【硕士论文】Bax基因重组腺病毒表达载体的构建及其对包装细胞.pdf

浙江大学硕士研究生学位论文 B a x 基因重组腺病毒表达载体的构建及其对包装细胞H E K 2 9 3 的毒性作用 浙江大学医学院外科学( 神经外科) 2 0 0 1 级硕士研究生陈鹏 导师刘伟国教授 中文摘要 O l t v a i 等于1 9 9 3 年用B c l 2 基因蛋白产物B c l 2 特异性单克隆抗体免疫沉淀等方 法，从人和鼠B 细胞中发现一种与B c I 2 共沉淀的( 2 1K D ) 蛋白质，命名为B a x ( B c l a s s o c i a t e dX p r o t e i n ) ，与B c I 2 促细胞存活的作用相反，B a x 促细胞死亡。细胞 内B a x 和B e l 2 的比值是影响细胞凋亡的关键。胶质瘤细胞中B c l 2 的高表达，B a x 的相对低表达，B e l 2 B a x 比例的失调与胶质瘤的组织学级别，肿瘤转移能力，肿瘤生 长速度，肿瘤复发以及肿瘤对于放疗，化疗的反应性均具有密切关系。如果能够在肿 瘤细胞中提高B a x 基因的表达，将促进肿瘤细胞的凋亡，提高肿瘤细胞对于放疗、化 疗的敏感性。人类腺病毒是双链D N A 病毒，具有转染靶细胞后以附加体( e p i s o m e ) 形 式存在，极少发生插入突变，载体操作方便、容易繁殖，宿主范围广，既可感染分裂 细胞，又可感染非分裂细胞，携带外源基因容量大，可表达接近翻译后成熟水平蛋白 质等优点，复制缺陷性腺病毒由于其在非包装细胞中不能复制，避免了对周围正常细 胞的感染，成为现阶段最好的基因治疗载体之一。我们以复制缺陷性腺病毒为基因转 移载体，以人类巨细胞病毒早期启动子为真核基因表达启动子，以B a x 旺基因为治疗 基因，构建B a x c t - p S h u t t l e - A d e n o 重组腺病毒表达载体，并且证明其具有较高的目的 基因转录和表达活性，同时发现由于重组病毒载体B a x t , 的表达先于病毒本身复制和 包装的发生，以及B a x 蛋白对于包装细胞H E K 2 9 3 的毒性作用，导致包装细胞的死 亡，而病毒本身尚未完成复制和包装，致使病毒扩增受阻，不能达到基因治疗所需的 病毒浓度。这提示我们在将来的实验中可以通过以可控的启动子代替C M V 启动子， 使含B a x a 基因的重组腺病毒在包装细胞H E K 2 9 3 细胞中不表达或低表达，避免B a x 浙江大学附属第二医院 浙江大学硕士研究生学位论文 蛋白对于H E K 2 9 3 细胞的致死性毒性，使重组体得以包装和扩增，从而得到足够的病 毒量进行胶质瘤的基因治疗。 实验材料和仪器 1 主要试剂：B a x c t 基因全序列由浙江大学生命科学学院潘杰教授惠赠，T G l 菌 为浙江大学生命科学学院生物化学研究所保存，A d c n o x m 表达载体( 美国B D B i o s c i e n c e s 公司) ，H E K 2 9 3 细胞( 中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所) ， D M E M 培养液、1 6 4 0 培养液、胎牛血清( 美国I n v i 仃o g e n 公司) ，D O S P E R 阳离子 脂质体( 瑞士R o c h e 公司) 。X - g a l 试剂、M T T 试剂( 美国A r n r e s c o 公司) ，B a x ( B 9 ) 鼠抗人单克隆抗体、W e s t e r nB l o t t i n g 荧光显影试剂盒( 美国S a n t aC r u zB i o t e c h n o l o g y 公司) ，辣根酶标记山羊抗小鼠I g G ( H - L ) ( 北, 京中山生物技术有限公司) ，P a cI 限制性 内切酶( 美国N E WE N G L A N DB i o t e c h n o l o g y 公司) 。限制性内切酶X b aI 、I C p nI 、 B a m HI 、P s tI ，D N A M a r k e r D L 2 0 0 0 ，D N A M a r k e r D L l 5 0 0 0 ( 大连宝生物工程有限公 司) 。 2 试验仪器：3 5 2 型酶标仪( 芬兰L a b s y s t c m sM u l t i s k a n 公司) ，T C 2 3 2 3 二氧化 碳生化培养箱( 美国S H E L L A B 公司) ，U V - 2 4 0 1 P C 紫外分光光度计( 日本岛津公司) ， X - 2 2 R 冷冻离心机( 德国B e c k m a n 公司) ，P C R 扩增仪( 杭州宝诚科技有限公司) ，Y J 一8 7 5 型医用净化工作台( 苏州长桥净化设备厂) 。 实验方法 用一次性塑料培养瓶，含1 0 胎牛血清的高糖D M E M ，按常规方法培养H E K 2 9 3 细胞，每3 天传代1 次。以X b a I K p nI 双酶切p S h u t t l e 质粒，将双酶切的p S h u t t l e 质粒与潘杰教授惠赠的B a x c t 基因进行连接反应，以B a m I - II 和P s tI 酶切鉴定。以 PI S e eI I C e uI 双酶切B a x a p S h u t t l e 重组体，电泳并回收含B a x a 的片断，连接回 收的B a x 片断和已经P I S c e I I - C e u I 双酶切的A d e n o X 基因，P C R 鉴定。以同样 浙江大学附属第二医院 浙江大学硕士研究生学位论文 方法构建L a c Z p S h u t t l e - A d e n o 重组腺病毒载体，P C R 鉴定。提纯B a x p S h u t t l e - A d e n o 重组腺病毒质粒后( 3 0 7 ug u1 ) ，以P a eI 酶切，苯酚：氯仿：异戊醇( 2 5 ：2 4 ：1 ) 提纯酶 切产物，提纯后浓度为1 6 8 p u 1 。