西红花中西红花苷Ⅰ和苷Ⅱ的含量测定.pdf

第 6 卷 第 7 期 食 品 安 全 质 量 检 测 学 报 Vol. 6 No. 7 2015 年 7 月 Journal of Food Safety and Quality Jul. , 2015 基金项目: 上海市科委科技行动计划 Fund: Supported by the Science and Technology Plan of STCSM *通讯作者: 钱勇, 工程师, 主要研究方向为中药和健康产品检测及成分研究。E-mail: qianyong2232 *Corresponding author: QIAN Yong, Engineer, Shanghai Standard Biotech Co., Ltd., Building 2, Room 103, No.720, Cailun Road, Shanghai 201203, China. E-mail: qianyong2232 西红花中西红花苷和苷的含量测定 钱 勇 1*, 许纪锋1, 诸 晨1, 沈君子1, 金金花2, 梅利中2, 谢天培3 (1. 上海诗丹德生物技术有限公司, 上海 201203; 2. 上海华浦中药饮片有限公司, 上海 201308; 3. 上海佰年诗丹德检测技术有限公司, 上海 201203) 摘摘 要要: 目的目的 建立高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)测定西红花苷和西红花 苷含量的分析方法, 并对比了不同产地中西红花苷和西红花苷的含量。 方法方法 对不同产地西红花样品采 用 90%乙醇超声提取, 提取溶液采用反相色谱柱 Ultimate XB-C18(4.6 mm250 mm, 5 m) 检测, 以乙腈:水 =32:68 (V:V)(0.1%甲酸)为流动相, 流速 1.0 mL/min, 柱温 35, 检测波长 440 nm。结果 结果 西红花苷在 15300 g/mL 与峰面积积分值成良好的线性关系(r2=0.9996), 西红花苷平均加样回收率为 96.6%, RSD 为 1.69%; 西红 花苷在 12240 g/mL 范围内与峰面积积分值成良好的线性关系(r2=0.9998), 西红花苷平均加样回收率为 96.1%, RSD 为 1.58%。 不同西红花由于产地和种植不同, 西红花苷和西红花苷含量差异较为明显。 结论结论 该 方法简单、灵敏、稳定、可靠, 可用于不同西红花中西红花苷和西红花苷的含量测定。 关键词关键词: 西红花; 西红花苷; 西红花苷; 高效液相色谱法; 含量测定 Determination of crocusand crocusin saffron QIAN Yong1*, XU Ji-feng1, ZHU Chen1, SHEN Jun-Zi1, JIN Jin-Hua2, MEI Li-Zhong2, SXIE Tian-Pei3 (1. Shanghai Standard Biotech Co., Ltd., Shanghai 201203, China; 2. Shanghai Huapu Medicine Decoction Pieces Co., Ltd., Shanghai 201308, China; 3. Shanghai 100 Standard Testing Co., Ltd., Shanghai 201203, China) ABSTRACT: Objective To develop a method for determination of crocus and crocus in saffron by high performance liquid chromatography (HPLC), and compare the content of crocusand crocus in different saffron. Methods The saffron was extracted by ultrasonic in 90% ethanol solution. Separations of extraction solution were carried out on an Ultimate XB-C18 (4.6 mm250 mm, 5 m). The mobile phase(volume rate)was ACN:H2O = 32:68 (V:V) (0.1% methanoic acid), the flow was 1.0 mL/min, column temperature was 35 , and the detection wavelength was 440 nm. Results Crocus had a good linearity with the peak areas in 15300 g/mL (r2=0.9996). The average recovery was 96.6% and the RSD was 1.69%. Crocus had a good linearity with the peak areas in 12240 g/mL(r2=0.9998). The average recovery was 96.1% and the RSD was 1.58%. The difference