严重。一般而言，在土温20左右时，植株开始发病，土温达25左右时，病菌活动最盛。1.2 青枯病的防治现状1.2.1 生物防治青枯菌因在环境中变异较多，传播途径多样，寄主范围广，从而造成防治上的困难。在生产中采用药剂处理是见效最快、最直接的防治方法，但就目前看还没有针对青枯病的专用特效药。随着人们对健康及绿色农业认识的不断提高，许多国家都不同程度的限制了药剂(特别是化学农药)的使用范围和使用种类。在此趋势下，无毒、安全、无公害的生物防治法成为近些年各国研究的热点，并取得了一定的成果。1.2.1.1 无致病力青枯菌菌株利用 利用无致病菌株对致病菌进行防治，最早成功的例子见于放射性土壤杆菌84菌株防治根癌土壤杆菌。1929年，McKinney发现弱致病菌与致病菌间存在干扰现象，此后，美国学者Kunkel(1934)提出了利用弱致病菌进行致病菌防治的设想。但无致病菌株的真正有效利用始自上世纪50年代，而无致病力青枯菌株防治青枯病始自上世纪80年代。国内外许多学者对无致病力青枯菌防治青枯病的机制，最初的认识统一在细菌素的作用上。在试验中发现，产细菌素的无致病力青枯菌菌液对敏感菌的防效明显高于不敏感菌，从而说明了细菌素在防治中起着重要作用。董春(1999)等在产细菌素的无致病力番茄青枯菌株Tm3对番茄青枯菌株Tm46的抑菌试验中也发现，产细菌素的无致病力番茄青枯菌株具有强的抑菌能力。为获得高效的无致病力青枯菌株，人们通过Tn5诱变、紫外诱变、化学诱变(Trigalet A et al.，1986；康耀卫，1995；陈庆河，2004；张秀华，1980)等方法获得了许多无致病力青枯突变株。值得注意的是一种高效的生防菌首先必须具有良好的根部定殖能力。为此，需对获得的无致病力青枯菌突变株进行定殖测定。试验发现，诱发突变菌株在番茄茎和叶部定殖能力介于野生型菌株与自发突变菌株之间，表明诱发突变株定殖能力要优于自发突变株。同时，诱发突变株能有效的与致病菌株进行生长竞争，阻止致病菌的增殖，其防效也要优于自发突变菌株。无致病力青枯菌株的生防作用除与致病菌株间的生长竞争外，还来自于可诱导寄主植物对病菌产生抗性。Lovrekovich(1965)利用无毒青枯菌株成功诱导出番茄植株的抗病性。何礼远(1990)等曾利用无致病青枯菌和荧光假单胞菌成功诱导了番茄植株的抗性。结果显示，在番茄植株上其诱导性从根部向上的传导能力不强，在根部对致病菌具有抗性，越往上其抗性明显降低。这一现象也说明了青枯菌对寄主植株侵染时主要从根部始，从而使植物首先对根部进行防御。尽管，众多试验都表明了无致病力青枯菌在生防中的积极意义，但在实际应用中仍存在问题。在试验中具有良好生防效果的无致病力青枯菌株，一旦用于大田试验往往随着时间的延长，强致病力菌株又重新成为优势种，后期降效快，长期防效的稳定性不好，推测这也可能是无致病力菌株在短期内有效的原因之一。造成这种现象的原因可能是在土壤微生物群体中，无致病力青枯菌缺乏强的竞争能力，从而使防治效果不能长久维持。因此，在无致病力青枯菌的大田施用中有必要增大接种量。1.2.1.2 有益根际微生物的利用 作为土传病害的生防菌要想具有良好的生防效果，必须在植物根际具有强的定殖能力。基于这一认识，目前研究的生防菌除无致病力青枯菌外，还集中在那些可以在根际具有良好定殖的根际微生物和内生微生物。龙良鲲、周燕(2003，2005)等分别就内生细菌对番茄青枯病的防治进行了研究，实验效果表明，利用内生菌的去菌发酵液对番茄青枯病的防治效果明显优于菌悬液，从而认为内生菌产生了具有对青枯菌起抑制作用的物质。这些有益内生菌在进一步的鉴定中，发现为芽胞杆菌(Bacillus spp)。