以D o s p e r 阳离子脂质体转染重组载体进H E K 2 9 3 细胞，5 天和8 天后换液，1 0 天后传代，离心收集每次换液时脱落的细胞。咀同样的 方法转染L a c Z p S h u a l e - A d e n o 重组腺病毒载体进入H E K 2 9 3 细胞。W e s t e r nB l o t 检测 B a x 一p S h u t t l e A d e n o 重组腺病毒载体在H E K 2 9 3 细胞中的表达。X g a l 底物显色法检 测L a c Z p S h u R l e A d e n o 重组腺病毒载体在H E K 2 9 3 细胞中的表达。M T T 法测定B a x a p S h u R l e A d e n o 重组腺病毒载体对H E K 2 9 3 细胞的毒性作用。试验数据利用T h e S A S S y s t e m f i ) rW i n d o w s V 8 统计软件包进行统计学分析。 结果 第1 组( H E K 2 9 3 细胞转染B a x - p S h u t t l e A d e n o 重组腺病毒载体后换液时离心 收集的脱落细胞) 细胞裂解液通过W e s t e r nB l o t 可检测到相对分子质量为2 1 0 0 0 D 的 蛋白，而第2 组( 转染B a xd p S h u R l e - A d e n o 重组载体后存活并传代培养的细胞) 和 对照组( 未转染B a x a - p S h u t t l e - A d e n o 重组载体的H E K 2 9 3 细胞) 无可检测到的B a x 蛋白表达。 转染了L a c Z - p S h u t t l c A d e n o 重组腺病毒载体的H E K L 2 9 3 细胞在加入染色底物 x - g a I4 h 后，细胞培养液变成蓝色，倒置显微镜下见H E K 2 9 3 细胞亦蓝染。 酶标仪( 5 7 0 n m 波长) 测量结果见表l 。经T h eS A SS y s t e mf o rW i n d o w SV 8 统 计软件包对三组数据进行统计分析，转染B a x Q - p S h u t t l e - A d e n o 重组腺病毒载体组与 转染L a c Z p S h u t t l e - A d e n o 重组腺病毒载体组比较，忙5 8 0 , p O 0 1 ，转染B a x 一p S h u t t l e - A d e n o 重组腺病毒载体组与未转染病毒的对照组比较，t = 6 3 1 ，p 0 0 5 。 浙江大学附属第二医院 4 浙江犬学硕士研究生举谯论文 表1 。B a xq p S h u t t l e - A d e n o 重组腺瘸毒载体对H E K 2 9 3 细胞的毒性 结论 本蜜验中构娥的B a xn - p S h u t t l e - A d e n o 重组腺病毒表达载体和 L a e Z - p S h u t t l e - A d e n o 照俎腺病毒袭达载体均能脊效表达具有生物学活性的罄因编码 虽叁。量葵霹兹蓦嚣袭遮逑罄及L a c Z 基嚣_ 表达产糍墨半翼辍帮酶蛋鸯不对翅装缨怼 H E K 2 9 3 产生明显的绷胞活性影响。 B a x 蛋自由于其键细腿凋亡俸耀，在H E K 2 9 3 孛表达后健锼缨艟死亡，糙- 且量懿 薹嚣表达龙予痰毒簧铺，嚣嚣没鸯霄效鹃重蕴藤瘫毒完整鬏褴黥释放；苇麓感染雳罄 正常的I T E K 2 9 3 细胞，使通过H E K 2 9 3 细胞包裟镣整的B a xd - p S h u t t l e - A d e n o 重组腺 病毒并扩域的途径受辍，不能产生怒够於腺病毒爨遴簿针对胶发癯戆基嚣治痃。 关毽谲：B a x 基因L a e Z 基毽M T T 豫病毒裁体胶质瘸 浙江大学附属第二医院 望垩查堂堡主曼塞圭兰垡笙苎 一一 C o n s t r u c t i o no fr e c o m b i n a n tB a x g e n e - a d e n o v i r u se x p r e s s i o n v e c t o ra n d i t st o x i c i t yt oH E K 2 9 3c e l ll i n e M e d i c a l c o l l e g e , S p e c i a l i t y P o s t g r a d u a t e A d v i s o r Z h 咖n g 【历f v e 坩f 矽 N e u r o s u r g e r y C h e n P e n g P r o L i uW e i g u o A b s I T a c t O l t v a le ta li d e n t i f i e da na s s o c i a t e d2 1k Dp r o t e i np a r t n e r ，B a x ，t h a th a se x t e n s i v e a m i n oa c i dh o m o l o g y 、航mB c l 2i n1 9 9 3 B a xh o m o d i m e r i z e sa n df o r m sh e t e r o d i m e r s w i t hB c l - 2i nv i v o O v e r e x p r e s s e dB a xa c c e l e r a t e sa p o p t o t i cd e a t ha n da l s oc o u n t e r st h e d e a t hr e p r e s s o ra c t i v i t yo fB c l - 2 T h er