抗氧化剂抗氧化活性的测定方法_二_王会.pdf

抗氧化剂抗氧化活性的测定方法( 二) 王 会1 郭 立2 谢文磊1 1( 河南工业大学化学化工学院, 郑州, 450052) 2( 河南省粮油机械工程有限公司, 郑州, 450003) 摘 要 综述了抗氧化剂抑制脂质氧化、清除自由基、抑制自由基对底物的氧化降解以及还原能力 4 类测定抗 氧化活性的方法, 并讨论了评价或表征测定结果的方法和参数以及对测定方法的要求。 关键词 抗氧化剂, 抗氧化活性, 测定方法 第一作者: 硕士研究生( 谢文磊为通讯作者) 。 此篇文章续本刊 2006, 32( 3) : 92 96 收稿日期: 2005-12-05 3. 3 以抗氧化剂抑制自由基对底物的氧化降解为基 础的方法 此法与 3 . 1. 3 . 2 方法不同之处在于测试体系中 既有底物又有自由基 ,但底物自身不能生成自由基, 它与外源自由基反应 ,形成有荧光或带颜色的特征物 质,抗氧化剂的加入使生成的特征产物减少 ,由此可 测得抗氧化活性 。 3. 3. 1 ORAC 法 ORAC( oxygen radical absorbance capacity , 氧自 由基吸收能力) 法是近年来由 Cao 等人 31 在 Glaz- er 32 研究的基础上发展起来的 ,原理如下 : 天然蛋白 质-藻红蛋白( -phycoerythrin,-PE) 在540 nm 光波 激发下可发射 565nm 的荧光 。在有自由基或氧化剂 时, -PE 的荧光逐渐减弱 ; 当有抗氧化剂存在时 ,- PE 的荧光减弱被抑制 。自由基或氧化剂可用 AAPH ( 产生过氧自由基) 、H2O2- Cu2 +( 主要产生 HO) 和 Cu2 +。使用 AAPH 时,可测量所有公认的抗氧化剂, 如抗坏血酸 、 -生育酚 、 -胡萝卜素 。使用 Cu2 +- H2O2 时,可测量甘露醇、 葡萄糖 、 尿酸以及过渡金属螯合剂 这类物质, 不用于测定抗坏血酸、 -生育酚 33 。测定 结果以 Trolox( 标准抗氧化剂) 当量表示 。 此法是一种新的 、 独特的评价各种物质抗氧化活 性的方法。该法优于其他类似方法 32, 34的原因有 2 个:( 1) 使用了曲线下面积( AUC) 的方法 , 将抗氧化 剂对自由基作用的抑制时间和抑制程度结合成一个 单独的量 。其他类似的方法是在固定抑制率时使用 抑制时间或在固定的时间内使用抑制率作为定量分 析的基础 。( 2) 此法使用不同的自由基生成剂或氧化 剂,这点很重要 ,因为抗氧化活性与分析中使用的自 由基或氧化剂有关, 而且 PE 和自由基间的反应完 全。在 ORAC 法中, AAPH 与抗氧化剂的摩尔比非 常高( 超过 2 000) , 使得此法专一性强, 测量的是抗氧 化剂直接清除自由基的能力, 由于使用荧光技术, 此 法也能测量含有抗氧化剂的稀释的油乳状液。此法 测得的是总的抗氧化活性 ,而且可自动化 、 标准化 ,但 需要全自动系列化分析仪。该法最初用于测定生物 体系中的抗氧化剂, 后来广泛用于天然酚类物质和食 品( 如茶叶 、 蔬菜 、 水果和草药提取物) 的测定 。 3. 3. 2 TRAP 法 Wayner 等人的 TRAP( total radical trapping an- tioxidant parameter ,总自由基清除抗氧化能力) 法 35 是过去 10 年中测量血浆或血清总抗氧化能力最广的 方法 。该法中的过氧自由基由 AAPH 产生, 在向血 浆中添加完 AAPH 后, 通过测量反应过程中消耗的 氧检测底物的氧化状况。在诱导期内,氧化被血浆中 的抗氧化剂抑制。结果以血浆的诱导期与标准抗氧 化剂 Trolox 的诱导期的比值表示 。而 Ghiselli 等人 报道的 TRAP 法 34基本上是 Glazer 法 32的复制。 Glazer于 1990 年发表的 TRAP 法用 AAPH 产生过 氧自由基或用 Cu2+-抗坏血酸产生HO,氧化底物 B- 或R-PE( 藻红蛋白) 。