DNA重组技的基本工具.ppt

,定向基因改造设想,设想一,能否让禾本科的植物也能够固定空气中的氮？,能否让细菌“吐出”蚕丝？,设想二,能否让微生物产生出人的胰岛素、干扰素等珍贵的药物？,设想三,经过多年的努力，科学家于20世纪70年代创立了可以定向改造生物的新技术基因工程。,基因工程,专题1,基因工程：又叫做基因拼接技术或DNA重组技术。通俗的说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的基因产物,定向地改造生物的遗传性状。,原理：,操作水平：,结果：,目的基因,基因重组,DNA分子水平,定向地改造生物的遗传性状，获得人类所需要的品种。,(细菌等微生物),（一）基因工程的概念,基因拼接技术或DNA重组技术,生物体外,基因,DNA分子水平,人类需要的基因产物,剪切,拼接,导入,表达,请你回答：,转基因抗虫棉,抗虫棉,普通棉,基因工程培育抗虫棉的简要过程：,（一）基因工程的概念,普通棉花(无抗虫特性),苏云金芽孢杆菌,提取,抗虫基因,棉花细胞(含抗虫基因),棉花植株(有抗虫特性),重组DNA,导入,形成,解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？,1DNA重组技术的基本工具,DNA重组技术的基本工具,关键步骤一的工具：,关键步骤二的工具：,关键步骤三的工具：,分子手术刀,分子缝合针,分子运输车,限制性内切酶,DNA连接酶,运载体,一、“分子手术刀”,人会被细菌入侵而得病，细菌会被其他的生物入侵吗？,人靠什么来防御入侵？那么细菌呢？,限制性核酸内切酶,1、来源：,原核生物（细菌或霉菌）中分离纯化出来的一种酶。,2、种类：,4000种,为什么不会剪切细菌本身的DNA？,在长期进化过程中，含有哪种限制酶，就不具备相应的序列；或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别的序列中，使限制酶不能将其断开。,限制酶的作用是什么？,EcoR,Sma,识别：,（6个核苷酸，4、5或8）,DNA分子的某种特定的核苷酸序列,A,A,T,T,G,C,C,T,T,A,A,G,断开：,磷酸二酯键,断开后的末端是怎样的？,大肠杆菌(E.coli)的一种限制酶能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。,限制酶,什么叫黏性末端？,限制酶,被限制酶在识别序列的中轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是黏性末端。,什么叫平末端？,当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。,切割位点,和之间,和之间,未端类型,平末端,粘性末端,3、作用：,4、结果：,形成两种末端,特异性,识别：,DNA分子的某种特定的核苷酸序列（6个核苷酸，4、5或8）,断开：,磷酸二酯键,要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？,（二）基因操作的工具,要切两个切口，产生四个黏性末端。,如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？,会产生相同的黏性末端，然后让两者的黏性末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。,二、“分子缝合针”,DNA连接酶与DNA聚合酶有何区别？,DNA连接酶,以DNA的一条链为模板合成DNA双链,游离的脱氧核糖核苷酸,DNA聚合酶,DNA聚合酶,DNA聚合酶,DNA聚合酶,DNA聚合酶,DNA聚合酶,DNA聚合酶,DNA聚合酶,DNA聚合酶,DNA聚合酶,DNA,DNA聚合酶,具有连接单链DNA的本领,DNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，是把梯子两边扶手的断口连接起来，这样一个重组的DNA分子才能形成。,DNA连接酶,只可以连接双链DNA,1、分类：,大肠杆菌：,T4噬菌体：,E.coliDNA连接酶,T4DNA连接酶,作用：,作用：,只能将粘性末端之间连接,既可以“缝合”粘性末端，又可以“缝合”平末端（效率低）。