a t i oo fB c l 2t oB a xd e t e r m i n e ss u r v i v a lo rd e a t h f o U o w i n ga na p o p t o t i cs t i m u l u s T h e r ea r eh i g he x p r e s s i o no fB e l - 2a n dr e l a t i v e l yl o w e x p r e s s i o no f B a xi ng l i o m a T h e r ei sr e l a t i o nb e t w e e nu n b a l a n c eo fr a t i oo fB c l 一2t oB a x a n d h i s t o l o g i c a lg r a d eo fg l i o m a , c a p a c i t yo f m e t a s t a s i so f g l i o m a , g r o w t h r a t eo f g l i o m a , r e l a p s eo fg l i o m a a sw e l la sr e s p o n s eo f g l i o m at oc h e m o t h e r a p ya n dr a d i o t h e r a p y I f 、v c c a ne n h a n c et h ee x p r e s s i o no fb a x g e n ei ng l i o m a , w e Up r o m o t et h ea p o p t o s i so fg l i o m a a n de n h a n c et h er e s p o n s eo f g f i o m a t oc h e m o t h e r a p ya n d r a d i o t h e r a p y H u m a n a d e n o v i r u s i sak i n do fd o u b l es U a l n sD N A ( d s D N A ) v i r u s T h ea d e n o v i r a lg e n o m ee x i s t sa sa n e p i s o m ei nt h eh o s tc e l l Sn e u c l e u s ，d o s en o ti n t e g r a t ei n t oh o s tc e l l Sg e n o m e ，a n dr a r e l y c a u s e sh o s t Sg e n ei n s e r tm u t a t i o n A sav e c t o r , A d e n o v i r u sh a st h ea d v a n t a g e so f e a s y o p e r m i o n e a s yp r o p a g a t i o n , w i d ev a r i e t yo f h o s tc e l ls p e c t r u m , n o n c e l l - c y c l ed e p e n d e n t i n f e c t i o u s a b i l i t y , c a p a c i t y o f l i g a t i n gl a r g ef o r e i g n D N At oa d e n o v i r a lv e c t o n R e p l i c a t i o n - i n c o m p e t e n t ( E l A E 3 ) h u m a na d e n o v i r u si so n eo f t h eb e s tv e c t o ra tp r e s e n t b e c a u s ei tn e i t h e rr e p l i c a t en o ra c t i v e l yt r a n s c r i b ei nn o n - p a c k a g ec e l ls c i e n c et h ec e l l l a c k st h en e c e s s a r yt r a n s c r i p t i o nf a c t o r s - t h eE 1g e n e s W em a d e r e p l i c a t i o n i n c o m p e t e n t 浙江大学附属第二医院 6 浙滋大学硕士研究生举位论文 a d e n o v i r u sa sav e c t o r , h u m a nc y t o m e g a l o v i r u si m m e d i a t ee a r l yp r o m o t e ra sam a m m a l i a n e x p r e s s i o n c a s s e t t e p r o m o t e r , B a x o g e n e a 8 t h e r a p e u t i cg e n e t o r e c o m b i n ea B a x a - p S h u t t l e - A d e n or e c o m b i n a n ta d e n o v i r a le x p r e s s i o nv e c t o r W ed e m o n s t r a t e dt h a t t h er e c o m b i n a n ta d e n o v k a le x p r e s s i o nv e c t o rh a sah i g ha c t i v i t yo ft r a n s c r i p t i o na n d