DNA重组技术的基本操作程序.ppt

1.2,基因工程的基本操作程序,1、原核细胞的基因结构,非编码区,非编码区,编码区,与RNA聚合酶结合位点,启动子,终止子,启动子：位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质。,终止子：位于基因尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录。,原基核因细结胞构,能转录为mRNA，编码蛋白质,不能转录为mRNA，不能编码蛋白质,功能,2、真核细胞的基因结构,编码区,与RNA聚合酶结合位点,内含子,外显子,启动子,终止子,真核细胞基因结构,编码区,非编码区：,外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列,3、原核细胞与真核细胞的基因结构比较,思考,编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？,连续,不连续,编码区,非编码区,原核生物的基因表达,编码区,非编码区,非编码区,RNA聚合酶,mRNA,转录,翻译,启动子,终止子,基因,蛋白质,真核生物的基因表达,编码区,非编码区,非编码区,剪接有关的酶,RNA聚合酶,mRNA前体,mRNA,转录,剪接,翻译,启动子,终止子,基因,蛋白质,1、目的基因的获取,2、基因表达载体的构建,3、将目的基因导入受体细胞,4、目的基因的检测与鉴定,1.2基因工程的基本操作程序,一、目的基因的获取,1,目的基因主要是编码蛋白质的基因,获取目的基因的常用方法：,如：与生物抗性相关的基因、与优良品质相关的基因、与生物药物和保健品相关的基因、与毒物降解相关的基因、与工业用酶相关的基因、具有调控作用的因子等。,2,1、从基因文库中获取2、利用PCR技术扩增3、利用DNA合成仪用化学方法直接人工合成,（一）从基因文库中获取目的基因,1.基因文库的概念:,将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。,2.基因文库的种类:,基因组文库：含有一种生物的全部基因,部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库,基因文库的构建方法,基因组文库的构建,提取某种生物的全部DNA,用适当的限制酶切割,一定大小的DNA片段,将DNA片段与载体连接,重组DNA,基因组文库,导入受体菌中储存,cDNA文库的构建-反转录法：,提取某种生物的mRNA,单链DNA,双链cDNA片段,重组DNA,cDNA文库,基因文库的构建方法,mRNA,单链DNA,双链DNA,思考？,真核生物的基因用反转录法得到的cDNA与原基因相同吗？,真核细胞的cDNA的获取,编码区,非编码区,非编码区,DNA聚合酶,剪接有关的酶,RNA聚合酶,mRNA前体,mRNA,单链DNA,cDNA,反转录酶,转录,剪接,反转录,复制,启动子,终止子,基因,不含非编码区和内含子,cDNA文库与基因组DNA文库,cDNA,受体菌群体,cDNA文库,某种生物某个时期的mRNA,某生物体内全部DNA,许多DNA片段,受体菌群体,基因组文库,基因组文库与cDNA文库的比较,小,大,无,有,无,有,某种生物的部分基因,某种生物的全部基因,可以,部分基因可以,（二）利用PCR技术扩增目的基因,多聚酶链式反应,体外,特定DNA片段,模板DNA；四种脱氧核苷酸；热稳定DNA聚合酶（Taq酶）；DNA引物,DNA双链复制,一段已知目的基因的核苷酸序列,a.DNA变性（90-95）：双链DNA模板在热作用下，_断裂，形成_,b.退火（55-60）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部_。,c.延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的_。,氢键,单链DNA,双链DNA,DNA单链,d.重复a.b.c步骤：每重复一次，目的基因增加_倍,1,PCR反应原理示意图：,PCR反应原理示意图：,PCR技术的操作过程,PCR反应体系中目的基因成指数(2n)形式扩增,思考？,1个DNA分子进行PCR扩增,循环4次，理论上至少需要几个引物？,2（2n-1）(n为循环次数),（24-1）2=30,PCR技术扩增与DNA复制的比较,碱基互补配对原则,碱基互补配对原则,四种脱氧核苷酸、模板、酶、ATP,四种脱氧核苷酸、模板、酶、引物,DNA在高温下解旋,解旋酶催化解旋,半保留复制、边解旋变复制,半保留复制、全解旋再复制,体外复制,主要在细胞核内,大量的DNA片段,形成整个DNA分子,热稳定的DNA聚合酶,细胞内的解旋酶、DNA聚合酶等,3.人工合成法,在基因较小，核苷酸序列已知的情况下，可以利用DNA合成仪用化学方法人工合成,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,基因的核苷酸序列,目的基因,化学合成,推测,推测,思考：化学法合成的目的基因含内含子、启动子和终止子吗？