of content of crocus and crocus was obvious in different cultivated fields. Conclusion This method is simple, sensitive, specific, and reproducible, which can be used as the method for measuring the content of crocus and crocus in saffron. KEY WORDS: saffron; crocus ; crocus ; high performance liquid chromatography; determination of content 第 7 期 钱 勇, 等: 西红花中西红花苷和苷的含量测定 2823 1 引 言 西红花为鸢尾科植物番红花(Crocus sativus L.) 的干燥柱头。近年来国内外大量研究表明, 西红花具 有活血化瘀、凉血解毒、解郁安神功能, 对黄曲霉毒 素 B1 以及各种急性毒物引起的肝损伤有显著的肝保 护作用, 西红花的乙醇提取物对正常大鼠及学习记 忆功能低下大鼠的学习和记忆能力有影响; 西红花 的热水萃取物对凝血有明显的抑制作用1-3。西红花 中主要成分为胡萝卜素及多糖苷类等, 主要包括西 红花苷、 西红花苷、 西红花苷、 西红花二甲酯、 胡萝卜素、-西红花酸、西红花苦素、西红花醛、西 红花苦苷、玉米黄质、原西红花素等。其中西红花苷 和西红花苷为其主要成分4-7, 结构图如图 1 所 示。西红花用途广泛, 在西班牙、法国等国家是必不 可少的食品香料。 在我国, 由于西红花具有活血化瘀, 特别是治疗月经不调、闭经、痛经、产后恶露不尽等 多种功效, 被誉为女性专用补品, 也作为西红花茶被 食用8-10。目前对西红花苷和西红花苷的测定方 法研究较少, 采用的方法包括紫外吸收法、薄层色谱 法 、 高 效 液 相 色 谱 法 (high performance liquid chromatography, HPLC)11-16, 从灵敏度、 准确性上看, HPLC 方法是目前最为有效的方法, 但是往往存在处 理繁琐、检测灵敏度或者分离度不高等问题11,12,16。 图 1 西红花苷(1)和西红花苷(2)的结构图 Fig. 1 Structure of crocus(1) and crocus (2) 2824 食品安全质量检测学报 第 6 卷 本文通过总结前人研究方法, 建立了西红花中西红 花苷和西红花苷的高效液相色谱测定方法, 并 对市售西红花中西红花苷和西红花苷的含量进 行测定, 以研究西红花苷在西红花的不同生产环境 中的含量变化规律, 为西红花的等级评定和质量控 制提供依据。 2 材料与方法 2.1 材料与试剂 西红花苷和西红花苷对照品(含量均按 98.5%计, 中国食品药品检定研究院)。西红花样品均 为市售品, 乙腈(色谱纯, 上海安谱实验科技有限公 司), 水为本实验室自制超纯水, 甲酸(分析纯, 国药 试剂), 乙醇(分析纯, 国药试剂)。 2.2 仪器与设备 Agilent1260 高效液相色谱, 带 Chemstation 色谱 工作站(美国安捷伦科技有限公司); 岛津十万分之一 电子天平(日本岛津); ELGA 纯水机(英国埃尔格); HS-800D 数显控温水浴锅(太仓市华利达实验设备有 限公司); Fresco-21 常温离心机(美国赛默飞世尔科技 公司)。 2.3 方法过程 2.3.1 色谱条件 色谱柱: Ultimate XB- C18(4.6 mm250 mm, 5 m), 流动相: 乙腈:水=32:68 (V:V)(含 0.1%甲酸)。体 积流量为 1.0 mL/min, 检测波长为 440 nm, 柱温 35。 2.3.2 对照品溶液的制备 精密称取西红花苷对照品 15.0 mg 和西红花苷 对照品12.0 mg 置于25 mL容量瓶中, 加流动相液稀 释至刻度, 摇匀, 得西红花苷标准贮备液浓度为 0.60 mg/mL, 西红花苷标准储备液浓度为 0.48 mg/mL。 图 2 西红花高效液相色谱图 Fig. 2 Liquid chromatogram of saffron (1:西红花苷, 2: 西红花苷; A 为西红花提取样品, B 为对照品) (1: crocus, 2: crocus; A: reference standards of crocusand crocus; B: extract sample of saffron) 第 7 期 钱 勇, 等: 西红花中西红花苷和苷的含量测定 2825 2.3.3 供试药材溶液的制备 取样品西红花粗粉约 0.1 g, 精密称定, 置于 100 mL棕色量瓶中, 加90%乙醇约60 mL, 40超声提取 20 min, 提取 2 次, 放置至室温, 加乙醇至刻度, 摇 匀, 精密移取 2 mL 上述溶液至 10 mL 量瓶中, 用流 动相定容至刻度, 摇匀, 过 0.45 m 微孔滤膜, 作为 供试品溶液。 3 结果与分析 3.1 线性范围的考察 分别精密量取西红花苷对照品标准贮备液适 量, 用流动相分别稀释成浓度为 15、 30、 60、 150、 300 g/mL 的 5 个工作液, 按照上述色谱条件分别进样 10 L, 测定。