基因工程原理-第二章DNA重组.ppt

基因工程原理,PrincipleofGeneEngineering,第二章,第二章DNA重组,第一部分DNA的组成和结构,1.1DNA的组成,1.2DNA的空间结构,线形DNA：环形DNA：,1.3DNA复制,半保留复制方式,复制起始位点（replicationoriginsite）,原核生物DNA的复制,解旋酶单链结合蛋白DNA拓扑异构酶引物酶DNA聚合酶DNA连接酶,真核生物DNA的复制,复制子,从复制起始点开始复制出的一个DNA分子或一个DNA片段的核苷酸序列。,复制子的数量,原核生物的染色体DNA：单个真核生物染色体DNA：多个质粒DNA：单个、多个,1.4DNA转录启动子和转录区的结构,启动子：Promotor，DNA分子上能与RNA聚合酶结合并形成转录起始复合体的区域，在许多情况下，还包括促进这一过程的调节蛋白的结合位点。,Shine-Dalgarnosequence;SDsequence,1974年，由J.Shine和L.Dalgarno发现,SD序列：,在细菌mRNA起始密码子AUG上游10个碱基左右处，有一段富含嘌呤的碱基序列，能与细菌16SrRNA3端识别，帮助从起始AUG处开始翻译。,1.5DNA转录终止子（transcriptionterminator）,终止子（Terminator）是一段位于基因或操纵组末端的DNA片段，可中断转录作用。原核生物拥有两种类型的终止子，包括：,本体转录终止子（Intrinsictranscriptionterminators）：-依赖转录终止子（Rho-dependenttranscriptionterminators：,不依赖于蛋白质辅因子就能实现终止作用。,依赖蛋白辅因子才能实现终止作用。这种蛋白质辅因子称为释放因子，通常又称因子，与RNA螺旋酶蛋白复合物。,两类终止子有共同的序列特征：在转录终止点前有一段回文序列。,富含GC,回文序列：双链DNA中含有的两个结构相同、方向相反的序列称为反向重复序列，当该序列的双链被打开后，可形成局部“十”字形结构。这段序列被称为回文序列。,1.6天然DNA的来源和用途,染色体DNA：分离目的基因的主要材料，1000106kb病毒DNA：用于构建基因克隆载体,T4、质粒DNA：用于构建基因克隆载体线粒体DNA：呼吸作用的基因叶绿体DNA：光合作用的基因,存在与生物体内的DNA,（1）大肠杆菌源质粒DNA的提取（2）噬菌体DNA的提取（3）氯化铯法制备植物基因组DNA,1.7天然DNA的的提取,合适的生物材料裂解细胞分离DNA纯化核检测,（1）大肠杆菌源质粒DNA的提取,松弛型质粒：加氯霉素严紧型质粒：不加氯霉素,（2）噬菌体DNA的提取,1.8DNA的纯化,氯化铯-溴化乙锭连续梯度离心法离子交换层析法琼脂糖凝胶电泳洗脱法“基因纯”试剂纯化从DNA样品中去掉EB,2.2.4DNA浓缩2.2.5DNA纯度检测,第三次课结束！,第二部分基因工程工具酶,基因工程工具酶,限制性核酸内切酶DNA连接酶和激酶DNA聚合酶和RNA聚合酶DNA和RNA修饰酶。,一、序列特异的DNA限制性内切核酸酶(Restrictionendonuclease,RE）,指能够识别双链DNA分子中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的核酸内切酶。来源：原核生物种类：500多种作用：把外源DNA切割成片段。,第一型（TypeI）：能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解第二型（TypeII）：只催化非甲基化的DNA的水解第三型（TypeIII）同时具有修饰及认知切割的作用,限制性内切酶的命名和书写：,HindIII,细菌属名,细菌种名,菌株,酶编号,Haemophilusinfluenzaed,RE的功能:防御外源DNA感染,利于遗传的稳定性RE抑制了细菌种属间的交叉繁殖,但甲基化酶的某些误差,又使得不同菌株间DNA的重组成为可能,利于生物的进化.,1968年,从大肠杆菌中分离到了I型RE,1970年,从大肠杆菌中分离到了II型RE,RE的发现：,3.1.1限制性核酸内切酶作用机制,（1）在DNA分子双链的特异性识别序列部位,切割DNA分子,形成链的断裂.