HPLC法同时测定防风中6个主要成分的含量-论文.pdf

药物分析杂志 C h i n J P h a r m A n a l 2 0 1 3 ， 3 3 ( 3 ) HP L C法同时测定 防风 中 6个主要成分的含量 赵博 ， 杨鑫宝 ， 杨秀伟 ， 张连学 ， 刘建勋。 ( 1 北京大学天然药物及仿生药物国家重点实验室 药学院天然药物学系， 北京 1 0 0 1 9 1 ； 2 吉林农业大学中药材学院， 长春 1 3 0 1 1 8 ； 3 北京中医药大学， 北京 1 0 0 0 2 9 ； 4 中国中医科学院西苑医院， 北京 1 0 0 0 9 1 ) 摘要 目的： 建立 H P L C D A D法同时测定中药防风中升麻苷、 升麻素、 5 0一 甲基维斯阿米醇苷、 印枳树皮苷、 防风灵和亥茅 酚苷 6个主要有效成分的含量。方法： 采用正交设计优化提取方法 ， 以提取时间、 方法、 次数、 溶剂比为主要影响因素， 以6个 分析物的总量为评价指标； 分析物的色谱分离用 D i k m a D i a m o n s i l 。 C l 8 色谱柱( 2 5 0 mm 4 6 m m， 5 tx m) 、 D i k m a E a s y G u a r d C 1 8 保护柱( 2 0 mm 4 6 h i m， 5 m) ， 以甲醇 一 水为流动相， 梯度洗脱， 流速为1 0 m L ra i n ， 检测波长为 2 5 4 n m， 柱温为 2 5。 结果： 确定最佳提取方法为甲醇 3 O倍量回流提取2次， 每次 2 h 。6 个分析物的线性范围分别为： 升麻苷5 01 0 0 0 m g L 。 。 ( r = 0 9 9 9 9 ) ， 升麻素 1 0 2 0 0 m g L ( r = 0 9 9 9 9 ) ， 50一甲基维斯阿米醇苷2 05 0 0 mg L 。 ( r= 0 9 9 9 9 ) ， 印枳树皮苷 51 0 0 m g L ( r = 0 9 9 9 5 ) ， 防风灵 51 0 0 mg L ( r = 0 9 9 9 1 ) ， 亥茅酚苷 1 0 2 0 0 mg L ( r：0 9 9 9 5 ) ； 平均加样回收率( n= 3 ) 均在 9 5 6 1 0 6 8 ， R S D均在 1 3 4 8 。结论： 该方法准确， 灵敏度高， 重复性好 ， 成本低， 可用于防风中上述 6个 主要有效成分的含量测定。 关键词： 防风； 香豆素； 色原酮； 升麻苷； 升麻素； 5一O一甲基维斯阿米醇苷； 印枳树皮苷 ； 防风灵； 亥茅酚苷； 高效液相色谱； 定 量分析 中图分类号 ： R 9 1 7 文献标识码： A 文章编号 ： 0 2 5 4 1 7 9 3 ( 2 0 1 3 ) 0 3 0 3 8 2 0 6 S i mu l t a n e o u s d e t e r mi n a t i o n o f s i x ma j o r c o n s t i t u e n t s i n t h e r o o t s o f S a po s h n i k o v i a d i v a r i c a t a b y HPLC Z HAO B o ， YA NG Xi nb a o ， YANG Xi uw e l ， Z HANG L i a nx u e ， L I U J i a nx u n 。 ， ( 1 S t a t e K e y L a b o r a t o r y o f N a t u r al a n d B i o mi me t i c D r u g s ， D e p a r t m e n t o f N a t u r a l Me d i c i n e s ， S c h o o l o f P h a r ma c e u t i c a l S c i e n c e s ， P e k i n g U n i v e r s i t y ， B e ij i n g 1 0 0 1 9 1 ， C h i n a ； 2 C o l l e g e o f C h i n e s e Me d i c i n a l Ma t e r i a l s ， J i l i n A g c u l t u r al U n i v e rs i t y ， C h a n