Glazer 假定在过氧自由基或 HO存在时, PE 荧光的减弱与时间呈线性关系。由 试样保护 PE 防止过氧自由基或 HO氧化的诱导期 与 Trolox 诱导期的比值定量给出试样的抗氧化能 力。然而, PE 荧光淬灭的速度与过氧自由基或 HO 不是线性关系, 而且诱导期一般很难测定 36。 Ghiselli 等人的 T RAP 法 34和 ORAC 法使用同 样的测试体系, 不同之处在于动力学曲线以及由动力 学曲线计算出的抗氧化活性。TRAP 法 34 中 PE 荧 光的减弱与时间呈线性关系( 以恒定的速率减弱) ,直 到荥光减弱 80%; 而 ORAC 法 37中荧光强度的减小 随时间减慢( 不以恒定的速率进行) 。造成这个差异 最可能的原因是 PE 的起始浓度不同 。TRAP 法的 食品与发酵工业 FOOD AND FERMENTATION INDUSTRIES 98 2006 Vol. 32 No. 4 ( Total 220) 抗氧化活性可用图表法、诱导期计算; 在 ORAC 法 中,抗氧化能力用动力学曲线下的面积计算。二者都 以 Trolox 当量的形式来表示 。 3. 3. 3 DCFH-DA 法 Valkonen 和 Kuusi 报道的 DCFH-DA( dichoroflu- orescin-diacetane , 二氧荧光素二乙酸酯) 法也是测定 总的自由基清除能力 38。AAPH 产生的过氧自由基 氧化 DCFH-DA , 生成 DCF( dichlorofluorescein, 二氯 荧光黄) 。DCF 有很强的荧光( Ex480 nm , Fm526 nm) , 在 504 nm 也有吸收,因此可用荧光法或分光光 度法检测 。 在此法中, DCF 的荧光的形成或吸光度的出现 包括 4 个阶段 : 第一延滞期( the first lag phase) 是由 于样品中的抗氧化剂形成的, 它们被过氧自由基消耗 完后反应进行到第一传播阶段( the first propagation phase) ; 由于在第一传播阶段添加的内标抗氧化剂 Trolox 中断此传播阶段, 致使第二延滞期开始, 相应 的反应随 Trolox 的消耗进入第二传播阶段 。由第一 延滞期与第二延滞期的比值可得出样品的抗氧化能 力。 3. 3. 4 化学发光法 化学发光( chemiluminescence ,CL) 法的基本原理 是活性自由基氧化发光剂( 常用的发光剂有 luminol ( 鲁米诺) 、lucigenin( 光泽精) 等 , 形成的发光剂自由 基能发光 ,发出的光可由发光计检测 ,容易记录。抗 氧化剂是活性自由基清除剂,它能抑制 CL ,使发光强 度减弱,通常有一个明确的诱导期( tIND) 。抗氧化活 性以 T rolox 当量的形式给出。由抗氧化剂抑制 CL 的能力( 由 tIND估算) 与 Trolox 抑制 CL 能力的比值 可定量得出样品的抗氧化能力 。 CL 法最初是由 Metsa-ketela 等人提出, White- head等人 39 加以改进, 用于分析生物体液的抗氧化 活性。此法用 H2O2或过硼酸盐氧化 luminol, 反应由 辣根过氧化物酶( HRP) 催化 。通常,此反应产生的发 射光强度低, 易快速消减。通过向反应中添加对-碘 苯酚( 增强剂) 能极大提高发射光强度, 延长发射光时 间并使发射光稳定。发射光对抗氧化剂的干扰灵敏, 当反应中添加的所有抗氧化剂被消耗完时能再恢复。 除上述方法外, 产生 CL 的方法还有多种( 见表 2) 。 CL 法操作简单、快速, 每次操作只要几分钟 ,容易自 动化。大多数 CL 法用于测定生物样品, 它们也容易 应用于食品的测试。 3. 3. 5 -胡萝卜素漂白法 45 - 胡萝卜素漂白法( -carotene bleaching test) 是 根据乳状液中的亚油酸能自动氧化 ,生成的自由基与 -胡萝卜素反应, 引起 -胡萝卜素的黄色衰减( 在 470 nm 处吸光度减小) ; 在有抗氧化剂存在时, -胡萝卜 素漂白的速率被减缓 。 