识别序列:又叫靶子序列,是由4-8个核苷酸组成的特定核苷酸序列.,3.1.2限制性核酸内切酶的识别序列,旋转对称或二重互补对称,连续的:,例如：,5ABCCBA33ABCCBA5,间断的:,5ABNBA33ABNBA5,EcoRI,BamHI,GAATTCCTTAAG,GGATCCCCTAGG,（2）识别序列在DNA分子上出现的频率,例如：,DNA长49000bp，BglII的识别序列为AGATCT所以理论上在DNA中，BglII识别序列应该出现：49000/4096=12次。实际上，仅出现6次。,同裂酶(isoschizomer)-来源不同,但识别同样的核苷酸靶子序列.例如:HpaII和MspI的识别序列都为,5.CCGG.33.GGCC.5,BamHI：5GGATCC3BclI：5TGATCA3BglII：5AGATCT3,同尾酶(isocaudamer)-来源不同,识别的核苷酸靶子序列不同,但产生相同的粘性末端.例如:BamHI,BclI,BglII是一组同尾酶切割后的末端是GATC.,3.1.3限制性核酸内切酶切割DNA的位点,多数在识别序列内部。环形DNA切割后的片段数：N线形DNA切割后的片段数：N+1,DNA片段末端种类：,粘性末端：磷酸二酯键断裂位置是交错的,平末端：断裂位置在对称轴,切割位点表示方法,5-CTGCAG-33-GACGTC-5,PstI,可以表示为：,5-CTGCAG-3,反应总体积：20微升酶的用量缓冲液的组成与酶的种类有关反应时间1-3小时。,3.1.4限制性核酸内切酶反应系统,例：Bgl对DNA的消化,13mL蒸馏水2mL10 x缓冲液4mL底物DNA1mLRE,37，1-3小时,依次加入：,混匀离心,升温，使酶失活（6510-15min）,除去酶蛋白,限制性酶切反应一般流程,底物DNA：,DNA纯度DNA分子构型识别位点侧面序列位点偏爱DNA甲基化,酶的用量,酶的活性底物DNA：位点数量,标准缓冲液的组成：,缓冲液系统,MgCl2（或醋酸镁）NaCl（或KCl）Tris-HCl-巯基乙醇（或二硫苏糖醇DTT）,反应温度：大多数是37，少数或高或低,Star活性：某些限制性核酸内切酶在特定条件下，可以在不是原来的识别序列处切割DNA。,3.1.5限制性核酸内切酶的Star活性,4,二、DNA连接酶,DNA连接酶能催化双链DNA片段紧靠在一起的3-OH和5-P基团末端之间形成磷酸二酯键，使两末端连接。如果是两个或两个以上不同双链DNA片段末端连接，则产生重组DNA分子。,3.2DNA连接酶,3.2.1DNA连接酶的作用机理,E.coliDNA连接酶,T4DNA连接酶,（但效率较低）,3.2.2目前常用的DNA连接酶,1条DNA链具有3-OH,另1条DNA链具有5-P,而且3-OH与5-P是相邻的.3-OH与5-P位于与互补链上的互补碱基配对的两个脱氧核苷酸的末端.吸能反应:E.coliDNA连接酶需要NAD+，T4DNA连接酶需要ATP.,3.2.3DNA连接酶作用条件,反应温度：37酶用量：平末端1-2unit粘性末端0.1unitATP：10mol/L1mmol/Lbuffer：Tris-HCl，KCl，DTT，BSA,DNA连接酶反应条件,具互补粘性末端片段之间的连接具平末端DNA片段之间的连接DNA片段末端修饰后进行连接,3.2.4DNA片段之间的连接方式,具互补粘性末端片段之间的连接,具平末端DNA片段之间的连接,DNA片段末端修饰后进行连接,DNA片段末端同聚物加尾后进行连接粘性末端修饰成平末端后连接DNA片段5段磷酸化作用后连接,DNA片段末端同聚物加尾后进行连接,粘性末端修饰成平末端后连接,DNA片段5端脱磷酸化作用后连接,5,催化以DNA单链为模板，以4种脱氧核糖核苷酸为底物，合成一条与模板序列互补的DNA新链的酶。