g c h u n 1 3 0 1 1 8 ， C h i n a ； 3 B e i j i n g U n i v e rs i t y o f C h i n e s e Me d i c i n e s ， B e i j i n g 1 0 0 0 2 9， C h i n a ； 4 X i y u a n Ho s p i t a l ， C h i n a A c a d e m y o f C h i n e s e Me d i c a l S c i e n c e s ， B e i j i n g 1 0 0 0 9 1 ， C h i n a ) A b s t r a c t O b j e c t i v e ： T o d e v e l o p a n H P L CD A D m e t h o d f o r s i m u l t a n e o u s d e t e r m i n a t i o n o f s i x m a i n b i o a c t i v e c o n s t i t u e n t s ( p r i m 一0一g l u c o s y l c i mi f u g i n ， c i mi f u g i n ， 4 一O一 3一D g l u c o s y l一5一Ome t h y l v i s a mm i n o l ， m a r me s i n i n ， s a p o d i v a r i n ， a n d s e c一0一g l u c 0 s y l h a m a u d o 1 ) i n t h e r o o t s o f S a p o s h n i k o v i a d i v a r i c a t a( T u r c z ) S c h i s - c h k ( S a p o s h n i k o v i a e R a d i x ) Me t h o d s ： T h e o r t h o g o n a l a r r a y d e s i g n w a s u s e d t o o p t i mi z e t h e e x t r a c t i n g p r o c e s s Th e ma i n i n flu e n t i a l f a c t o r s o f e x t r a c t i o n e f f i c i e n c y we r e e x t r a c t i n g t i me， me t h o d， t i me s a n d s o l v e n t r a t i o Th e c o n di t i o n s o f t h e e x t r a c t i o n we r e e v a l u a t e d o n t h e t o t a l c o n t e n t o f t h e s i x a n aly t e s A Di k ma Di a mo n s i l 州 C1 8 c o l umn ( 2 5 0 m m x 4 6 mm， 5 tx m) w i t h a D i k m a E a s y G u a r d C 1 8 c o l u m n ( 2 0 m m x 4 6 m m， 5 m) w a s u s e d for c h r o ma t o g r a p h i c s e p a r a t i o n o f t h e s i x a n a l y t e s T h e mo b i l e p h a s e， c o n s i s t i n g o f me t h a n o l w a t e r ， wa s p r o g r a mme d f o r a gra d i e n t e l u t i o n T h e fl o w r a t e wa s 1 0 mLmi n。 。 ， t h e d e t e c t i o n wa v e l e n g t h wa s a t 2 5 4 n m， a n d t h e c o l u mn t e mp e r a t u r e w a s 2 5 Re s u l t s ： T h e a n a l y s i s i n d i c a t e d t h a t t h e o p t i mu m c o n d i t i o n s o f t h e s i x a n a l y t e s w e r e t o r e fl u x w i t h 3 0 f o l d s o l v e n t me t h a n o l t w i c e a n d for 2 h o u r s a t e a c h t i me T h e l i n e a r i t y wa s a c h i e v e d i n t h e r a n g e o f 5 01 0 0 0 mg L一 ( r= 0 9 9 9 9 ) fo r p r i m一0一g l u e o s y l c i mi f u g i n ， 1 02 0 0 mg L 一 ( r=0 9 9 9 9 ) for c i mi f u g i n ， 2 0 5 0 0 m g L一 ( r = 0 9 9 9 9 ) for 4 一0一卢 一D g l u c o s y l一5一Om e t h y l v i s a m mi n o l ， 51 0 0 m gL一 ( r =0 9 9 9 5 ) fo r “ 十二五” 国家科技支撑专项( 2 O l l B A 10 7 B 0 8 ) 中药材质量评价体系建立及其质量标准示范研究 通讯作 者T e l ： ( 0 1 0 ) 8 2 8 0 5 1 0 6 ； Ema i l ： x w y a n g b j m u e d u e n 药物分析杂志 C h i n J P h a r m A n a l 2 0 1 3 ， 3 3 ( 3 ) ma r m e s i n i n ， 51 0 0 mg- L 一 ( r= 0 9 9 9 1 ) f o r s a p o d i v a r i n ， a n d 1 0 2 0 0 mg L一 ( r= 0 9 9 9 5 ) fo r S e C一0一g l u c o s y l h a m a u d o 1 T h e a v e r a g e r e c o v e ri e s ( =3 ) w e r e 9 5 6 一1 0 6 8 w i t h R S D o f 1 3 一 4 8 C o n c l u s i o n： Th e me t h o d d e v e l o p e d i s a c c u r a t e， h i g h l y s e n s i t i v e， we l l r e p r o du c i b l e a n d l o w c o s t ， wh i c h c a n b e u s e d for t h e d e t e r mi n a t i o n o f t h e s i x a b o v eme n t i o n e d b i o a c t i v e c o n s t i t u e n t s i n S a p o s h n i k o v i a e Ra d i x Ke y wo r d s： r o o t o f S a po s hn i k o v i a d i v a r i c at a； c o u ma r i n s； c h r o mo ne s； pr i m 一0 一 g l u c o s y l c i mi f u g i n； c i mi f ug i n； 4 一 O一 卢一D g l u c o s y l 一5一Ome t h y l V i s a mm i n o l ； ma r me s i n i n ； s a p o d i v a r i n ； $ e c一0一g l u c o s y l h a ma u d 0 l ； H P L C； as s a y 防风 ( S a p o s h n i k o v i a e R a d i x ) 为传 统 中药之 一 ， 系 伞 形 科 植 物 S a p o s h n i k o v i a d i v a r i c a t a( T u c r z ) S c h i s c h k 未抽花茎的干燥根； 始载于 神农本草 经 ， 列为上品， 辛、 甘、 微温， 归膀胱、 肝、 脾经； 具有 解表散风 、 胜湿止痛、 祛风止痉之功效。