高效液相色谱法测定面条中柠檬黄、日落黄含量的不确定度分析.pdf

第 5 卷 第 7 期 食 品 安 全 质 量 检 测 学 报 Vol. 5 No. 7 2014 年 7 月 Journal of Food Safety and Quality Jul. , 2014 基金项目: 贵州省科技厅课题 （黔科合 SY 字20113090 号、黔科平台20124001 号） 、国家局餐饮服务食品安全标准制定项目 Fund: Supported by Guizhou Province Department of Project (Guizhou Branch SY Word 2011 and 3090、Guizhou Branch Platform 2012 4001) and Country catering service project formulating food safety standards *通讯作者: 许乾俪, 主任药师, 主要研究方向为药品质量研究。E-mail: 1500368608 *Corresponding author: XU Qian-Li, Professor of Pharmacy, Guizhou Provincial Food and Drug Inspection Institute, No.142, Shibei Road, Guiyang 550004, China. E-mail: 1500368608 高效液相色谱法测定面条中柠檬黄、日落黄 含量的不确定度分析 杨微微 1, 王俪瓯1, 许乾丽2, 胡立立1, 杨园园2 (1. 贵阳医学院, 贵阳 550004; 2. 贵州省食品药品检验所, 贵阳 550004) 摘摘 要要: 目的目的 建立一种高效液相色谱法测定面条中柠檬黄和日落黄含量的不确定度分析方法。 方法方法 选用无 水乙醇-氨水-水(7:2:1)为样品的提取溶剂, 色谱柱为 Waters SymmetryC18柱(250 mm4.6 mm, 5 m), 流速 1.0 mLmin-1, 柱温: 35 , 流动相以甲醇为 A 相, 以含 0.02 moLL1乙酸铵溶液、1%冰醋酸和 0.2%三乙胺的水溶 液(pH=4)为B相, 进行梯度洗脱,考查实验过程中对含量的测定有影响的所有因素, 确定不确定度来源, 建立结 果数学模型, 计算各个不确定度分量, 从而合成不确定度。结果结果 拟合标准曲线过程中产生的不确定度最大, 其次是样品处理过程中产生的不确定度, 仪器产生的不确定度最小。结论结论 本方法客观、准确, 适用于高效液 相色谱法测定面条中柠檬黄和日落黄含量的不确定度计算, 也可用于计算含量实验方法的不确定度, 在实际 工作中有较强的实用性。 关键词关键词: 面条; 柠檬黄; 日落黄; 含量; 不确定度 Uncertainty analysis determination of citrine and sunset yellow in noodle by HPLC YANG Wei-Wei1, WANG Li-Ou1, XU Qian-Li2, HU Li-Li1, YANG Yuan-Yuan2 (1.Guiyang Medical University, Guiyang 550004, China; 2. Guizhou Provincial Food and Drug Inspection Institute, Guiyang 550004, China) ABSTRACT: Objective To establish a method for the determination and uncertainty analysis of citrine and sunset yellow in noodles by HPLC. Methods The samples was extracted by the solution of absolute ethyl alcohol, ammonia water and clear water (with the ratio of 721), and separated by liquid chromatographic column of Waters SymmetryC18 column (250 mm 4.6 mm, 5 m) flow rate 1.0mL/min, column temperature 35 , using methanol-an aqueous solution of 0.02 mol/L ammonium acetate, 1% acetic acid and 0.2% triethylamine(pH=4)as