,三、DNA聚合酶,DNA聚合酶包括：,大肠杆菌DNA聚合酶I大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow大片段酶T4DNA聚合酶T7DNA聚合酶修饰的T4DNA聚合酶逆转录酶耐热性DNA聚合酶,（一）耐热性DNA聚合酶,1956年，美国Kornberg从大肠杆菌中分离出来。由大肠杆菌基因polA编码，单链多肽蛋白质。分子量：109kD球形，65埃,（二）大肠杆菌DNA聚合酶I（E.coliDNApolI）,1.DNA聚合酶I反应需要的条件:全部4种脱氧核苷三磷酸,和Mg+.dATPdCTPdTTPdGTP带有3-OH游离基团的引物链.,2.DNA聚合酶I催化的反应(1)聚合反应:53方向DNA聚合酶I催化的聚合反应是在引物链3-OH与dNTP分子的-P-基团间.dNTP接上后,又提供了1个3-OH末端,继续连接dNTP分子.合成方向是53,(2)53核酸外切酶活性:,(3)35核酸外切酶活性:,polI,3、DNA聚合酶I在基因工程中的应用,DNA缺口转移（nicktranslation）反应用于分子克隆。制备高比活的DNA探针。,DNA缺口转移线状分子,制备高比活的DNA探针,25l1g纯化的目的基因DNA片段；适量的DNaseI；DNA聚合酶；32P-dNTPs；dNTPs；,典型的反应体系：,（二）大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段与DNA末端标记,Klenow聚合酶的特点：分子量：76103dal具有聚合酶的活性具有3-5的核酸外切酶的活性。,DNA聚合酶I,MW：34103dal：53核酸外切酶活性。,MW：76103dal：Klenow片段酶，保留DNA聚合酶活性和35核酸外切酶活性。,枯草杆菌蛋白酶,Klenow聚合酶的应用：cDNA克隆中第二链合成的催化补平双链DNA的3凹端。标记DNA片段的末端：带标记的dNTPDNA序列测定：Sanger末端终止法,cDNA克隆中第二链合成的催化,5GATCT33A5,5GATCT3332P-GA5,5GATCT3332P-AGA5,具有3隐蔽末端的DNA片段,Klenow酶，32P-GTP（加入的种类根据5末端决定）,Klenow酶，32P-GTP，32P-ATP,补平双链DNA的3凹端。标记DNA片段的末端：带标记的dNTP,DNA序列测定：Sanger末端终止法,（三）T4DNA聚合酶,从T4噬菌体中分离的噬菌体基因43编码具有53聚合酶活性具有35核酸外切酶活性，是Klenow片段的200倍左右。取代反应。,取代反应特点：当反应混合物中没有dNTP时，T4DNA聚合酶只有3-5核酸外切酶活性，从3-OH端降解DNA。当反应混合物中仅有1种dNTP时，3端降解在暴露出互补的核苷酸时停止。,32P标记的核苷酸,ATCGTACAG,TAGCATGTC,5,5,3,3,ATCGTAC,CATGTC,ATCGTACAG,TAGCATGTG,T4DNA聚合酶，dGTP,具有3-OH末端的DNA片段,加入32PdNTPs,32P标记的核苷酸逐渐取代了外切酶删掉的原有核苷酸取代反应。,（四）反转录酶,把RNA转录成DNA的酶。又叫依赖RNA的DNA聚合酶，或RNA指导的DNA聚合酶。1970年发现，在多种肿瘤病毒中发现，常见的AMV（鸟类骨髓母细胞瘤病毒的反转录酶）。包括：链：65103dal链：95103dal,酶活性：RNA指导的DNA聚合酶活性DNA指导的DNA聚合酶活性RNaseH活性：RNaseH是一种专门切割DNA与RNA杂交链上RNA分子的酶,RNA模板,DNA引物,AMV,DNA,RNA,AMV,AMV,催化以DNA和RNA为模板，以4种三磷酸核苷（ATP、UTP、CTP、GTP)为底物，合成一条