现代药理学 研究表 明防风具 有镇痛 、 抗炎 、 抑菌、 抗肿瘤等生物 学活性 _ 1 I 2 J ， 物质基础研究表 明其含有香 豆素和色 原酮两大类化学成分 I 4 J 。为阐明物质基础与生物 学活性的密切相关性 ， 物质基础 的定量分 析非 常重 要。文献 报道 了采用高效液相色谱 ( H P L C) 法 同时定量分析升麻苷 ( p r i m一0一 g l u e o s y l c i m i f u g i n ) 、 升麻素( c i mi f u g i n ) 、 5一O一甲基维斯阿米醇苷 ( 4 ， _ O一 一 D g l u c o s y l 一5一Om e t h y l v i s a m mi n o 1 ) 和亥 茅酚苷 ( s e c一0一 u c o s y 1 h a m a u d 0 1 ) 4个化学成 分。 人源肠 C a c o一 2细胞单层吸收模 型研究表明色原酮 类 的升麻苷和亥茅酚苷具有 中等程度的吸收性 ， 提示它们可以进入血液循环发挥生物学活性 ； 升麻 苷和 5一O一甲基维斯阿米醇苷均具有明显 的解热 、 镇痛、 抗炎及抗血 小板凝 聚作 用 J ， 与防风 的临床 应用相吻合。此外， 中国药典 2 0 1 0年版一部 规定 防风的质量分析以升麻苷和 50一甲基维斯阿米 醇苷为指标性成分。考虑到化合物结构类型的代表 性 ， 防风灵 ( s a p o d i v a r i n ) 为防风的特异性化学成分 和生物活性 以及防风发挥生物学作用的物质基础的 可能性 ， 本项研究选择升麻苷 、 升麻素、 50一甲基 维斯 阿米醇苷、 印枳树皮苷 ( m a r m e s i n i n ) 、 防风灵和 亥茅酚苷 6个化学成分 同时进行 H P L C定量分析 ， 更符合中药复杂体系的多指标质量控制发展趋势 。 1 仪器与试药 D I O N E X U l t i m a t e 3 0 0 0型 H P L C仪 ( 德 国) ， 配 置四元梯度泵 、 二极管阵列检测器 ( D A D) 、 柱温箱 、 自动 进 样 器、 C h r o m e l e o n色 谱 工 作 站 ( v e r s i o n 6 8 0 ) ； L G J 0 5冷冻 干燥 机 ( 北 京 四环科 学 仪器 厂) ； X S 1 0 5 型 电 子 分 析 天 平 ( Me t t l e r T o l e d o ) ； K Q 5 2 0 0 超声波清洗仪( 昆山市超声仪器有限公司； 功率2 5 0 W， 频率4 0 k H z ) 。对照品升麻苷、 升麻素、 50一甲基维斯 阿米醇苷 、 印枳树皮苷、 防风灵和 亥茅酚苷均为本课题组 由防风 自制 I 4 J ， 通过 MS 、 N MR等谱学数 据确定其 结构 ， 化 学结构式见 图 1 ； H P L C峰面积归一化法计算其纯度 均大于 9 8 0 。 甲醇为色谱纯； H P L C用水为超纯水； 其余试剂均为 分析纯。 道地产区药材防风于 2 0 0 7年 9月采 自内蒙古 的东乌旗和海拉尔， 商品药材防风购于河北安国中 药材市场， 经吉林农业大学中药材学院张连学教授 O 0 H 6 o一 口一 D g l u c o s y l 一 5一Om e t h y l v i s a mm i n o 1 ) 鉴定为伞形科植物 S a p o s h n i k o v i a d i v a r i c a t a ( T u c r z ) S c h i s c h k 的干燥根， 凭证标本存放在吉林农业大学 中药材学院。 - 3 8 4 药物分析杂志 C h i n J P h a r m A n a l 2 0 1 3 ， 3 3 ( 3 ) 2 方法与结果 2 1 色谱条件 采用 D i k m a D i a m o n s i l 。 。 。 C 色谱 柱 ( 2 5 0 m m 4 6 mm， 5 m) 和 D i k ma E a s y G u a r d C 1 8 保护柱 ( 2 0 mm4 6 m E， 5 m) ， 流动相 A为 甲醇 ， 流动 相 B为水 ， 线 性梯度 洗脱 ( 01 5 mi n ， 4 5 A 6 0 A； 1 54 0 mi n ， 6 0 A 8 O A) ， 流 速 1 0 mL m i n ， 检测波长 2 5 4 n m， 柱温 2 5 ， 进样量 2 0 L 。 