,运载体,将外源基因送入受体细胞。,三、分子运输车,1.作用：,2.种类：,质粒、噬菌体和动植物病毒。,天然的质粒、噬菌体和动植物病毒是否都可以直接用做运载体？,1.如果从霍乱弧菌中分离出来的质粒来做载体，请问谁敢用它来做受体的载体？,运载体DNA必需是可靠的,2.运载体DNA要携带目的基因，如何携带？,运载体DNA必需有一个或多个限制酶切点,且切点必须在质粒本身需要的基因片段之外。,3.运载体DNA要携带目的基因进入后如何表达？,自我复制（整合到受体DNA上）,4.如何确认目的基因进入受体细胞？并进行筛选？,带有标记基因,3.条件：,必需是可靠的,必需有一个或多个限制酶切点,自我复制（整合到受体DNA上）,带有标记基因,运载体DNA大小适合，便于提取和操作,目前被较广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、人胰岛素基因、人干扰素基因、种子贮藏蛋白基因、植物抗病基因等。,基因操作的基本步骤,、提取目的基因将需要的基因从供体生物的细胞内提取出来。,2、目的基因与运载体结合,用与提取目的基因相同的限制酶切割质粒使之出现一个切口，将目的基因插入切口处，让目的基因的黏性末端与切口上的黏性末端互补配对后，在连接酶的作用下连接形成重组DNA分子。,3、将目的基因导入受体细胞并使之扩增,要让目的基因表达，必须将它导入受体细胞并进行扩增。为获得目的基因的表达产物时，通常以大肠杆菌等无害易得的细菌为受体。为改进某种生物时，将欲改进的生物细胞为受体。,为使重组的DNA分子更容易进入受体细胞，通常还要用一些物质对受体细胞进行处理，使受体细胞具有更大的通透性。,4、目的基因的检测和表达,前三步的处理十分繁锁，为保证目的基因得到有效利用，通常用大量的受体细胞来接受不多的目的基因。这样，处理的受体细胞中真正摄入了目的基因的很少，必须将它从中检测出来。,细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。,质粒的特点,1.细胞染色体（或拟核DNA分子）外能自主复制的小型环状DNA分子；2.质粒的存在对宿主细胞无影响；3.质粒的复制只能在宿主细胞内完成。,1.以下说法正确的是（）A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列B、质粒是基因工程中唯一的运载体C、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接D、DNA连接酶使黏性末段的碱基之间形成氢键,C,练习,2.有关基因工程的叙述中，错误的是（）A、基因工程技术能定向地改造生物的遗传性状，培育生物新品种B、重组DNA的形成在细胞内完成C、目的基因须由运载体导入受体细胞D、质粒都可作为运载体,BD,练习,3.在基因工程中，切割运载体和含有目的基因的DNA片段，需使用（）同种限制酶B.两种限制酶同种连接酶D.两种连接酶,注意：要用同一种限制酶切取目的基因和运载体，并用DNA连接酶连接。,练习,4.不属于质粒被选为基因运载体的理由是A、能复制（）B、有多个限制酶切点C、具有标记基因D、它是环状DNA,D,练习,双基练习：,一、基因工程的概念基因工程是指按照人们的愿望,进行严格的设计,通过体外_和_等技术,赋予生物以心得遗传特性,创造出符合人们的需要的新的_和_.又叫做DNA的重组技术.二、DNA重组技术的基本工具1.限制性核酸内切酶-”分子手术刀”(1)主要来源:从_生物中分离出来的.(2)特点:能够识别DNA特定的核苷酸序列,切开,两个_之间的_.(3)DNA末端:限制酶切割DNA产生的DNA末端有两种形式:_和_.2.DNA连接酶-”分子缝合针”(1)作用:将双链DNA_,恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的_.(2)种类:E.coliDNA连接酶:只能缝合DNA的_T4DNA连接酶:既可缝合DNA的_,又可缝合双链DNA的_.,3.基因进入受体细胞的载体-”分子运输车”(1)载体的种类质粒:是一种裸露的,结构简单,独立于细菌染色体之外,并能够自我_能力的双链_