表 2 产生 CL 的方法 自由基源活性自由基发光剂参考文献 AAPH过氧自由基luminol40 ABAP过氧自由基luminol41 EDTA/Co( +2) /H2O2OH42 叶黄素 -hypoxantine -氧化酸O2luminol43 黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶O2-lucigenin44 该法给出的抗氧化活性是通过抑制率来表示的, 且测试体系是在非控制条件下进行的( 自动氧化) ,不 能得到重复的数据, 因此很少用于定量测定。如果将 自动氧化改成可以控制的反应( 如使用自由基引发 剂) , 此法就可修改成一个能定量和具有重现性的方 法。 -胡萝卜素漂白法使用的是乳化的脂质 , 而在乳 化的脂质乳状液中影响被测物抗氧化活性的因素增 加,很难得到重复性的结果。如果不考虑这一点 ,- 胡萝卡素漂白法是很有价值的 ,特别是对于研究脂溶 性抗氧化剂。但是, 此法不适合测定水溶性的化合 物。 3. 3. 6 藏花素漂白法 藏花素漂白法( crocin bleaching test) 最初是由 Bors 等人 46 提出、Tubaro 等人 47加以改进, 用于测 定复杂混合物和食品的抗氧化能力 。藏花素是一种 天色化合物( 类胡萝卜素的一种) , 在可见光区( 443 nm) 46, 47 有强吸收 。在有过氧自由基( 可由 AAPH 或ABAP 热分解生成) 时, 藏花素颜色变浅( 被漂 白) ; 添加抗氧化剂后 ,藏花素的漂白速率减慢 。 藏花素漂白法是一种动力学方法 。对于单一化 合物 A,在加入偶氮化合物( 提供过氧自由基) 之后, 藏花素漂白的速率在大约 1 min 内呈线性关系 ,记录 没有抗氧化剂时藏花素漂白的速率( V0) 与有抗氧化 剂存在时的漂白速率( V) , 通常记录 10 min ,二者的 比率符合方程 V0/ V = 1+ ( ka/kc) ( A/ C) 。其 中, A 和 C 分别是被测抗氧化剂和藏花素的浓 度,kc 和 ka 是过氧自由基分别与藏花素和抗氧化剂 反应的速率常数 46 ,47 , ka/kc 可由 A/ C 对 V0/ V 的线性回归方程的斜率计算, ka/kc 表明被测物与 过氧自由基相互作用的相对能力, 由此可测得 V0/V 的值。用 Trolox 的 ka/kc 除以被测抗氧化剂的 ka/ kc, 得到的就是以“Trolox 当量”表示的被测化合物的 综述与专题评论 2006 年第 32 卷第 4期( 总第 220 期)99 抗氧化能力。对于复杂的抗氧化剂混合物,这种方法 测得的是总的抑制效果。 Tubaro 等人认为, 藏花素漂白法提供了一个更 加精确的评价抗氧化效果的方法 47 。但该法测量的 是被测抗氧化剂与另一种抗氧化剂-藏花素对过氧化 自由基反应的竞争, 而且分析中使用的藏花素的浓度 是固定的( 10 mol/L) , 而在分析中使用多个浓度是 必需的 。Lyssignoli 等人提出一种修改的适合常规测 试的方法 小平板比色法( microplate-based colori- metric assay) ,这种方法使用的是抑制率而不是动力 学方程测定抗氧化活性 48。抑制率%=( Ac-Aa) / Ac 100,其中, Ac 和 Aa 分别是没有抗氧化剂和含 有被测抗氧化剂时的吸光度。 3. 3. 7 KI 法 49 这是一个自动分析法 ,也是一种测定清除过氧自 由基活性的方法 。该法以 PV 法的原理为基础 , 用 AAPH 产生的过氧自由基取代脂质过氧化物, 将 KI 氧化生成碘分子。抗氧化剂抑制过氧自由基引起的 氧化 ,使碘释放的速率降低。氧化生成的碘的量可通 过自动电位滴定仪用硫代硫酸钠滴定得出 。此法简 单,可用于测定各种植物提取物和类黄酮的抗氧化活 性。 3. 3. 