e x p r e s s i o n o fg e n ei n s e r t e d W ea l s of o u n dt h a tt h ee x p r e s s i o no fB a xp r e c e d et h e r e p l i c a t i o n a n d p a c k a g e o fa d e n o v i r u sa n d o v e r e x p r e s s i o n o fB a xi sc y t o t o x 2 ci nH E K 2 9 3 c e i ll i n e ，w h i c hw o u l di m p e d et h ep r o p a g a t i o no fr e c o m b i n a n ta d e n o v i r a le x p r e s s i o n v e c t o ri ns e n s i t i v ep a c k a g i n gc e l l s - H E K 2 9 3b y k i l l i n gt h eH E K 2 9 3 c e l l s T l l i si m p l i e st h a t w ec a l l r e p l a c e ac o n t r o l l a b l e p r o m o t e rt oM C V I Ep r o m o t e r , w h i c hd on o te x p r e s s d o w n s t r e a mB a x g e n e o rl o w l y e x p r e s si nH E K 2 9 3 c e l l si no r d e rt oa v o i d i n gi t st o x i c i t yt o H E K 2 9 3c e l l T K sm a k er e c o m b i n a n tB a x - s p s h u t t l e - a d e n oe x p r e s s i o nv e c t o rp r o p a g a t e i u e t f e n o u g h t op r o c e e dt h e g e n et h e r a p y t og l i o m a E x p e r i m e n t a l m a t e r i a l s F u l ls e q u e n c eo fB a x a g e n ew a s d o n a t e d b yP r o J i eP a n , C o l l e g eo f L i f eS c i e n c e s ， Z h e j i a n gU n i v e r s i t y Ee o l i P G l w a so b t a i n e df r o mB i o c h e m i c a l n s t i t o t eo f C o l l e g eo f L i f eS c i e n c e s , Z h e j i a n gU n i v e r s i t y A d e n o - 文me x p r e s s i o ns y s t e mw a s b o u g h tf r o mB D B i o s c i e n c e s C o m p a n y , A m e r i c a H E K 2 9 3 c e l ll i n ew a sb o u g h tf r o mI n s t i t u t eo f B i o c h e m i s t r ya n dC e l lB i o l o g y ，S I B S ，C A S ，C h i n a D M E M ，1 6 4 0M e d i u m ，a n dF B Sw e 糟 b o u g h tf o r mI n t r o g e nC o 。A m e r i c a D O S P E RL i p o s o m MT r a n s f e c t i o nR e a g e n t 硝毽s b o u g h tf r o mR o c h eC o ，S w i t z e l a n d M T Ta n dX * g a lr e a g e n tw e l t 七b o u g h tf r o mA m r e s c o I n c ，A m e r i c a W e s t e r n B l o t t i n g L u m i n a l R e a g e n t W a s b o u g h t f r o mS a n t aC r u z B i o t e c l m o l o g yC o 。，A m e r i c a 。P e r o x i d a s e - C o n j u g a t e dG o a tA n t i - M o u s el g Ow 黏b o u g h t f r o mB e i j i n gZ h o n g s h a nB i o t e c h n o l o g yC o L t d ，C h i n a P a elW a sb o u g h tf r o mN e w E n g l a n dB i o t e c h n o l o g yC o ，A m e r i c a X b aI 、K p nI 、B a m HI 、P s tI ，D N AM a r k e r D L 2 0 0 0a n dD N AM a r k e rD L l 5 0 0 0w e r e b o u g h t f r o mT a K a R a B i o t e c h n o l o g y ( D a l i a n ) C o 