不仅在国内的研究中发现芽孢杆菌的生防作用，印度Anuratha等用两株芽胞杆菌菌株(B33, B36)防治香蕉、茄子和番茄青枯病，也分别取得了温室盆栽试验防效50%、61%、95%，田间试验防效50%、49%、36%，同时植株鲜重和产量也均有提高，说明芽孢杆菌对作物有一定的促生防病作用。另一种被广泛研究的根际生防菌是假单胞菌属(Pseudomonas spp)。假单胞菌属中的大部分种在植物根际具有强的繁殖能力，可在根际形成大的群体，从而阻止病原菌在根际的定殖，保护植物根部。某些假单胞菌还可产生嗜铁素(siderophores)、氢氰酸(HCN)、邻氨基苯甲酸(anthranilie acid)等具有抑菌作用的次级代谢产物。祝新德，冯镇泰(2001)等从荧光假单胞菌M18菌液中提取纯化了吩嗪-1-羧酸(phenazine- -1-carboxylic acid，PCA)，证实该物质对甜瓜蔓枯病菌具有强力抑菌作用。另外，某些假单胞菌对植物生长具有突出的增产作用，研究最多的是荧光假单胞菌(P. fluorescens)。在利用荧光假单胞菌对多种作物的增产效果试验中表明，荧光假单胞菌可使马铃薯增产5%33%，胡萝卜增产60%144%，小麦增产16.5%28.1%。为更好的发挥荧光假单胞菌在根际的生防和增产效应作用，很多研究人员还研究了它在根际的定殖菌量和生态分布情况，发现荧光假单胞菌的定殖受到土壤的pH、温度、湿度、营养状况及有机质等多方面因素的影响。1.2.1.3 有益真菌微生物的利用 印度Suresh和Rain及菲律宾学者均发现，某些菌根真菌具有抑制青枯菌或减弱青枯菌致病性的作用。对于造成这一现象的原因，学者们推测可能仅是因菌根真菌独特的生长状态及占有的独特生态位所形成的一种机械屏障作用，阻止了病原菌对寄主的侵入。朱红惠(2004)等对丛枝菌根真菌(AM真菌)的研究中则获得了更多的防治信息。研究发现，丛枝菌根真菌可显著提高根系酚类物质含量，降低根际、根表面和木质部中青枯菌数量，且青枯菌这种数量上的降低并非是孤立的，而是与根际其他微生物数量的增加相伴随的，认为AM真菌在根部的作用影响了整个根际微生物群落结构。近些年，人们又分离获得了许多对植物抗病性具有良好作用的其他内生真菌，并推断这些内生真菌在植物体内应是普遍存在的(郭良栋，2001)。研究中发现，内生真菌的生防作用及与植物间的相互作用是非常复杂的，某些内生真菌可产生生物碱对某些昆虫和食草动物有毒害作用，从而使寄主植物增强其防御能力及其它抗逆能力。还有一些内生真菌可产生对植物病原菌具有拮抗作用的物质，阻止病原菌在植物体内的扩展。同时还发现，在内生真菌侵入植株后，感染内生真菌的植株比没有感染的植株对外界环境具有更好的适应性(Siegel，1987)。可见，将有益内生真菌植入植物体内不但可达到防治某种病原菌的目的，同时又可增强植株对环境的适应性。因此，在青枯病的防治中若能利用内生真菌构建抗性植株，不失为生物防治的一种新途径，关于这方面的研究还鲜有报道。 1.2.1.4 噬菌体的利用 噬菌体对病原菌的防治作用主要是破坏病原菌的代谢途径和直接裂解病原菌。在青枯病的防治中因青枯菌为一种土传细菌，因此在噬菌体的应用上有一定的难度，报道较少。日本藤井薄曾用噬菌体在青枯病发病早期进行防治，但未取得成功。此后，日本的Tanaka(1990)用含有噬菌体的无毒青枯菌株M4S对烟草进行预处理，发现能有效降低青枯病的发病程度，并且当M4S与噬菌体共同对烟草进行处理时，能表现较好的防治效果。噬菌体无论在应用还是研究上都较其他生防菌更具困难。因此，在利用噬菌体进行青枯病防治方面，目前进展缓慢。