,不含,课堂小结,目的基因的获取,1、从基因文库中获取,2、利用PCR技术扩增,3、人工合成,种类,基因组文库,部分基因文库,二、基因表达载体的构建基因工程的核心,2,基因表达载体的组成：,复制原点+启动子+目的基因+终止子+标记基因,表达载体,启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质。终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录。标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来。,基因表达载体的构建过程,质粒,DNA分子,限制酶处理,两个切口获得目的基因,DNA连接酶,重组DNA分子（重组质粒）,同一种,一个切口两个黏性末端,注意：,载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构用到的工具酶：限制酶和DNA连接酶，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键启动子、终止子对于目的基因表达必不可少目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。,三、将目的基因导入受体细胞,1、目的基因导入植物细胞的方法,（1）农杆菌转化法,农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力。,原理：Ti质粒上的TDNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。,构建基因表达载体,农杆菌,植物细胞,稳定维持和表达,过程：,1、目的基因导入植物细胞的方法,优点：,经济、有效,整合到染色体DNA上,（2）基因枪法：,操作方法：利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。,金属粒子：钨粉粒子和金粉粒子，粒子的直径一般在0.64um,适用：单子叶植物,1、目的基因导入植物细胞的方法,（3）花粉管通道法：,操作方法：在植物花受粉后，花粉形成花粉管还未愈合前期，剪去柱头，然后，滴入DNA（含目的基因）使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞,特点:十分简便经济,实例：转基因抗虫棉,1、目的基因导入植物细胞的方法,2、将目的基因导入动物细胞,（1）方法：显微注射法,（3）程序：,（2）受体细胞：,受精卵,3、将目的基因导入微生物细胞,微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少常用细胞：大肠杆菌常用方法：Ca2+处理获得感受态细胞过程：,Ca2+处理大肠杆菌,感受态细胞,感受态细胞吸收DNA,表达载体与感受态细胞混合,1.导入过程完成后，全部受体细胞都能摄入重组DNA分子吗？,真正能摄入重组DNA分子的受体细胞很少。,2.目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定维持和表达？,不一定，需要检测,思考,四、目的基因的检测与鉴定,（1）检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因,基因探针：,放射性同位素等标记的含目的基因DNA分子,方法,DNA分子杂交技术,1、检测分子水平的检测,方法,分子杂交技术,（2）检测目的基因是否转录出了mRNA,转基因生物的mRNA,1、检测分子水平的检测,提取,（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质,方法抗原-抗体杂交,抗体,蛋白质,出现杂交带,脱分化,组织培养,1、检测分子水平的检测,2、鉴定个体水平的鉴定,抗虫、抗病接种实验，活性比较实验,例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未导入目的基因或导入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明导入了抗虫基因并得到表达。,课堂练习,1、有关基因工程的叙述中，错误的是()A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来B、限制性内切酶用于目的基因的获得C、目的基因须由运载体导入受体细胞D、人工合成目的基因不用限制性内切酶,A,2、下列属于获取目的基因的方法的是()利用mRNA反转录形成从基因组文库中提取从受体细胞中提取利用PCR技术利用DNA转录人工合成A.B.C.D.,D,课堂练习,3、有关基因工程的叙述正确的是（）A、限制酶只在获得目的基因时才用B、重组质粒的形成在细胞内完成C、质粒都可作为运载体D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料,D,【拓展深化】工具酶只有两种：限制酶在操作程序1、2中用到且要求用同一种，目的是产生相同的黏性末端；DNA连接酶只在操作程序2中用到。,课堂练习,4、基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是（）A、人工合成目的基因B、目的基因与运载体结合C、将目的基因导入受体细胞D、目的基因的检测和表达,C,【拓展深化】只有