8 TOSC 法 TOSC( total oxyradical scavenging capacity , 总氧 自由基清除能力) 法是 Regoli 和 Winston 等人提出的 一种相当新的测量体外抗氧化活性的方法 50 ,51。此 法是根据过氧自由基 、 过氧化氮或OH 将 KMBA( - keto -methiolbutyric acid) 氧化, 生成乙烯( ethylene) , 生成的乙烯可用顶空气相色谱检测。在有抗氧化剂 存在时 ,抗氧化剂与 KMBA 对过氧自由基竞争反应, 乙烯的形成被部分地抑制 。TOSC 值可根据方程 TOSC=100-( SA/ CA 100) 来计算, SA 和 CA 分别是被测样品和空白反应的动力学曲线下的 积分面积 ,TOSC 值由0 100。此值给出的是某一化 合物在特定浓度下的抗氧化能力。 抗氧化剂对过氧自由基的竞争以不同的方式影 响 KMBA 的氧化速率。但是由于使用曲线下面积的 方法 ,TOSC 的计算不受这些变量的影响。 TOSC 法 最初用于研究海洋生物的氧化应激 ,如扇贝、企鹅等, 在食品方面使用的很少, 而且都只限于用过氧自由基 ( 由ABAP 生成) 。TOSC 法灵敏度高, 可在较低的浓 度( mol/L) 范围内检测 51 ; 既可用于复杂生物样品 的测定 ,也可用于纯抗氧化剂溶液的测定 ; 既适合测 定水溶性抗氧化剂 ,也适合检测脂溶性抗氧化剂, 还 能检测促氧化剂。此法用一个普通的气相色谱体系 即可完成, 但是由于需要经常注射, 所以费时 ,劳动强 度大 ,不适合大批量的检测。由于添加到测试体系的 抗氧化剂的浓度和体积的不同以及由此需要其他试 剂的体积的不同 ,使得此法的标准化程度低。 3. 4 抗氧化剂的还原能力 3. 4. 1 FRAP 法 FRAP( ferric reducing antioxidant power ,铁离子 还原抗氧化剂能力) 法的原理如下 : 在低 pH 下 ,抗氧 化剂( 还原剂) 将 Fe3 +-TPTZ( tripyridyltriazine , 三吡 啶三嗪) 还原成 Fe2 +-TPTZ , Fe2+-TPTZ 呈蓝色 , 在 593 nm 处有强吸收 52, 也有在 585 nm 53 和 600 nm 54处测定的。结果以 Fe2+当量或相对于标准抗 氧化剂的能力来表示 。此法真正测量的是被测物将 Fe3 +还原成 Fe2+的能力 。有些抗氧化剂( 如抗坏血 酸和尿酸) 既能还原活性物质( 如OH) , 也能还原 Fe3 +,它们还原 Fe3+的能力反映了它们的抗氧化能 力,但是能还原 Fe3+的不都是抗氧化剂 。此外 ,能有 效还原促氧化剂的抗氧化剂不一定能有效地还原 Fe3 +,如 GSH 。 FRAP 法操作简单快速, 重复性好, 易于标准化, 最初用于测量血浆的活性 ,后来也用于测定其他生物 体液 、 食品 、 植物提取物、果汁等的抗氧化活性 。但不 能用于测量含有 SH 的抗氧化剂 。 3. 4. 2 循环伏安法 多年来 ,循环伏安法( cyclic voltammetry ,CV) 主 要用于测定分子之间发生的电子转移。近来 Kohen 等人 55用 CV 法评价生物体液或组织匀浆液中低分 子量抗氧化剂的总还原能力。 CV 法测试体系是由工作电极( 如玻璃化碳电 极) 、参比电极( Ag/AgCl) 和辅助电极( 铂丝) 组成的。 工作电极使用的电压是恒速( 100 mV/s) 的, 正电压 用于评价还原物质, 负电压评价氧化物。将含有被测 物的样品放入测试体系中, 记录电压电流曲线, 得出 循环伏安图 ,此图通常是一个峰形或 S 形的曲线 。电 流曲线的形状和电流的大小是由许多因素决定的 ,如 所使用电压的形式 ,电极的大小和结构 , 电子转移所 需能量的大小, 电极表面和电活化分子间的相互作 用。电流曲线在电压轴( 伏安图的 x-轴) 的位置可以 测定 ,也就是峰电流所对应的电压 峰电位 Ep( a) 或 拐点所对应的电压( 半波电位, 电流增加到一半时的 电压, E1/2) ( 见图 2) , 峰电位 Ep( a) 也就是半波电位 食品与发酵工业 FOOD AND FERMENTATION INDUSTRIES 100 2006 Vol. 32 No. 4 ( Total 220) E1/2。