1.2.1.5 生物农药的生产利用 生物农药是利用生物及其活性成分，制备出用于防治植物病虫害、环卫昆虫、杂草、鼠害以及调节植物生长的制剂的总称。作为一种药剂，在安全性上由于生物农药均是天然存在的活体生物或化合物，故在环境中可以自然代谢参与能量与物质循环。因此，生物农药的施用不易产生残留，不会引起生物富集现象。再者，生物农药大多为专一性很强的针对性药物，对非靶标生物几乎没有任何影响，加上生物农药的活性较高，用量较少，因此也是相对安全的。在全世界的生物药剂中，针对土传病害的生物农药大多是用于控制温室的土传病害，在田间因受到天气、温度、土壤等环境条件的限制，推广缓慢。目前在全世界应用最广泛的微生物农药是苏云金芽胞杆菌、白僵菌、绿僵菌(Tanado Y，1993)等。在英国和美国，枯草芽孢杆菌已被商业化用于控制黄瓜和番茄上的瓜果腐霉和烟草疫霉。在中国，目前能大规模生产的生物农药品种主要有4个Bt(Bacillus thuringiensis)、井岗霉素、阿维菌素和赤霉素。青枯病防治方面的生物农药制剂，比较成熟的是防治番茄与烟草青枯病制剂“青枯散”(魏春妹，2000)，在田间应用实验表明，该制剂对番茄青枯病、烟草青枯病有70%、80%的防治效果，并有10%的增产效果，具有发芽势高和壮苗的作用。生物防治技术因在国内发展较迟，况且就现在的农业生产方式看，生产多为小规模生产，而生物农药与化学农药相比又价格昂贵，见效迟，应用时间长，使其在推广上有一定的难度。1.2.1.6 抗性植株的构建 抗病性植株与有益微生物的共同作用被认为是防治青枯病的最好方法。两者的混合使用，既可克服有益微生物的短期作用又可对抗性植株起到抗性的诱导作用。因此，抗病品种的选育在青枯病防治中得到更多关注。自1992年起，番茄抗青枯病育种作为一种世界性的合作项目被各国所重视。该项目从世界各国收集了35个抗青枯病的番茄品种，在10个国家进行抗病性田间鉴定试验。结果表明，这些品种的平均存活率均较对照感病品种高，其中Hawaii7996品系表现的抗性最为稳定，平均植株存活率为96.9%(Wang J et al.，2000)。其研究结果还表明，灌根接种是筛选青枯病抗病品种的最有效的接种方法。最近，Fock(2001)报道称以野生植物Solanum stenotomum为抗病基因供体植物，通过体细胞杂交培育抗青枯病马铃薯试验获得的四倍体无性系，表现出较高的抗性水平。目前在我国也己培育出一些抗病品种，如抗青、秋星、夏星、洪抗1号、四季抗青等(黎壁然等，1991；刘民建等，1994；刘达风等，1996)，并对其抗病机制及抗性遗传效应进行了研究，发现一些抗病品种对青枯病有较高的抗性，但常不具备优良的生产性能，再加上青枯菌致病型的复杂性及不稳定性，使现有抗病品种的推广面积受到非常大的限制。在抗性品种的筛选方法上，目前报道的有组培筛选法、有性杂交法(汪国平，1998；李海涛，2001)等。但组培法在菌体和其培养滤液选择压力下的愈伤组织死亡快，筛选番茄抗青枯病突变体的难度较大。采用高抗青枯病的抗源材料与具有符合育种目标的优良经济性状材料进行抗青枯病育种的方法，需要较长的育种过程，且番茄抗青枯病育种抗性不易固定，选择难度也大。田长恩(2000)等采用花粉管通道法将柞蚕抗菌肽D基因导入番茄，得到了部分具有较强青枯病抗性的子一代转基因植株，但遗传稳定性尚存在问题。抗性植株的获得除抗性植株筛选方法的困难外，另一方面还在于所选抗性植株往往只对青枯菌的某一小种或某一生化型起作用，加之青枯菌在自然环境中易于变异，从而使得抗性植株无法以一种基因型维持下去。因此，到目前为止对青枯病的防治还不应是单一的某一种方法的作用。