2 2 溶液的制备 2 2 1 对照品储备液精密称 取升麻苷 4 7 m g 、 升麻素 3 1 m g 、 50一甲基维斯阿米醇苷 4 5 m g 、 印枳树皮苷 4 i m g 、 防风灵 4 8 m g 、 亥茅酚苷 4 4 m g ， 加 甲醇分别配制成 质量浓度依次 为 4 7 、 3 1 、 4 5 、 4 1 、 4 8 、 4 4 m g mL 的 6个对照品储备液。 2 2 2 正交设计优化提取条件根据从防风药材 中分离得到的色原酮类化合物及其苷在 甲醇中溶解 度 良好 ， 在预实验中采用 H P L C检测发现与乙酸 乙 酯和三氯甲烷相 比， 甲醇能将 防风药材中含量较高 的化合物提取得更完全， 设计 了四因素三水平表 ( 表 1 ) ， 固定提取溶剂为 甲醇 ， 探讨 不同提取方法 、 提取时间、 提取次数和溶剂倍量 ， 以分析物峰面积总 和为指标 ， 优化 了提取条件 ， 正交试验结 果见表 2 。 由表 2结果 ， 确定最优提取方法 为 A ， B c D ， 即用 药材 3 0倍量的甲醇 回流提取 2次 ， 每次 2 h 。 表 1 L ( 3 ) 正 交试验结果 T a b 1 R e s u l t s o f L q ( 3 ) o r t h o g o n a l e x p e r i me n t 方差来源 离差平方和 自由度 F比 ，临界值 显著性 ( s o u r c e o f v a r i a t i o n ) ( s u m o f s q u a r e s o f d e v ia t i o n s ) ( d e e e o f f r e e d o m) ( F r a t i o ) ( c ri t i c a l v a l u e o f F ) ( s i g n i fi c a n c e ) 2 2 3 供试 品溶液 取生药防风粗粉 ( 过 2 0目 筛) 约5 0 g ， 精密称定， 置圆底烧瓶中， 精密加甲醇 1 5 0 m L ， 加热 回流 2 h ， 滤过 ， 滤渣再用甲醇 1 5 0 m L， 同法提取 1 次， 合并滤液， 减压回收溶剂， 残渣用甲 醇溶解， 转移至2 5 m L 量瓶中， 加甲醇至刻度， 摇匀， 滤过， 取续滤液 ， 即得 。 2 3 系统适用性试验分别取混合对照品溶液和 供试品溶液各 2 0 ， 在“ 2 1 ” 项色谱条件下， 注入 H P L C仪测定， 记录色谱图， 见图2 。本实验条件下， 供试品溶液色谱中与各对照品对应的吸收峰的理论 塔板数均不低于3 0 0 0 ， 对应的色谱峰的分离度均大 于 1 5 。 药物分析杂志 C h i n J P h a r m A n a l 2 0 1 3 ， 3 3 ( 3 ) - 3 8 5- 1 A 7 6 一 几 图2 对照品( A ) 和防风样品( B ) 典型的H P L C色谱图 F i g 2 T y p i c a l HP L C c h r o ma t o g r a ms o f r e f e r e n c e s u b s t a n c e ( A) and S a p o s h n i k o v i a e R a d i x s a m p l e ( B) 1 6 化合物名称和化学结构见图 1 ( t h e n am e s a n d c h e mi c a l s t r u c t u r e s o f t h e a n a l y t e s s h o w n i n F i g 1 ) 2 4 线性关系考察及定量限试验分别精密吸取 6个对照品储备液适量 ， 置于同一量瓶 中， 用 甲醇制 备成系列混合对照品溶液： 升麻苷的质量浓度为 5 0 、 1 0 0 、 2 0 0 、 5 0 0 、 1 0 0 0 mg L； 50一甲基维斯阿 米醇 苷 的质 量 浓度 为 2 0 、 5 0 、 1 0 0 、 2 0 0 、 5 0 0 m g L ； 印枳树皮苷 和防风灵的质量浓度 为 5 、 1 0 、 2 O 、 对照品溶液各 2 0 ， 在“ 2 1 ” 项色谱条件下进样测 定 ， 记录峰面积 ， 以峰面积积分值 y为纵坐标 ， 对应 的对照 品质量浓度 ( m g L ) 为横坐标 ， 进行 回 归分析， 得回归方程、 相关系数( r ) 及线性范围， 见 表 3 。