浙江大学附属第二医院 7 塑垩查兰堡主要塞生兰垡堡苎 一一 L t d C h i n a E x p e r i m e n t a l M e t h o d s C u l t u r eH E K 2 9 3c e l l si nh i 曲g l u c o s eD M E Ms u p p l e m e n t e dw i t h1 0 0u n i t s n i l p e n i c i l l i nG s o d i u m ，1 0 0 I _ t g m ls t r e p t o m y c i I l ，a n d1 0 f e t a lb o v i n es e r u n li np l a s t i cf l a s k s u n d e ro p t i m u mg r o w t hc o n d i t i o n s ( 3 7 5 C 0 2 ) S p l i te v e r y3d a y sw h e nt h e yr e a c h a b o u t8 0 c o n f l u e n c y D o u b l e d i g e s tp S h u t t l ep l a s m i dD N A 、】l ，i t l lX b aIa n dK p nI C o m b i n et h eX b a I K p nI - d i g e s t e dp S h u t t l ep l a s m i dD N A w i t ht h eB a x a g e n ed o n a t e d b yP r o J e iP a n I d e n t i f yp u t a t i v er e c o m b i n a n tB a x a - p S h u t t l eD N Ab y B a m HIo rP s tI r e s t r i c t i o na n a l y s i s D o u b l e - d i g e s tr e c o m b i n a n tB a x a - p S h u t t l eD N A w i t hPI S c eIa n d I - C e uI E l e c t r o p h o r e s ea n de x l l a c tt h ef r a g m e n t sw h i c hc o n t a i nB a x ag e n es e q u e n c e C o m b i n ee x t r a c t e df r a g m e n t sc o n t a i n i n gB a x g e n ew i t hA d e n o - X v i r a lD N Aa n d i d e n t i f y p u t a t i v er e c o m b i n a n tB a x a - p S h u t t l e - A d e n oD N A w i t hP C R U s et h es 拙em e t h o d st o r e c o m b i n e L a c Z - p S h u t t l e - A d e n o D N Aa n d i d e n t i f yp u t a t i v e r e c o m b i n a n t L a c Z - p S h u t t l e - A d e n oD N A 研血P C R D i g e s tp u r i f i e dr e c o m b i n a n tB a x a - p S h u t t l e - A d e n o D N A ( 3 0 7 1 1 9 曲w i t hP a cI t ot i n e a r i z ei t P u r i f yt i md i g e s t e dD N Aw i t hr e a g e n t p h e n o l ： c h l o r o f o r m ：a l c o h o l ( 2 5 ：2 4 ：1 ) T h ec o n c e n t r a t i o no f t h e D N A a f t e r p u r i f i c a t i o n i s1 6 8 耀m T r a n s f e c tH E K 2 9 3c e l l sw i t h d i g e s t e d a n d p u r i f i e d r e c o m b i n a n t g e n e B a x a - p S h u t t l e A d e n ow i t hu s i n gD O S P E Rl i p o s o m a it r a n s f c c t i o nr e a g e n t A f t e r5d a y s a n d8d a y s ，r e p l a c et h em e d i u ma n dc e n t r i f u g et h er e m o v e dm e d i u mt oc o l l e c tt h ed e a d H E K 2 9 3c e i l ss h e l i e df o r i l lf l a s k U s et h es a l l l em e t h o dt om m s f e c t 皿K 2 9 3c e l l sw i t h r e c o m b i n a n tL a e Z - p S h u t t l e - A d e n o D N A A n a l y z et h ee x p r e s s i o no fB a x ap r o t e i n i n H E K 2 9 3c e l l si n f e c t e dw i