1.2.2 物理、化学防治在青枯病的防治中，最早采用的物理防治方法是采取寄主作物与非寄主作物间的轮作，特别是在禾本科作物青枯菌的防治中，如水稻的水旱轮作，可以大大降低土壤中青枯菌的数量，成为水稻青枯病防治的较好方法；水稻与茄子的水旱轮作(茄子水稻茄子)，可使植株的青枯病发病率维持在8.26%以下。烟草与大豆或玉米轮作也能显著降低烟草青枯病的发病率(Fortnum，1997)。在进行轮作操作时，一般轮作的时间越长，效果越好。嫁接方法是在抗青枯病品种还未成功培育出之前一直受到人们重视的方法。在浙江、上海等地用抗青枯病的野生番茄砧木嫁接当地主要番茄栽培品种，其防效可高达100%，并可使番茄增产17倍，用此法嫁接的番茄还未曾发现对番茄品质有任何影响(陆民强，1992)。在台湾，利用嫁接技术防治茄子青枯病也获得成功。土壤熏蒸法是用熏蒸剂对土壤进行熏蒸，杀死或抑制青枯菌生长繁殖，从而达到防治青枯病的方法。目前用的最多的广谱性土壤熏蒸剂有：威百亩、一氯甲烷、氯化苦、棉隆、碘甲烷等。化学防治主要集中在各种农药的使用上，如：可杀敌、氧氯化铜、青枯灵、敌克松、加瑞农、农用链霉素等，尽管许多农药都标明作为防治青枯病的药剂，但从使用效果看，仍缺乏一定的专一性和特效性。从青枯病的物理及化学防治研究看，嫁接技术虽能有效的防治青枯病，但嫁接防病需花费大量劳动量和人力，并要有一定的嫁接技术，难以在农村推广。利用熏蒸、蒸汽消毒土壤，往往在杀死病原生物同时，有益生物也被杀死，从而破坏土壤的微生态平衡使土壤极易被再侵染。化学农药虽对生态有一定的负面影响，但就目前生物农药的应用来看，生物农药一时还难以取代化学农药，且现今许多所谓的生物农药都应归属于化学农药，如植物农药、昆虫信息素和抗生素农药，其主要活性成分均为化学结构明确的化学物质，在今后20年内化学防治仍是重要的植物保护手段(陈万义，2003)。尽管，化学农药在现今生产中仍被广泛应用，但在今后化学农药的发展方向上，应以超高效、高选择性、无公害的化学合成类绿色农药(绿色化学农药)为主，从而克服现今化学农药给生态环境所带来的负面影响。1.2.3 抑病土的研究土壤是一个极其复杂的环境，很久以前人们已认识到土壤与土传病害之间的关系。1892年Atkins首先发现棉花枯萎病受土壤抑制作用的现象，并对其作用机理进行了研究。在此之后，许多学者对土壤抑病性展开了研究，尤其上世纪70年代以来，关于抑病土壤的研究报道不断增加。在针对番茄青枯病抑病土壤的研究中发现，青枯病的发生与土壤质地有密切关系。番茄青枯病发生率往往随土壤沙性的增加而升高，随土壤粘性的增加而下降(廖咏梅，1997)。在特殊情况下，当土壤粘粒含量达35%以上，含水量、有机质、可溶解性营养物质高，渗透力差，作物生长不良时，粘性土壤也易于发病。蔡燕飞(2003)等通过在番茄连作地施用蛭石和沸石，对土壤理化性质影响微生物的机理作了详细的研究分析，认为施用沸石可以把细土和粘粒吸附到它的周围，形成微团聚体，改善了土壤微生物群落的生存空间，提高土壤微生物多样性，从而提高了土壤抑病能力；而蛭石(一种化学成分复杂的铁镁质铝硅酸盐矿物)施用土壤后，可使青枯菌更易于接近根系，导致青枯病加重；认为土壤质地的改变影响了青枯病的发生，而非其自身的元素组成。在番茄青枯病抑病土研究中还发现，具有抑菌作用的土壤并不一定能同时具备抑病作用(廖咏梅，1997)，推断青枯菌的致病性还与环境条件有很大的关系，土壤与寄主本身不同的生境条件可使青枯菌的致病性发生根本性的改变。土壤的抑病性除来自土壤质地外，还受不同品种根系分泌物及土壤微生物区系结构的影响。