mobile phase. The factors of affecting the determination of citrine and sunset yellow were investigated, the sources of uncertainty were identified, the mathematic models were established, the components of uncertainty were calculated and the uncertainty was combined. Results The greatest influence on the combined uncertainty was the standard curve, the second influence on the combined uncertainty was the sample processing and the minimum influence on the combined uncertainty was the instruments. Conclusion 第 7 期 杨微微, 等: 高效液相色谱法测定面条中柠檬黄、日落黄含量的不确定度分析 2209 The HPLC method is objective and accurate for determination and uncertainty analysis of citrine and sunset yellow in noodles and calculation of uncertainty in the experimental method of content. It has strong practicability in the practical work. KEY WORDS: noodle; citrine; sunset yellow; content; uncertainty 1 引 言 面条因其制作简单, 食用方便而成为人们餐桌 上常见的食物。传统面条用谷物或豆类的面粉制作 而成, 呈现出制作原料的本色。近年来为吸引顾客, 许多厂家推出了鸡蛋面。鸡蛋面因其在制作过程中 加入鸡蛋, 面条有鸡蛋的香味、诱人的外观及丰富 的营养而广泛受到消费者的喜爱。 但是近年来的“毒 豆芽”“染色馒头”等一系列食品安全事件的发生, 证实了某些不法商贩在面粉里非法添加对人体有害 的工业合成色素从而谋取利益。柠檬黄, 日落黄价 格低廉, 作为食品药品的染色剂能使食品外观呈现 出与蛋黄相差无几、诱人的黄色1-3, 但据我国食 品添加剂使用标准 规定, 允许添加柠檬黄, 日落黄 的食品中不包括面制品4。 因此, 面条中是否添加了 合成色素引起人们的广泛关注, 测定面条中的合成 色素具有重要意义。分析测定面条中人工合成色素 含量的不确定度, 使得实验结果完整, 便于测量者 和管理者对测量结果进行评定。本文以食品安全为 宗旨, 用高效液相色谱5-6测定了面条中合成色素柠 檬黄、 日落黄含量5-12, 并对其检测结果的不确定度 进行分析13-16, 增强了实验检测数据的准确性及完 整性, 在实际生产、检测工作中有较大的实用价值 及意义。 2 材料与方法 2.1 材料与仪器材料与仪器 柠 檬 黄 标 准 物 质 ( 含 量 90.0%, 德 国 Dr. Ehrenstorfer GmbH 公司); 日落黄标准物质(含量 87.0%, 德国 Dr. Ehrenstorfer GmbH 公司); 乙酸铵 (分析纯, 成都市科龙化工试剂厂); 甲醇(色谱纯, 美 国天地试剂公司); 超纯水。 LC-2010AHT 高效液相色谱仪(日本岛津); 分 析天平; XS205 型 BT2202S 精密电子天平(德国 Sanorius 公司); KQ5200DE 型超声波清洗器(江 苏昆山市超声仪器有限公司); 0.45 m 微孔滤膜 (上海净化器件厂)。 2.2 实验方法 2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取柠檬黄对照品 0.01351 g、日落黄对照 品0.04332 g分别置于100 mL容量瓶中, 以水溶解并 定容至刻度, 摇匀, 制得相应浓度为 121.59 g/mL、 376.88 g/mL 的标准贮备溶液。分别精密吸取柠檬 黄、日落黄标准贮备溶液 0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、 2.6 mL 至 25 mL 容量瓶并用水定容至刻度。 