将混合对照品溶 液依 次稀释至不 同浓度 ， 按 “ 2 1 ” 项下的色谱条件分别注入 H P L C仪测定， 确 5 0 、 1 0 0 m g L 一； 升麻素和亥茅酚苷的质量浓度为 定检测下限( 信噪比3 ： 1 ) 和定量下限( 信噪比1 O ： 1 O 、 2 O、 5 0 、 1 0 0 、 2 0 0 m g L 。精密吸取此系列混合 1 ) ， 结果见表 3 。 表3 6个分析物的线性关系 Ta b 3 Li n e a r i t y c o r r e l a t i o n s o f t h e s i x a n a l y t e s 升麻苷 ( p r i n t 一0一g l u c o s y l c i mif u g i n ) 升麻素 ( c i m i f u g i n ) 5 0一甲基维斯阿米醇苷 ( 4 一O一 口一 D g l u c o s y l 一 5 一 O m e t h y lv i s a m m i n o 1 ) 印枳树皮苷 ( m a r m e s i n i n ) 防风灵 ( s a p o d iv a r i n ) 亥茅酚苷 ( s e c 一 0一g l u c o s y l h a m a u d o 1 ) Y=0 1 5 8 9 X 一0 3 4 0 9 0 9 9 9 9 Y=0 3 0 8 9 X 一0 2 0 5 3 0 9 9 9 9 Y=0 4 0 2 7 L X + 0 4 7 1 8 0 9 9 9 9 Y=0 1 7 2 8 L X一0 0 4 0 7 0 9 9 9 5 Y=0 2 2 5 4 L X一0 1 1 21 0 9 9 9 1 Y=0 1 1 7 8 L X一0 1 5 3 7 0 9 9 9 5 1 0 2 0 o 2 0 5 0 0 51 0 o 51 o o 1 02 o 0 0 2 l 0 1 8 0 1 5 - - 3 8 6- 药物分析杂志 C h i n J P h a r m A n a l 2 0 1 3 ， 3 3 ( 3 ) 2 5 精密度精密吸取低 、 中、 高 3个浓度 的混合 份供试 品溶液 ， 在“ 2 1 ” 项色谱条件下 ， 进样 2 0 ， 对照品溶液( 升麻苷和 5 0一甲基维斯阿米醇苷为 测定升麻苷、 升麻素、 5 0一甲基维斯阿米醇苷、 印 1 0 0 、 2 0 0 、 5 0 0 m g L ； 印枳树皮苷和防风灵为 1 O 、 枳树皮苷、 防风灵和亥茅酚苷的峰面积。所得峰面 2 0 、 5 0 mg L ； 升麻素和亥茅 酚苷为 5 0 、 1 0 0 、 2 0 0 积 的 R S D 分 别 为 1 3 ， 2 8 ， 3 9 ， 2 4 ， m g L ) ， 在“ 2 1 ” 项色谱条件下进样测定。1 d内4 3 ， 4 7 ， 表明方法 的重复性 良好。 重复进样 3 次， 测定各对照品峰面积， 计算 日内精密 2 7 稳定性试验取同一供试品溶液 2 0 ， 分别 度 ， 所 得 峰 面 积 的 R S D 分 别 为 ： 升 麻 苷 4 6 、 在制备后 0 、 2 、 4 、 8 、 1 2 、 2 4 、 4 8 h ， 在 “ 2 1 ” 项 色谱 条 6 1 、 4 9 ； 升麻素 2 9 、 5 2 、 4 5 ； 50一甲 件下进样测定升麻苷 、 升麻 素、 50一甲基维斯 阿 基维斯阿米醇苷 3 0 、 4 1 、 4 6 ； 印枳树皮苷 米醇苷、 印枳树皮苷 、 防风灵和亥茅酚苷 的峰面积。 4 2 、 4 6 、 5 1 ； 防风灵 4 4 、 5 1 、 5 0 ； 所得 峰 面积 的 R S D 分别 为 1 3 、 0 9 ， 0 9 、 亥茅酚苷 3 8 、 4 0 、 4 4 。1 d内进样 1次 ， 连 1 4 、 2 9 ， 1 7 ， 表 明供试 品溶 液在 4 8 h内稳 续进样 3 d ， 测定各对照品峰面积 ， 计算 日间精密度 ， 定性 良好 。 