t hr e c o m b i n a n tB a x a - p S h u t t l e - A d e n oD N A b yw e s t e r nb l o t m e t h o d O b s e r v et h e e x p r e s s i o n o fB g a l a c t o s i d a s ei nH E K 2 9 3c e l l si n f e c t e dw i t l l r e c o m b i n a n tL a c Z p S h u t t l e A d e n oD N A b ys t a i n i n gw i t hX - G a l A n a l y z et h et o x i c i t yo f r e c o m b i n a n tB a x a - p S h u t t l e - A d e n oe x p r e s s i o nv e c t o rt oH E K 2 9 3c e l l sb yM T T m e t h o d 浙江大学附属第二医院 8 塑婆态堂堡主堡窒垒塑堡苎一 A n a l y z es t a t i s t i c a l l ya l lo f t h e d a t aw i t hT h eS A S S y s t e m f o rW i n d o w sV 8 R e s u l t s T h ec e l l sf r o mg r o u pl ( C e l l sw e a - ec o l l e c t e df r o mr e m o v e dm e d i u mf r o mf l a s ki n w h i c hH E K 2 9 3c e i l st r a n s f e c t e dw i t hr e c o m b i n a n tB a x C t - p S h u t t l e - A d e n oD N A w e r e m a i n t a i n e db yc e n t r i f u g e ) W e r el y s e da n df o u n das p e c i a lp r o t e i n ( 2 1 k D ) b yw e s t e r nb l o t m e t h o d T h ec e l l sf r o mg r o u p2 ( C e l l ss u r v i v e df r o mt r a n s f e c t i o no fr e c o m b i n a n tB a x d - p S h u t t l e - A d e n oD N A a n d w e f e 蹲l i to n c e 。) a n dg r o u pc o n t r o l s ( C e l l sw e r e n o tt r a n s f e c t e d w i t hr e c o m b i n a n t ) w e r ed e t e c t e dn O e x p r e s s i o n o f B a x p r o t e i n T h ec e l l st r a n s f e e t e dw i t hr e c o m b i n a n tL a e Z - p S h u t t l e - A d e n oe x p r e s s i o nv e c t o r c h a n g e d t h ec o l o ro f t h em e d i u mt ob l u ef o r4h o u r sa R e rX - g a lw e l ea d d e d t Ot h em e d i u m A n d t h r o u g hm i c r o s c o p e W ef o u n dt h a tt h ec e l l sw e r es t a i n e db l u et o o T h eO D 5 7 0m e a s u r e m e n tr a k e dw i t l lt h ee 1 1 z y n l em a r ki n s m u n e n tw e r el i s t e dO nt h e t a b l e1 W e 疆零密斑t h er e s u l t sb e t w e e nt h eg r o u pt r a n s f e c t e dw i t hr e c o m b i n a n tB a x a p S h u t t l e - A d e n oa n dt h eg r o u pt r a n s f e c t e dw i t hr e c o m b i n a n tL a c Z - p S h u t t l e A d e n oa n d f o u n das i g n i f i c a n td i f f e r e n t i a t i o nb e t w e e nt w og r o u p s ( 睁5 8 0 , p 0 0 1 ) A n dt h es a l n e r e s u l t 拇6 。