试样的还原能力由 2 个参数组成: 峰电位 Ep ( a) 和阳极电流( anodic current ,AC) 。E1/2与还原剂 的类型有关 : E1/2越低 ,被测化合物提供电子给工作 电极的能力就越高 。阳极电流 AC( 是由电流曲线与 y 轴的交点测得的) 取决于许多参数( 电极的面积 ,所 使用电压的速率) , 并且在任何电压下都与还原剂的 总浓度有关 56, 因此可用于分析检测浓度 55。这 2 个参数提供了还原型抗氧化剂( 它们能提供电子) 类 型的有关信息以及它们的总浓度。 图 2 抗坏血酸( 0. 5 mmol/ L 和-NADPH ( 0. 5mmol/ L) 的循环伏安图 在测定抗氧化活性的各种方法中, CV 法是一种 很有前途的方法 。到目前为止 ,使用 CV 法已经研究 了许多天然酚类抗氧化剂的抗氧化活性 。此法也能 测定含复杂抗氧化剂混合物的食品 , 如葡萄酒 57 和 茶 58 。CV 法测得的是复杂混合物总的抗氧化能力, 不能测定复杂混合物中的单一抗氧化剂 。由于各单 一底物的峰的重叠, 由循环伏安图看到的峰较宽。在 这种情况下,建议使用电流曲线下的面积( 即电流的 积分) 而不是用电流自身表示食物样品中抗氧化剂的 量 57 。但是 ,不是所有的抗氧化剂都能以足够的速 率将它们的电子供给玻璃化碳电极 。例如,巯基化合 物( 如谷胱甘肽) 55 ,这时可用其他电极测定( 如 Au/ Hg 电 极) 。CV 法 不可 逆 , 敏感 度 相当 低 ( 1 10 mol/L) 55 ,但是结果可靠 ,重复性好,适于比较研 究。CV 法是一种便宜 、 高效的替代HPLC 的方法。 4 各种测试方法的比较 通常 ,用不同方法测得的抗氧化活性的数据相关 性很差。因此( 1) 不同的方法测量的目的不同 , 如 TEAC 法和 ORAC 法测量的是抗氧化剂抑制体系中 活性自由基引起的氧化还原反应的能力 ,而FRAP 法 测量的是被测物的还原能力。( 2) 天然抗氧化剂和生 物体液一般是混合物 ,其中每一种物质对不同测量方 法有不同的贡献 。例如, 尿酸对总的FRAP 法的贡献 占 60%, 而 GSH 对这个测试方法几乎没有任何影 响,因为测试时使用的 pH 低( pH =3. 6) 。( 3) 评价或 表征抗氧化活性所使用的方法不同 ,如 ORAC 法要 记录所分析的试样中 PE 的过氧化动力学 ,而 TEAC 法使用在给定的时间内( 3或 6 min) 测量被测抗氧化 剂。虽然有所不同, 但在有些情况下也能得到较好的 相关性,如 ORAC 法和 FRAP 法间的相关性。 通常, 对于天然抗氧化剂, 以抑制底物氧化降解 的方法用的较多 ; 对于生物试样, 则多用测定其清除 自由基能力的方法。每种方法都有优缺点,具体测定 时应根据测量目的选择合适的方法 。一般以脂质氧 化链反应模式为基础的方法更适合 ,而且更灵敏, 但 是这种方法大多费时 ,而且需要有化学动力学的知识 为基础。因此, 不适合天然产物的常规测试。 抗氧化剂清除自由基的方法已经发展得很完善, 如DPPH 和ABTS 法。这些方法效率更高, 操作更容 易,而且它们能提供关于具有抗氧化活性的物质清除 稳定自由基( 如 DPPH和ABTS ) 能力的信息。好的 清除自由基的方法能最近似地估计出抗氧化活性。 然而 ,用这些方法得到的数据不能定量给出物质抑制 氧化过程的能力的信息。此外 ,由于测定时的具体操 作对测定结果有很大的影响, 如试剂的浓度和混合的 时间等 ,而且天然产物和生物试样几乎是不可重复 的,因此这些方法的重复性差, 但可通过对具体操作 方法标准化加以解决 。 参考文献 31 Cao G , Alessio H M , Cutler R G. 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