所得峰面积的 R S D分别为升麻苷 4 3 、 5 1 、 2 8 加样回收率试验精密称取 l 2 份已知含量的 5 8 ； 升麻素 4 6 、 4 5 、 4 0 ； 50一甲基维 生药防风样品( 每份 5 0 g ) ， 3份作 为对 照， 另外 9 斯 阿 米 醇 苷 3 7 、 3 2 、 3 7 ； 印 枳 树 皮 苷 份分成低、 中、 高 3组 ( n= 3 ) ， 分别加入低 、 中、 高 3 4 1 、 5 2 、 4 6 ； 防风灵 3 9 、 3 3 、 5 1 ； 个不 同浓度的混合对照品溶液 ， 按“ 2 2 3 ” 项下方法 亥茅酚苷 3 0 、 4 5 、 3 6 。说明精密度良好。 制备供试溶液， 在“ 2 1 ” 项色谱条件下， 进样2 0 ， 测 2 6 重复性试验按“ 2 2 3 ” 项下方法平行制备 6 定 6 个分析物的峰面积， 计算回收率， 结果见表4 。 表 4 6个分析 物的加样 回收 率( ， l = 3 ) Ta b 4 Re c o ve r i e s f o r t he s i x an al yt e s 2 9 样品测定取 3个不 同来 源的生药防风粗粉 样品各5份， 每份 5 0 0 g ， 按“ 2 2 3 ” 项下方法制备 供试品溶液。取供试品溶液各 2 0 ， 在“ 2 1 ” 项色 谱条件下测定 6 个分析物的峰面积， 以外标法计算 含量， 结果见表 5 。 3 讨论 3 1 定量分析方法 的选 择 分析物升麻 苷、 升麻 素、 5 0一甲基维斯阿米醇苷、 印枳树皮苷、 防风灵 和亥茅酚苷分子结构 中具有共轭系统， 能够满足 D A D检测的要求； 在含有防风的中成药“ 康泰胶囊” 质量控制中采用 H P L C法测定升麻苷和50一甲 基维斯阿米醇苷的含量 ， “ 复方乌龙胶囊” 质量控 制中采用薄层色谱法检测防风_ 1 。从精确性、 成本 低、 普及性和易于推广等方面考虑， 本文选择 H P L C 药物分析杂志 C h i n J P h a r m A n a l 2 0 1 3 ， 3 3 ( 3 ) - 3 8 7- 表 5 生药防风中6个分析物的含量( mg g ， n= 5 ) Ta b 5 Re s u l t s o f c o n t e n t d e t e r mi n a t i o n o f t h e s i x a n a l y t e s i n c r u d e d ru g S a p o s h n i k o v i a e Ra d i x D A D法定量分析 上述 6个化学成分 。经在线全波 长紫 外 吸收 光 谱 扫 描 分 析 ， 上述 6个 分 析 物 在 2 5 4 n m有 良好的紫外 吸收强度 ， 因此 ， 采用 2 5 4 n m 为本试 验 的波 长检测 。比较 了 D i k ma D i a m o n s i l C 1 8 ( 2 5 0 mm4 6 m m， 5 p m) 、 Wa t e r s S y m m e t r y C 1 8 ( 2 5 0 mm x 4 6 mm， 5 p m) 和 D i o n e x A c c l a i m 1 2 0 C 1 8 ( 2 5 0 mm 4 6 m m， 5 m) 等色谱柱对上述 6个分 析物的分离效果 ， 结果表明无 明显差异 。从成本低 和普及性等方面考虑 ， 采用 D i k ma D i a mo n s i l C 为 本试验的色谱柱。比较了甲醇 一水 、 甲醇 一 0 1 磷 酸水溶液、 乙腈 一水等洗脱系统 ， 发现甲醇 一水和乙 腈 一水洗脱系统都能达到 良好 的基线分离 ， 但在 甲 醇 一 0 1 磷酸水溶 液洗脱系统 ， 5一O一甲基维斯 阿米醇苷和印枳树皮苷未达到分离度要求。从成本 低和易于推广等方 面考虑 ， 采用 甲醇 一水洗脱系统 为本试验的流动相 。考察了恒速和梯度洗脱对上述 6个分 析物的分离效果 ， 结果 以梯度洗脱分离度最 佳 ， 最终采用 了“ 2 1 ” 项下的梯度洗脱程序 。 3 2 样品前处理 由于生药防风 中含有大量的多 糖和单宁等 ， 难 以直接进行 H P L C分 析。采用 甲醇 为提取溶剂， 则样品较清洁， 又兼顾了甲醇对色原酮 和香豆素类化合物提取率高的特性 。因此 ， 本 文选 择 甲醇为提取溶剂。通过正交设计对提取工艺纯化 参数优化， 确定了最佳提取参数组合。