实验7小鼠骨髓细胞染色体标本的制备和观察.doc

遗传实验 实验7小鼠骨髓细胞染色体标本的制备和观察一、 实验目的了解利用动物骨髓进行细胞染色体制片的一般方法，掌握细胞收集、低渗、滴片等技术手段。观察和了解小鼠染色体的数目及形态特征。利用显微照相技术对所得切片进行照相。二、实验原理染色体上的基因决定了一个物种生长发育的全部信息。因此通过染色体分析，可以了解某一物种最基本的遗传指标。进行染色体标本的制备一般取自细胞分裂旺盛的组织，如骨髓、淋巴细胞以及通过人工培养的悬浮液。如将秋水仙素注射到动物的腹腔内，经肠系膜吸收并可转运到骨髓，结果使正在分裂的细胞不能形成纺锤体，使得染色体停在中期状态，经过处理和制片后就可以清楚地观察到染色体。这种制片方法是属于侵害性的，因此这种方法适用于动物来源丰富、动物个体较小的材料。对于大型动物可以采取骨髓穿刺术获得红骨髓，在临床上用于一些血液疾病的研究分析。对于一些珍稀的鸟类可采用羽髓来制片，方法基本一样。人类的染色体分析可采用外周血培养的方法来获得大量的细胞材料。三、 实验用具及材料实验材料：体重20克左右的小鼠一只实验试剂：0.075mKCl低渗液、固定液（甲醇：醋酸3:1）、0.4%秋水仙素、改良苯酚品红溶液、二甲苯 实验材料：恒温水浴槽、纱布、烧杯、离心管2支、刀片、镊子、解剖盘、解剖剪、镊子、注射器、离心机、镜头纸光学显微镜、带数码相机的光学显微镜四、 实验步骤1 腹腔注射秋水仙素溶液：在做实验前23小时，对实验用小鼠按0.1ml/20g小鼠的量对其进行0.4的秋水仙素注射。2 取材：实验时，用断颈法迅速将小鼠处死，通过解剖取出股骨，用注射器吸取在37下保温的低渗液2毫升，将针头插入骨髓腔中冲洗骨髓，使冲洗液从股骨的另一端流出。收集冲洗液到5ml刻度的离心管中。3 低渗：用吸管将冲洗液吹打几次，然后把离心管放在37恒温水浴槽内低渗20分钟。4 固定：之后取出并加1ml的固定液，吹打之后放入37恒温水浴槽内固定10分钟。5 离心：然后将1000rpm离心10分钟，弃去上清。6 再固定：加入固定液继续固定10分钟（先吹打，再放入恒温水浴槽）。7 离心：再1000rpm的速度离心10分钟。弃去上清，8 制备细胞悬液：离心结束弃上清，最后留大约与沉淀等量的上清液，9 滴冰片：从冰箱里取出预冷的载玻片4块并排，手持吸管在载玻片上方向下滴片。10 干燥：让其自然晾干。11 染色：用改良苯酚品红溶液染色10分钟左右。12 去浮色：清水冲洗，风干。13 镜检：先用低倍镜找到一好的分裂相区域，然后转用高倍镜观察。14 观察和照相：用油镜观察，并选取良好的视野照相。五、 结果与讨论1观察结果在考试的10分钟内拍摄了五张照片。我使用的是0号机，由于前面已经有人用过，所以没有太考虑图像设置的问题，结果拿到结果才发现，0号机的图片普遍偏小，放大就模糊了。在拍照的时候，其实是调节清楚了的。所以，选择同组另一个同学的图片进行分析，如下：图一：经秋水仙素处理的小鼠（Mus musculus）骨髓细胞染色体照片M10010倍（油镜，数码相机光学变焦）1） 染色体计数可以看到染色体形态很清楚，细胞膜已经破裂所以边缘不是圆形，第一张染色体有交叉和重叠，只能判断数目为391，第二张有些模糊，但染色体分得更开，仔细辨认可以看出是40条染色体。查资料得小鼠染色体数目为40，与结果相符。2） 照片质量。这是我从同组同学照片里挑出的一张，就制片而言，第一张杂质更多，特别是在要观察的细胞上有一点污渍，不是特别理想；第二张效果要好一些，染色体分得比较开便于计数，旁边的细胞虽然紧挨但是不影响计数和观察，视野里没有太多杂质，尤其是要观察的区域很干净。2. 实验讨论1）影响实验结果的重要步骤：（1）秋水仙素的注射 虽然这一步不是我们完成的，但是它对于本次实验至关重要，如果没有秋水仙素使正在分裂的细胞不能形成纺锤体，使得染色体停在中期状态，因为细胞分裂中期在整个分裂期中占的比例不大，我们就很难得到那么多分裂中期的细胞，也就难以观察。（2）取骨 取骨可参照人的大腿骨位置，而不是主观地判断其大小，取骨后一定要把肌肉除净，否则最后的制片效果会受到影响。（3）低渗 分析我们装片分散不够好的原因，我认为主要问题就出在低渗上。低渗液可以使细胞充分吸水膨胀而不破裂，从而一直保持在胀得很大而又没有破裂的状态。进而使得细胞内的中期染色体就能够足够分散开来，从而使得经固定等步骤后仍然处于膨胀状态。之后经过滴片时的摔打和骤降温过程，使细胞很快破碎，染色体进一步分散开。如果细胞低渗处理不够，在细胞从高处掉下也无法摔碎，染色体将难以观察。（4）滴片 经过实践，我们认为吴老师说得很对，越高越好，在我们可达到高度范围内，基本不用担心染色体摔碎的问题。比较了我们的片子和个子高的同学的片子，我们更加确信了这一结论。（我们都是站着往地上滴片的。）六、实验小结这次实验要注意的地方：1. 处死小鼠的时候要果断。这次实验采用断颈法杀死小鼠，按住头部后要用力拉。出于人道主义和对实验对象的尊重，我们都应该让小鼠在最少的折磨中死去。2. 取骨后要清理干净。3. 注射低渗液的时候要注意看，如果液体从针头入口出来，说明另一头没有剪开，应该再剪一次。4. 低渗液处理时间可以长一点。5. 第二次加固定液是1ml而不是书上写的5ml，实验结果，加1ml和加5ml区别不大，但从节约的角度，选取1ml。6. 滴片要高。7. 找到好的视野后要记住它的位置，方便显微摄像。七、思考题1. 显微照相见图一。2. 统计小鼠2N染色体数目，仔细观察其形态特征。小鼠体内2n染色体数目为40条，形态上多为中部着丝粒染色体。3. 低渗液起什么作用，在使用过程中应注意什么问题？答：低渗液的作用是使细胞充分吸水膨胀而不破裂，从而一直保持在胀得很大而又没有破裂的状态。进而使得细胞内的中期染色体就能够足够分散开来，从而使得经固定等步骤后仍然处于膨胀状态。之后经过滴片时的摔打和骤降温过程，使细胞及其核很快破