2.2.2 供试样品溶液的制备 称取染色鸡蛋面样品(实验室模拟阳性样品)4.00 g, 置于 100 mL 容量瓶中, 加入无水乙醇-氨水-水体 积比(7:2:1)溶液约 80 mL, 置于超声仪中30 、100 HZ 超声 30 min, 取出, 放置室温, 用无水乙醇-氨水- 水(7:2:1)溶液定容, 摇匀, 取上清液过滤, 弃去约 10 mL 初滤液, 精密吸取续滤液 20 mL 置蒸发皿中, 水 浴蒸至近干, 以水溶解残渣并转移至 5 mL 容量瓶中, 以水定容, 摇匀。转移至离心管中, 离心(5000 r/min, 5 min), 取上清液作为供试样品溶液。 2.2.3 色谱条件 色谱柱: Waters Symmetr C18柱( 250 mm4.6 mm, 5 m); 检测波长分别为柠檬黄 425 nm、日落黄 483 nm。柱温: 35 ; 流动相以甲醇为 A 相, 以含 0.02 mol/L 乙酸铵溶液、1%冰醋酸和 0.2%三乙胺的 水溶液(pH=4)为 B 相, 进行梯度洗脱程序; 流速为 1.0 mL/min; DAD 检测器; 进样量: 10 L。 3 结果与讨论 3.1 建立数学模型 A=ac+b (1) cv mL = (2) 由于a和b的计算源于同一组数据, 彼此强相关, 相关系数r(a, b)近似为 1, 根据文献17所述不确定度 传播定律可采用公式(3)、公式(4)计算柠檬黄, 日落 黄浓度的合成标准不确定度。 2210 食品安全质量检测学报 第 5 卷 ( )( )( )( )() ( )( )( )( )( ) ( )( )( ) 222 222 222 22 22 2 a2 a 111 2 11 CCCCC u CuAuubr ab Aabb AbAb u Au au bu au b aaaua Ab u Au au b aau =+ =+ + + =+ ， (3) 被测样品含量的合成标准不确定 ( )( )( )( ) ( )( )( )( ) 2222 2222 22 ( )uu Cu vu mu L CvmL VCv Cv C u Cu vu mu L mLmLmLmL =+ =+ (4) 式中: A所测峰面积值, a工作曲线的斜率, b工 作曲线的截距, c被测液中柠檬黄或日落黄的浓度, g/mL, 试样中柠檬黄、日落黄的含量(mg/kg), V最终定容体积, L20 mL/100 mL 分取比, m试 样质量(g)。 3.2 不确定度分量计算 3.2.1 称量过程引入的不确定度u(m) 用分析天平称量样品, 在称量程范围内, 根据 检定证书可知所用天平的最小分度值为 0.01 g, 按均 匀分布(矩形分布)考虑, u(m)=0.290.01 g=2.900 mg 3.2.2 定容过程引入的不确定度u(v) 定容的不确定度来源于三个方面: 第一, 容量 瓶体积定值的准确性引入的不确定度u1, 容量瓶的最 大允许差为x(mL), 服从均匀分布, 则有u1= 3 x mL; 第二, 实验室温度(21 )与容量瓶校正时的温度 (24 )不相同, 温度变化3(做实验时的温度21 , 校正容量瓶时温度 24 , 故此变化为 3 )引起的 体积不确定度, 水体积膨胀系数为 2.110-4 mL/按 照均匀分布计算, u2= 3 101 . 23 4 v mL; 第三, 实 验人员读取数据时允许 1的不确定度, 按照三角分 布计算则人员读数引入的不确定度为: u3= 0.01 6 以上三项合成得出标准不确定度为: uv= 222 123 uuu+ (5) 代入数值得到: u5=0.0130 mL u100=0.0680 mL 3.2.3 标准系列溶液浓度定值的不确定度uA-1 标准系列溶液由标准物质称量、 定容、 逐步稀释 而得, 其不确定度包括由标准物质的标准不确定度u 标(m1); 标准物质称量过程引入的不确定度u标(m2); 标准溶液稀释时移液产生的标准不确定度u标(f); 标 准溶液定容时产生的标准不确定度u标(v)四个分量产 生的标准不确定度分量。 (1) 标准物质不确定度u标(m1) 由标准物质证书中可知, 柠檬黄标准值的相对 不确定度为1, 日落黄标准值的相对不确定度为 2, 扩展因子k=2, 则其对标准系列溶液浓度定值 的不确定度 u柠檬黄(m1)= 0.01 2 a(柠檬黄)=152.76A; u日落黄(m1)= 0.01 2 a(日落黄)=299.18A (a为工作曲线的斜率, 其值见表 1、表 2) (2) 标准物质称量过程引入的不确定度u(m2) 标准物质的称量质量柠檬黄为 0.01351g, 日落 黄为 0.04332g, 用电子天平称量样品, 在称量程范围 内, 根据检定证书可知所用电子天平的最小分度值 为 0.01mg, 按均匀分布(矩形分布)考虑, 其相对标准 不确定度u(柠檬黄)=0.290.01/13.51=0.021; u(日 落黄)=0.290.01/43.32=0.00067则其对标准系列 溶液定值产生的不确定度为 u柠檬黄(m2)=0.021a(柠檬黄)=6.56A; u日落黄(m2)= 0.00067a(日落黄)=2.00A (3)稀释时移液产生的标准不确定度u标(f) 实验用 5 mL 移液管量取溶液, 允差为0.015 mL; 按公式(5)计算得到 5 mL 刻度吸管引入的不确 定度为: u= 222 123 uuu+=0.0098, 其相对标准不确定 度ur= 0.0098 5 =0.2, 则其对标准系列溶液定值产生 第 7 期 杨微微, 等: 高效液相色谱法测定面条中柠檬黄、日落黄含量的不确定度分析 2211 的不确定度为 u柠檬黄(f)=0.2a(柠檬黄)=61.10A; u日落黄(f)= 0.2a(日落黄)=59.84A (4) 标准溶液定容时产生的标准不确定度u标(v) 25 mL容量瓶引起的标准不确定度u标(v1) 本试验样品采用25 mLA级容量瓶定容, 允许差 为0.03 mL, 按公式(5)计算得到25 mL容量瓶引入 的不确定度为: ur= 222 123 uuu+=0.020, 其相对标准 不确定度u= 0.020 25 =0.08, 则其对标准系列溶液定 值产生的不确定度为 u柠檬黄(f)=0.08a(柠檬黄)=24.44A; u日落黄(f)= 0.08a(日落黄)=23.93A 100 mL容量瓶引起的标准不确定度u标(v2) 由公式(5)计算可知100 mL容量瓶引起的不确 定度为0.068 mL, 其相对标准不确定度u= 0.068 100 = 0.068, 则其对标准系列溶液定值产生的不确定 度为 u柠檬黄(f)=0.068a(柠檬黄)=20.78A; u日落黄(f)= 0.068%a(日落黄)=20.34A 故有uA-1= ()()( )()() 2 v 2 v 2 f 2 m 2 m 2121 标标标标 uuuuu+ 代入数值得到: uA-1(柠檬黄) =167.75A; uA-1(日落黄)=306.72A 3.2.4 高效液相色谱仪测得峰面积的不确定度uA-2; 由校准证书上可知, 岛津LC-20A高效液相色谱 仪的定量重复性为0.4%, 按均匀分布计算, 则液相 色谱仪的标准不确定度为uA-2= 0.4% 3 3 =0.0023A 3.2.5 残差的标准不确定度u A-3 用柠檬黄、日落黄标准溶液制定标准曲线, 其 测量结果如表1、表2, 标准系列进样体积均为10 L。 回归直线方程的残差标准差u A-3 () 1/2 2 11 3 2 kk jii ij A AA uS kn = = k为对被测样品的测量次数, n为拟合曲线的测量点 利用表中数据就得 uA-3(柠檬黄) =613.78 uA-3(日落黄)=1874.66 表 1 柠檬黄标准品测量结果 Table 1 The results of reference substance for citrine 标准系浓度 g/mL 峰面积 Aij 平均峰面积A 回归值 A 回归结果 0.9727 28144 29312 29058 28838 29101.78 2.918 88041 88847 89008 88632 88534.59 4.864 147162 147904 148296 147787 147988.78 a=30552 6.809 208031 207555 207983 207856 207412.42 b=-616.15 8.754 267280 266083 267985 267116 266836.06 r=1.0000 12.65 385031 385450 386037 385506 385866.65 表 2 日落黄标准品测量结果 Table 2 The results of reference substance for sunset yellow 标准系浓度g/mL 峰面积Aij 平均峰面积A 回归值 A 回归结果 3.015 85122 87133 86452 86236 87598.87 9.045 268867 270389 269451 269569 268004.41 15.08 446032 448153 452002 448729 448559.54 a=29918 21.11 629403 628214 631409 629675 628965.08 b=-2603.9 27.14 810121 808231 805975 