从方差分析 结果可知， 提取因素重要性主次顺序为 B C A D ， 因此确定最优提取方法为 A B c ， D 。 3 3 方法 的可用性本文建立 的 H P L CD A D定 量分析方法 ， 经方法学验证 具有灵敏度 高、 重复性 好 、 快速 、 准确的优点 ， 适用于防风的质量控制 ， 亦为 含有 防风的中成药质量控制方法 的建立提供 了可资 借鉴 的方法。 参考文献 1 Z H AN G B a o d i ( 张宝娣 )， WA N S h a nh o n g ( 万 山红 ) R e c e n t a d v a nc e i n c h e mi c a l c o n s t i t u e n t s a n d p h a r ma c o l o g i c a l s t u d i e s o f t h e r o o t o f S a p o s h n i k o v ia d i v a r i c a t a ( 防风 的化 学成 分与 药理 研究 近 况 ) T r a d i t C h i n Me d ( 中医药信息 ) ， 2 0 0 3 ， 2 0 ( 4 ) ： 2 3 2 G AO H o n g x i a ( 高鸿霞)， S H AO S h i h e ( 邵世和 ) ， WA N G G u o q i n g( 王 国 庆 ) R e s e a r c h p rog r e s s o f S a p o s h n i k o v i a d i v a r i c a t a ( T u r c z ) S c h i s c h k ( 中药防风 的研究 进展 ) J J i n g g a n g s h a n Me d C o l l ( 井 冈山医专学报 ) ， 2 0 0 4 ， 1 1 ( 4) ： 1 2 3 Z H AO B o ( 赵博 )， Y A N G X i nb a o ( 杨 鑫宝 ) ， Y AN G X i uw e i ( 杨秀伟 ) ， e t a 1 S a p o d i v a r i n ， a n e w c o u m a r i n f r o m r o o t s o f S a p o s h n i k o v i a d i v a r i c a t a ( 防风灵 一防风中 1个新 的香 豆素类化合 物) C h i n a J C h i nMa t e r Me d ( 中国中药杂志)， 2 0 1 0 ， 3 5 ( 1 1 ) ： 1 4 1 8 4 Z H AO B o ( 赵博 )， Y A N G X i nb a o ( 杨鑫 宝 ) ， Y A NG X i uw e i ( 杨 秀伟 ) ， e t a 1 C h e mi c a l c o n s t i t u e n t s o f r o o t s o f S a p o s h n i k o v i a d i v a r i c a t a ( 防风化学成分的研究 ) C h i n a J C h i n Ma te r Me d ( 中国中 药杂志 ) ， 2 0 1 0， 3 5 ( 1 2) ： 1 5 6 9 5 Z E N G L i j a n ( 曾丽君 ) ， S U N Q i s h i ( 孙 启时 ) ， J I A L i n gy u n ( 贾凌云 ) C o n t e n t d e t e r mi n a t i o n o f f o u r c o mp o n e n t s f r o m d i f f e r e n t h a b i t a t s a n d d i f f e r e n t p a r t s o f S a p o s h n i k o v i a d i v a r i c a t a( T u r c z ) S c h i s c h k b y R PH P L C ( R PHP L C法 同时测定不 同产地 及不 同部位 防风 中 4种 有效成 分 的含量 ) J S h e n y a n g P h a r m U n iv ( 沈 阳药科大学学报) ， 2 0 0 9 ， 2 6 ( 2 ) ： 1 2 7 6 L I Y