分别精密量取西红花苷对照品标准贮备 液适量, 用流动相分别稀释成浓度为 12、 24、 48、 120、 240 g/mL 的 5 个工作液, 按照上述色谱条件分别进 样 10 L, 测定。 以峰面积值(Y)为纵坐标, 对照品进样 量(X)为横坐标绘制标准曲线, 西红花苷回归方程为: Y=36655X+8.3597(r2=0.9996), 西红花苷在 15300 g/mL 范围内呈良好的线性关系; 西红花苷回归方 程为: Y=12606X-0.0905, (r2=0.9998)西红花苷在 12240 g/mL 范围内呈良好的线性关系。 3.2 精密度试验 分别取西红花苷和西红花苷标准溶液, 连 续进样 6 次, 每次 10 L, 分别测得西红花苷峰面 积 RSD 为 0.65%, 西红花苷峰面积 RSD 为 0.95%, 表明仪器的精密度好。 3.3 稳定性试验 分别取西红花苷和西红花苷标准溶液, 每 隔 0、1、2、4、8、12、24 h 进样一次, 连续进样 7 次, 每次 10 L, 分别测得西红花苷峰面积 RSD 为 0.55%, 西红花苷峰面积 RSD 为 0.75%, 表明对照 品溶液在放置 24 h 内稳定。 3.4 重现性试验 精密称取同一批次西红花样品粗粉 5 份, 按上 述供试品制备方法制得供试品溶液, 按色谱条件 检测, 进样量为 10 L, 分别计算西红花苷和西 红花苷含量, 西红花苷和西红花苷含量平均 值分别 79.5 mg/g 和为 28.6 mg/g, RSD 分别为 1.75%和 1.42%。 3.5 加样回收率试验 取已知含量的西红花样品粗粉 6 份, 精密称定, 分别准确加入西红花苷和西红花苷标准贮备液 0.5、1、2 mL 各 2 份, 按上述供试品制备方法制得供 试品溶液, 按色谱条件检测, 进样量为10L, 测得西 红花苷和西红花苷加样回收率分别为 96.6%和 96.1%, RSD 为 1.69%和 1.58%。 3.6 不同产地的西红花苷和西红花苷含量 测定 取市售不同产地的西红花样品, 按上述供试品 制备方法制得供试品溶液, 按色谱条件检测, 进样量 为 10 L, 样品进样 2 次, 测定西红花苷和西红花 苷的含量, 测定结果见表 1。 表 1 不同产地西红花中西红花苷和西红花苷的含量(n=3) Table 1 Content of crocusand crocus in different saffron (n=3) 品系 名称 西红花苷(%) 西红花苷(%) 西红花苷和总和(%) RSD(%)(和之和) 伊朗 XHH-1 7.97 2.87 10.84 1.57 XHH-2 5.65 1.64 7.29 1.78 XHH-3 2.14 0.73 2.87 1.15 XHH-4 0.85 0.37 1.22 0.98 XHH-5 8.35 3.10 11.45 1.59 XHH-6 6.20 2.65 8.85 1.46 2826 食品安全质量检测学报 第 6 卷 续表 1 品系 名称 西红花苷(%) 西红花苷(%) 西红花苷和总和(%) RSD(%)(和之和) 浙江 XHH-7 14.10 4.70 18.80 1.36 XHH-8 3.28 1.15 4.43 0.95 XHH-9 10.20 3.65 13.85 1.85 XHH-10 12.51 4.24 16.75 1.25 XHH-16 8.56 3.10 11.66 0.87 XHH-11 14.65 4.74 19.39 1.46 上海 XHH-12 11.34 4.87 16.21 1.75 XHH-13 23.47 8.92 32.39 1.55 XHH-14 10.25 3.74 13.99 1.11 XHH-15 7.54 2.64 10.18 0.83 XHH-16 13.26 4.85 18.11 0.98 西班牙 XHH-18 6.32 1.75 8.07 1.67 XHH-19 4.34 1.58 5.92 1.32 XHH-20 7.32 2.54 9.86 1.72 XHH-21 9.32 3.46 12.78 1.82 4 结论与讨论 采用高效液相色谱法对4个主要产地, 21种不同 批次的西红花中西红花苷和西红花苷含量进行 测定, 结果表明西红花中的西红花苷和西红花苷 变化差异大, 这种差异在不同产地之间均存在, 可 能西红花中的西红花苷和西红花苷含量与种类 及种植过程有较大的关系17。 整体而言, 上海产的西 红花苷和西红花苷的含量较其他地方高, 但是 批次间差异也较大。中国药典规定, 西红花苷和西 红花苷的含量之和不得小于 10.0%。本研究为选择 较高含量西红花品种提供了参考, 也为分离提取西 红花中的西红花苷和西红花苷的检测工作提供 了依据。 西红花苷和西红花苷在西红花中的含量整 体较高, 本研究发现, 西红花苷均比西红花高, 且相互之间有一定的比例关系(在 24 倍之间)。 本研究通过方法学验证, 证明该方法有较好的 线性、精密度和回收率, 与前期研究方法相比11,12,16, 受西红花中其他苷类物质干扰较少, 分离度较好, 具 有很好的准确性, 可作为西红花中西红花苷和西 红花苷的质量控制方法。 参考文献 1 国家药典委员会. 中华人民共和国药典(一部)M. 北京: 中 国医药科技出版社, 2010. 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