808109 809370.62 r=1.0000 39.19 1169562 1171245 1170179 1170329 1170181.70 2212 食品安全质量检测学报 第 5 卷 得到u (柠檬黄) A= uA-1(柠檬黄)2+ uA-2(柠檬黄)2+ uA-3(柠檬黄)1/2= 636.29A u (日 落 黄) A= uA-1(日 落 黄)2+ uA-2(日 落 黄)2+ uA-3(日 落 黄)1/2= 1899.59A 3.2.6 斜率的标准不确定度ua () 1/2 ( ) 2 1 1 a n i us cici = = 计算可得ua(柠檬黄)=65.30 ua(日落黄)=64.35 3.2.7 截距的标准不确定度u(b) 计算可得ua(柠檬黄)=273.63 ub(日落黄)=838.89 3.2.8 分取比L的不确定度u(L) 由5.2.2项下计算可知100 mL容量瓶的标准不 确定度分量为0.068; 分取时所用20 mL移液管量取 溶液, 允差为0.03 mL, 由5.3.3项下移液管不确定 度计算公式可得u20=0.019 mL 分取比为: L=V20/V100 ( )()() 2 100 100 2 20 20 uuu + =V V L V V L L 代入数值得到u(L)=0.00013 3.3 被测溶液中柠檬黄、日落黄浓度测量准不 确定度 被测溶液中柠檬黄、 日落黄浓度测量准不确定度 按公式(3)计算得到 u(C)柠檬黄=0.012 g/mL u(C)日落黄=0.074 g/mL 3.4 被测样品溶液中柠檬黄、 日落黄含量不确 定度为 u( ) 由柠檬黄, 日落黄重复性测量结果表3, 表4可 知柠檬黄平均浓度为度0.418 g/mL, 日落黄为1.34 g/mL, 按公式(4)进行计算, 得到u柠檬黄()=0.078 mg/kg, u日落黄()=0.47 mg/kg。 3.5 结 果 95%置信概率下取包含因子k=2, 扩展不确定度 u柠檬黄=0.0782=0.16mg/kg, u日落黄=0.472=0.94mg/kg; 由柠檬黄, 日落黄重 复性测量结果表3, 表4可知柠檬黄平均含量为2.61 mg/kg, 日落黄平均含量为8.33 mg/kg 则有柠 檬 黄=2.610.16(mg/kg); 日 落 黄=8.330.94 (mg/kg) k=2。 表 3 柠檬黄 6 次测量的结果 Table 3 Citrine 6 times measurement results 编号 称样 量(g) 峰面积A 标准曲线上相应值 C(g/mL) 平均 值CX 含量C 含量均值C (mg/kg) 相对标准 偏差 自由度 1 4.01 12059 0.4149 2.588 2 4.00 12102 0.4163 2.600 3 4.00 12217 0.4200 0.418 2.625 2.61 0.7 5 4 4.00 12036 0.4141 2.587 5 4.01 12250 0.4211 2.629 6 4.01 12224 0.4203 2.623 表 4 日落黄 6 次测量的结果 Table 4 Sunset yellow 6 times measurement results 编号 称样量(g) 峰面积A 标准曲线上相应值C 平均 值CX 含量C 含量均值C (mg/kg) 相对标准 偏差 自由度 1 4.01 37308 1.334 8.317 2 4 36888 1.320 8.250 3 4.01 38040 1.359 1.34 8.470 8.33 1.0 5 4 4 37325 1.335 8.341 5 4.01 37027 1.325 8.258 6 4.01 37530 1.341 8.363 第 7 期 杨微微, 等: 高效液相色谱法测定面条中柠檬黄、日落黄含量的不确定度分析 2213 4 讨 论 用高效液相色谱法测定面条中合成色素柠檬黄、 日落黄的含量, 通过不确定度分量计算可知标准溶 液和样品溶液配制过程所用的仪器、玻璃器皿、实验 温度以及人员读数等都会导致不确定度的产生。 对于 许多像柠檬黄, 日落黄类微量的物质, 在检测的同时 附上不确定度具有十分重要的意义, 不仅使得实验 结果完整, 更重要的是得以保证数据的准确度及可 靠性。 计算不确定度时应通过不确定分量间的相关性 建立数学模型。 在实验过程中实验人员应严格注意可 能带来误差的各个方面并尽量避免。 参考文献 1 曾盈. 人工合成偶氮类色素胭脂红的食品检测和毒性研究D. 上海: 上海同济大学, 2004. 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