抗性品种在代谢中分泌的有机物可为土壤微生物提供丰富的养分，由于土壤微生物对这些有机物的利用率不同，从而使某些微生物大量繁殖改变土壤生态结构，这种土壤中微生物量及其活性和特定的微生物种群的改变，使土壤具有了抑病性(Handelsman and Stabb，1996 )。李长兴(1996)等在对棉花枯萎病的抑病土抑制进行研究发现，种植抗病品种10年以上的枯萎病圃中细菌、青霉、曲霉、放线菌的数量显著多于未植过棉花土壤，其中芽孢细菌比未植棉土多0.7倍，无芽孢细菌多1.9倍；真菌中青霉菌多0.6倍，曲霉菌多1.3倍；放线菌多0.8倍；并且在放线菌对枯萎病菌的拮抗作用测定中筛选出2株具有拮抗作用的菌株。从试验可以得出，土壤中微生态的改变使致病菌失去在菌间的竞争优势，从而将病原菌数量限制在一定范围内，对大多数致病菌而言，只有其浓度大于2.5105cfu/mL时才具有在寄主植株上定殖、侵染的可能，低于这一浓度即使有寄主存在，使寄主发病的机会也极少(David，1989)。同时，土壤微生物量与番茄植株生物量还有较好的相关性，土壤微生物生物量可以反映土壤养分有效性状况和土壤生物活性和功能(蔡燕飞，2003)。1.2.4 营养元素在植株抗病中的作用目前，在营养元素对植株抗病性的影响研究中，研究最多的为钾元素。钾在抗病虫害能力方面的作用在18世纪末就已发现，到目前为止，钾在植物抗病中的作用机理已可基本确认为三点：1)对植株生长期的改变。施钾可以使植物提前开花成熟，从而避开特定时期病原的侵染。2)对植株生理机械屏障的调节。施钾易使植物组织形成坚韧的角质层、坚硬的表皮层和厚实的细胞壁，促进木质化和硅质化作用，使茎秆变硬变厚等，从而达到对病原体的隔离作用。另外，钾及其伴随的阴离子在调节气孔关闭中也起着重要作用。3)对植物生长代谢中某些重要物质的调节作用。钾可促进低分子化合物(氨基酸、单糖等)转化为高分子化合物(蛋白质、糖类、纤维素、果胶、木质素、淀粉等)，这些物质的合成都是在含钾的酶促作用下完成的。酚类物质是植物重要的次生代谢产物 ，它在寄主与病原菌互作过程中的迅速积累是植物抗病性的一种表现(Lozovaya，2004；Terry，2004；Wurms，2005)。钾有利于作物组织中酚类物质的合成，增强抗病力。油菜施钾后叶片中酚类化合物的含量增加，且油菜黑斑病的发病率明显降低，叶片中的多酚化合物很可能是抑制油菜黑斑病致病菌Alternari brassicae孢子萌发的原因(Sharama and Kolte，1994 )。Ruan (1999) 等研究表明，茶叶片中多酚含量随施钾量的增加而增加。在烟叶中也发现K含量与总酚含量呈正相关(柴家荣，2004)。章永松(1998)等研究发现，施钾能明显提高棉籽中毒性物质棉酚的含量，且在施钾土壤中接种黄萎病菌后，抗性品种中棉酚积累速度高于耐性和感性品种，与棉花抗病性呈显著正相关。利用钾肥防治玉米青枯病的研究表明，在常规使用磷酸二铵和尿素的基础上，提高土壤中钾肥(氯化钾)的含量可使玉米在苗期对青枯病的抗性效果达8.34%41.79%，成株对青枯病的抗性效果达23.26%77.79%，并有随钾肥用量增加防效增强的趋势(梅丽艳，2003)。在青枯病防治中关注较多的另一元素为钙元素。钙是植物生长必需的中量营养元素，植物对钙的吸收仅次于钾。钙不仅是细胞膜的重要组成部分，能提高作物叶片的叶绿素和蛋白质含量(缪颖，1991)，更重要的是钙为偶联胞外信号与胞内生理生化反应的第二信使(Gong，1997)。近些年研究发现，当有外源Ca2+或Ca2+载体存在时，植物细胞能迅速生产O.和H2O2等活性氧分子，进而启动机体内其它信号，引起一系列保护性的生理反应，形成活性氧防御酶系统，从而避免活性氧的毒害作用(赵可夫，1993；程林梅，1998)。