3 1 ，p 0 0 5 ) T a b l e1C y t o t o x i ce f f e c t so f r e e o m b i r m n tB a xa - p S h u t t l e - A d e n oe x p r e s s i o nv e c t o fo nH E K 2 9 3c e l l s 浙江大学附属第二医院 9 浙1 疆大学硕士研究生学位论文 C o n c l u s i o n s B o t hr e c o m b i n a n tB a x 一p S h u t t l e - A d e n oe x p r e s s i o n v e c t o ra n d L a c Z - p S h u t t t e A d e n oe x p r e s s i o nv e c t o rc o n s t r u c t e di nt h i se x p e r i m e n tc a r lt r a n s c r i b ea n d e x p r e s sb i o l o g i c a l l y a c t i v e p r o t e i n e n c o d e d b y B a x Q a n dL a c Z e f f i c i e n t l y T h e g a l a c t o s i d a s ee n c o d e db yL a c Zg e n ea n dt h ep r o c e s so f t r a n s c r i p t i o na n de x p r e s s i o no f r e c o m b i n a n ta d e n o v i r a lv e c t o rh a v eN Oo b v i o u s t o x i c i t y t oH E K 2 9 3 c e H s B a xp r o t e i nh a sa r t a b i l i t yt om a k ec e l l sa p o p t o s i sa n dt h ee x p r e s s i o no fb a xg e n e p r e c e d et h ea d e n o v i r u sr e p l i c a t i o n 。S ot h ee x p r e s s i o no fB a xi nH E K 2 9 3i m p e d e st h e p r o g a g a t i o n o f v i r u sb y k i l l i n gt h ep a c k a g i n gc e l l s * H K E 2 9 3 K e y w o r d s ：B a x g e n e L a e Z g e n e M T TA d e n o v i r a lv e c t o r G l i o m a 浙江大学附属第二医院 1 0 浙江大学硕士研究生学位论文 B a x 基因重组腺病懑表达载体鳇橡建及其对包装纲臆H E K 2 9 3 的毒性作用 浙泼大学医学院外科学( 亭串经掺季籼 2 0 0 1 级硕士研究生陈鹏 导师刘伟国教授 前言 O l t v a i 等予t 9 9 3 年用B c l - 2 基因蛋翻产物B c l - 2 特异性单克隆抗体免疫沉淀等方 法，及A 帮鬣B 鲴庭孛发现与B c l - 2 共沉淀静一耱( 2 1 K D ) 虽爨矮，会名必B a x ( B c l a s s o c i a t e d Xp r o t e i n ) ，与B c l 一2 倔绷胞存活的作用相反，B a x 促细胞死亡。细胞 内B a x 和B c l - 2 的比值是影嫡细胞凋亡的关键。B a x 猩脑胶质瘤鲍发生、发展及转移 串其有重要露蠲，藏覆瘸缳蕊孛B e l - 2 豹嵩表达，B a x 静福对低袭遮，B c l 2 B a x 魄镄 的失调与胶质瘤的组织学级别，肿瘤转移能力，肿瘸嫩长速度，肿瘤复发以及肿瘤对 于放疗，化疗的反应性均具有整切关系。如果毙够在瓣瘸细胞中提麓B a x 基因鲍袭达， 将促进耱瘤缁胞的漏亡，掇离静瘩缀藏辩于放疗、讫疗豹敏感性。人类艨瘸毒怒双链 D N A 病毒，具有转染靶细胞后以附加体( e p i s o m e ) 形式存在，极少发生插入突变，载 嚣操作方便、容易繁殖，宿主蓬曩广，溉可感染分裂绷腿，又可感染 # 分裂缨臌，携 带岁 源基嚣容童大，可表媳接近髓译藤成熬水平蛋蠢旗等优点，复俸缺陷瞧稼瘸毒盎 予其在非包凝细胞中不熊发制，避免了对正常细胞的感染，成为现阶段最好的綦因治 疗载体之一。我们以复制缺赡性腺病毒为基因转移载体，强人类嚣绷鼹病毒早期启动 子为真核萋瓣表达启动予，以B a x d 蕊遥为治疗基因，构建B a x 程p S h u t t l e A d e n o 澶组腺病毒载体，并且证明其有较高的目的基因转最和表达活性，同时发现重缀病毒 羧体B a x a 鹣袭达先于癔灏本身复毒l 秘题装，由于B 馘蛋自对予包装绠瑰H E K 2 9 3 驰 毒性作用，露致包装细腿的死亡，而瘸辫本身尚耒完成复制和包装，致使病毒扩增受 阻，不能达到基因治疗所需的病毒浓度。这提示我们猩将来的实验中可以通过以可控 黝启动子代耱C M V 启动予，使含B a x 蒸隧熬重组艨瘸毒在包装缨脆H E K 2 9 3 缨腿中 浙江大学附属第二医院 浙江大学硕士研究生学位论文 不表达或低表达，避免B a x 蛋白对于H E K 2 9 3 细胞的致死性毒性，使重组体得以包 装和扩增，从而得到足够的病毒量进行胶质瘤的基因治疗。 实验材料和仪器 1 1 主要试剂：B a xa 基因全序列由浙江大学生命科学学院潘杰教授惠赠，T G l 菌为浙江大学生命科学学院生物化学研究所保存，A d e n o 文表达载体( 美国 C L O N T C H 公司) ，H E K 2 9 3 细胞( 中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所) ， D M E M 培养液、1 6 4 0 培养液、胎牛血清( 美国I n v i t r o g e n 公司) ，D O S P E R 阳离子脂 质体( 瑞士R o c h e 公司) 。X g a l 试剂、M T T 试剂( 美国A i n l s c o 公司) ，B a x ( B 一9 ) 鼠抗人单克隆抗体、W e s t e r nB l o t t