袁利和(19951997)等在抑病土对青枯病的抑制机理中研究发现，抑病土与感病土最显著的差异是碳酸钙含量，抑病土碳酸钙含量高达2%以上，其钙含量是感病土壤钙含量的27倍；在对这一现象的进一步研究中显示，在大田中加入碳酸钙不仅有抑制青枯病的作用，而且具有诱导植物抗性的作用。姚革(19921993)等自配以钙素为主的土壤添加剂(甘蔗渣4.4%，谷壳8.4%，贝壳粉4.25%，尿素8.25%，硝酸钾2.0%，过磷酸钙12.0%，硼砂0.3%，硫酸锌0.5%，生石灰5.0%，矿灰54.9%)用以防治青枯病的发生，结果表明土壤添加剂对烟草和番茄青枯病的防效分别高达59.6%和78.3%。在其它元素防治青枯病的作用研究中发现，二硝基苯胺类除草剂能诱导番茄植株对青枯病产生抗性(Cohen，1992)。尿素对青枯菌有很强的杀伤能力，在种植前利用尿素作为基肥，通过培土覆盖，使尿素释放出的氨气杀死青枯菌，可减少土壤的青枯菌的密度(廖咏梅，1997)，但尿素的施用时间与剂量有待进一步研究。1.3 植株对青枯病的抗病机制近几十年来，植病学者认识到植物的保护反应是复杂的新陈代谢过程，对病原物侵入及扩展的生理反应是以酶的催化活动而实现的。黄齐望认为植物和寄生物相互作用中化学物质是生理活性物质的基础。植物的抗病生理生化机制很复杂，植物体内正常情况下保护酶系处于平衡状态，而受病原物侵染后活性大大改变，这表明植株体内保护酶系都是在与病原物的互作中经病原物诱导而起抗病作用的(Doke，1983)。因而，在病原菌侵染初期测定保护酶系的变化可以作为植株抗性的一个选育指标；而正常植株酶活性的高低也可以作为品种筛选的指标之一。这些可作为品种筛选的酶常见的包括苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)和过氧化物酶(POD)等。在植株自身酶系对青枯病的影响研究方面，谢世勇(2003)通过研究番茄抗感品种(系)接种青枯菌前后酶活性及同工酶的变化表明，POD与PAL对青枯病的发生具有抑制作用，可以预测番茄对青枯病的抗性水平，两者的活性检测可作为抗青枯病品种选择的一项生理指标，从而有选择地进行繁殖和再生工作，减少盲目性。在利用无致病性青枯菌诱导番茄植株的抗性研究中也发现， 番茄在受到无致病力菌株处理后，体内与抗病反应有关的PAL，POD，PPO和SOD活性显著增强(陈庆河，2002)，这些酶活性的变化说明无致病力菌株处理番茄后激活了植物本身的抗病代谢过程，增加合成木质素、酚类物质和植保素及其氧化产物来抵制致病菌的侵染，从而产生诱导抗性。1.4 本研究的目的及意义番茄青枯病的防治长期以来都是许多学者探索的问题，虽然在各领域中对青枯病的防治均取得一定效果，但仍有不足之处，目前番茄青枯病仍然是生产上尚待解决的一大难题。过去，人们主要采用化学农药控制番茄土传病害，但随着化学农药大面积、全方位使用，使得靶标生物的抗药性逐渐增强，从而迫使人们不断研究毒性更强、浓度更高的化学农药来控制其发生，如此恶性循环导致对靶标生物的控制越来越难。同时，化学农药的长期使用势必严重影响自然生态平衡和生态系统的自我调节能力，化学农药的残留和对环境的释放也对人类的生命健康形成越来越大的威胁。为此，安全、低毒、易分解、不易产生抗药性的生物防治法迅速成为各国防治青枯病害的研究重点。然而从以上众多研究可以得出，青枯菌是一个分类复杂、易发生变异的土传病原菌。各菌种间在致病性、生理生化特征、菌体形态等各方面都存在大量差异，这种因病原菌自身基因变异而形成的差异，使得病原菌致病性和植物抗病性呈现一种矛盾运动，不仅导致了病原菌生物学的异质性，而且在植株侵染的生态位特性上也呈现出明